CN105466986A - 电化学生物传感器敏感膜的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种电化学生物传感器敏感膜的制备方法。该制备方法包括:将酸性的壳聚糖溶液与氯金酸溶液以预设比例混合,得到用于电沉积的混合溶液;将电化学生物传感器的电极浸入混合溶液中,采用一步式电沉积方法,在电极表面形成壳聚糖-纳米金复合物膜;以及将用于靶标物质检测的生物分子固定于壳聚糖-纳米金复合物膜上。本发明采用一步式电沉积方法,简化了壳聚糖-纳米金复合物膜制备步骤,干扰因素引入的概率降低,此外,混合溶液中的壳聚糖可有效避免纳米金在形成和沉积过程中的团聚,使纳米金保持约10nm的均一粒径并且均匀分散在壳聚糖疏松多孔结构的内部和表面,有利于提高抗体等生物分子的固定效率并保持其活性。
Description
技术领域
本发明涉及生物传感器技术领域,尤其涉及一种电化学生物传感器敏感膜的制备方法。
背景技术
在400多种不同的霉菌毒素中,黄曲霉毒素,尤其是黄曲霉毒素B1是毒性最强的一种霉菌毒素,具有严重的致癌性、致畸性和致突变性。黄曲霉毒素主要是黄曲霉和寄生曲霉的次级代谢产物,广泛存在于自然界中,能够在产前、产中、产后储存、运输、加工等多个环节污染多种农作物和食品,如花生、谷物、玉米等。长期摄入被黄曲霉毒素污染的食品,即使黄曲霉毒素浓度很低,由于其在体内累积,也会严重威胁到人们的健康。有研究表明,农作物受黄曲霉毒素污染严重的地区往往肝癌发病率也更高。因此,农作物和食品中的黄曲霉毒素含量的检测对于保障人们的身体健康具有非常重要的意义。
目前,检测黄曲霉毒素的方法主要有薄层色谱法、高效液相色谱法、液相色谱-串联质谱法和酶联免疫吸附法等。电化学生物传感器通常具有成本低、操作简单、设备便于微型化、易于实现移动检测等优势,是目前应用最广泛的一种生物传感器。
电化学生物传感器的工作电极表面一般修饰生物敏感材料,用于识别目标分析物。为了有效地固定抗体、酶等生物敏感材料,传感器工作电极表面需要修饰相应的活性基团且提供具有生物相容性的微环境。壳聚糖具有良好的成膜性和生物相容性,且无毒性,在生物大分子(如抗体、酶等)固定方面具有很多有益的特性。纳米金具有优良的电子传导能力和良好的生物相容性,并且具有比表面积大的优势。两者材料在电化学生物传感器方面具有广泛的应用,尤其是可为黄曲霉毒素抗体的固定提供适宜的微环境。
现有技术中制备电化学生物传感器敏感膜的方法如图1所示,包括:
步骤S1:使用柠檬酸还原氯金酸法制备纳米金溶液;
其中,在制备纳米金溶液的过程中,需要选择合适的温度和时间,并加入搅拌操作。
步骤S2:将壳聚糖粉末溶解在乙酸、盐酸等稀酸水溶液中,制备壳聚糖溶液;
步骤S3:将壳聚糖溶液与已经制备好的纳米金溶液混合;
步骤S4:将直径为2~4mm的金或玻碳电极浸入混合溶液中,采用计时电流法的电沉积方式将壳聚糖和纳米金修饰在工作电极表面,以提供氨基和纳米金;
一般情况下,计时电流法的电压设为-1.5V~-3V范围内的某个值,时间设定为200~300s中的某个值。
步骤S5:在已制备好的壳聚糖-纳米金复合物膜的表面固定酶等生物分子,如葡萄糖氧化酶、辣根过氧化物酶等,形成对特定目标物敏感的生物敏感膜。
然而,在不断的生产实践中,申请人发现,现有技术制备壳聚糖-纳米金复合物膜过程中,分离的两步增加了操作步骤和复杂性,过程中会引入较多的干扰因素,给最终得到的生物敏感膜的重复性、一致性和稳定性带来不利影响,此外,纳米金溶液在存储和使用过程中,由于外界条件(如pH值、温度和溶剂等)的改变可能会产生团聚,影响纳米金的性能,同样会给后续操作带来不利影响。
目前,业内亟待出现一种简单方便、重复和一致性好的电化学生物传感器敏感膜的方法。
发明内容
(一)要解决的技术问题
鉴于上述技术问题,本发明提供了一种电化学生物传感器敏感膜的制备方法,以简化操作步骤,提高敏感膜的一致性和稳定性。
(二)技术方案
本发明电化学生物传感器敏感膜的制备方法包括:步骤A:将pH值介于4~6之间的壳聚糖溶液与氯金酸溶液以预设比例混合,得到用于电沉积的混合溶液;步骤B:将电化学生物传感器的电极浸入混合溶液中,采用电沉积方法,在电极表面形成壳聚糖-纳米金复合物膜;以及步骤C:将用于靶标物质检测的生物分子固定于壳聚糖-纳米金复合物膜上。
(三)有益效果
从上述技术方案可以看出,本发明电化学生物传感器敏感膜的制备方法具有以下有益效果:
(1)采用一步式电沉积方法,简化了壳聚糖-纳米金复合物膜制备步骤,干扰因素引入的概率降低,有利于提高最终生物敏感膜的一致性和稳定性;
(2)壳聚糖分子结构中的氨基在酸性溶液中被质子化,使得壳聚糖分子成为溶于水的阳离子聚电解质,表面带正电荷的壳聚糖分子能够吸附在从氯金酸中还原出的表面带负电荷的金单质表面,可有效避免纳米金的团聚,使纳米金保持约10nm的均一粒径并且均匀分散在壳聚糖疏松多孔结构的内部和表面,有利于提高抗体等生物分子的固定效率并保持其活性;
(3)通过对重要参数如沉积电位和沉积时间(或圈数)的准确设置,可控制壳聚糖-纳米金复合物膜表面的微观结构,使壳聚糖-纳米金复合物膜的制备具有过程可控的优势,最终制备的生物敏感膜具有良好的重复性和一致性。
附图说明
图1为现有技术制备壳聚糖-纳米金复合物膜的方法的流程图;
图2为根据本发明实施例用于检测黄曲霉毒素的电化学生物传感器敏感膜的制备方法的流程图;
图3A和图3B分别为裸金电极和采用本发明实施例1的方法制备的壳聚糖-纳米金复合物膜的表面形貌图;
图4A和图4B为实施例1制备的电化学生物传感器的电流响应与黄曲霉毒素浓度的分段线性曲线;
图5为采用本发明实施例2的方法制备的壳聚糖-纳米金复合物膜的表面形貌图。
具体实施方式
申请人经研究发现,壳聚糖分子结构中含有大量的氨基,当pH值小于6.3时,大多数氨基被质子化,使得壳聚糖成为溶于水的阳离子聚电解质。表面带正电荷的壳聚糖分子能够吸附在从氯金酸中还原出的表面带负电荷的金单质表面,从而抑制纳米金的生长,阻止纳米金的团聚。利用上述理论,本发明提供了一种电化学生物传感器敏感膜的制备方法。
在本发明的一个示例性实施例中,提供了一种用于黄曲霉毒素检测的电化学生物传感器敏感膜的制备方法。请参照图2,本实施例用于检测黄曲霉毒素的电化学生物传感器敏感膜的制备方法包括:
步骤A:将pH值介于4~6之间的壳聚糖溶液与氯金酸溶液以预设比例混合,得到用于电沉积的混合溶液;
其中,壳聚糖溶液的制备是将壳聚糖粉末溶解于乙酸水溶液中,过滤不溶物后得到壳聚糖溶液,而后将其pH值调至4~6之间。氯金酸溶液的制备是将氯金酸粉末溶解于去离子水中,而后将其pH值调至4~6之间,得到氯金酸水溶液。所述用于电沉积的混合溶液中壳聚糖的质量体积百分比浓度介于0.05%~0.1%之间,氯金酸的质量体积百分比浓度介于0.03%~0.06%之间。
步骤B:将洁净后的电化学生物传感器的金微电极浸入混合溶液中,采用一步式电沉积方法在金微电极表面形成壳聚糖-纳米金复合物膜;
本发明优选的实施例中,电化学生物传感器采用三电极系统,集成于同一电极芯片上的工作电极和对电极均为基于磁控溅射技术制备的金微电极,其中工作电极的面积范围为10-4~1mm2。参比电极采用Ag/AgCl电极。微电极的使用也可加速电极表面的传质,减少试剂的使用量,降低检测成本。同时,在微电极上制备的壳聚糖-纳米金复合物膜的均匀性也较普通电极好。
在沉积过程中,壳聚糖可提供大量的氨基功能团,便于通过共价交联的方法进一步固定生物分子。同时,在纳米金的形成过程中,壳聚糖可以作为稳定剂有效抑制纳米金的团聚。这是因为壳聚糖分子结构中含有大量的氨基,当pH值小于6.3时,大多数氨基被质子化,使得壳聚糖成为溶于水的阳离子聚电解质。表面带正电荷的壳聚糖分子能够吸附在从氯金酸中还原出的表面带负电荷的金单质表面,从而抑制纳米金的生长,使纳米金保持均一粒径,并且有效阻止纳米金的团聚。均匀分散的纳米金可以增大金微电极的比表面积,提供更多活性位点,促进电子到电极表面的传递。
在进行沉积时,室温下,采用计时电流法在-1.1V沉积300s,或者采用循环伏安法在0~-1.5V范围内扫描10圈。采用计时电流法或循环伏安法,具有过程可控的优势,通过对重要参数如沉积电位和沉积时间(或圈数)的准确设置,可以控制膜表面的微观结构,制备的膜重复性和一致性好,性能稳定。
采用本步骤制备的壳聚糖-纳米金复合物膜具有重复性和一致性好,稳定性强的优势,可用于抗体等生物分子的固定。
步骤C:固定黄曲霉毒素抗体。
该步骤C具体而言:用EDC/HNS活化黄曲霉毒素抗体的羧基,然后将抗体滴加在修饰电极表面,抗体以共价交联的方式固定在壳聚糖-纳米金复合物膜表面。
实验证明,采用本发明方法制备的壳聚糖-纳米金复合物膜,其电流响应比单独沉积壳聚糖或纳米金具有更好的一致性和稳定性。此外,壳聚糖-纳米金复合物膜良好的生物相容性可增强黄曲霉毒素抗体的有效固定,并有利于保持抗体活性。
需要说明的是,采用本发明方法制备的壳聚糖-纳米金复合物膜具有一定的普适性,鉴于抗体及酶等生物分子结构上均具有一定数量的羧基结合位点,所以该壳聚糖-纳米金复合物膜适合固定抗体、酶等生物分子,可用于不同靶标物质的检测,而不局限于固定黄曲霉毒素抗体,用于黄曲霉毒素的检测。
下面通过具体实施例对本发明做进一步说明,但实施例不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明,本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
实施例1
将0.5g壳聚糖溶于100mL0.1M的乙酸溶液中,室温下水浴超声3h后过滤得到0.5%壳聚糖溶液,用1MNaOH调节pH至5。壳聚糖溶液与相同pH值的氯金酸溶液混合得到沉积液,沉积液中壳聚糖和氯金酸的质量体积百分比浓度分别为0.1%和0.06%。
将金微电极用氧等离子体刻蚀机清洁,然后浸入0.5M稀硫酸中,在0~1.5V进行循环伏安扫描直至特征曲线稳定重合。用去离子水清洗电极,吹干,得到洁净的金微电极,再将电极浸入沉积液中,采用计时电流法在-1.1V下沉积300s,去离子水清洗电极,室温下自然干燥,制得壳聚糖-纳米金复合物膜。用EDC∶NHS摩尔比4∶1的混合溶液活化黄曲霉毒素B1单克隆抗体的羧基,滴加在壳聚糖-纳米金复合物膜修饰的电极表面,4℃温育3h,PBS溶液清洗,滴加5mg/mL的牛血清蛋白,4℃温育1h,PBS清洗,浸泡在PBS溶液中4℃保存,用于检测黄曲霉毒素。
扫描电子显微镜(SEM)下的裸金电极和采用本实施例方法制备的壳聚糖-纳米金修饰膜的表面形貌图分别见图3A和图3B。可见,相比图3A所示的裸金电极的表面形貌,壳聚糖-纳米金复合物膜(图3B)呈疏松多孔结构,粒径均一(约10nm)的纳米金均匀分散在膜的内部和表面,说明壳聚糖-纳米金已经成功修饰在金微电极表面。
电化学生物传感器的响应电流与黄曲霉毒素B1浓度的分段线性标准曲线见图4A和图4B,说明制备的电化学生物传感器在0.1~1μg/kg和1~20μg/kg的浓度范围内呈现良好的分段线性。其中,图4A所示的线性范围为0.1~1μg/kg,线性拟合公式为y=1.4611-0.4851x,相关系数为0.9750;图4B所示的线性范围为1~20μg/kg,线性拟合公式为y=0.9762-0.0239x,相关系数为0.9576。图中,y为响应电流(μA),x为黄曲霉毒素B1的浓度(μg/kg)。
实施例2
将0.5g壳聚糖溶于100mL0.1M的乙酸溶液中,室温下水浴超声3h后过滤得到0.5%壳聚糖溶液,用1MNaOH调节pH至5。壳聚糖溶液与相同pH值的氯金酸溶液混合得到沉积液,沉积液中壳聚糖和氯金酸的质量体积百分比浓度分别为0.1%和0.045%。
将金电极用氧等离子体刻蚀机清洁,然后浸入0.5M稀硫酸中,在0~1.5V进行循环伏安扫描直至特征曲线稳定重合。用去离子水清洗电极,吹干,得到洁净的金微电极,再将电极浸入沉积液中,采用循环伏安法在0~-1.5V范围内扫描10圈,去离子水清洗电极,室温下自然干燥,制得壳聚糖-纳米金复合物膜。
利用本实施例方法制备的壳聚糖-纳米金复合物膜在扫描电子显微镜下的表面形貌图见图5。
至此,已经结合实施例对本发明进行了详细描述。依据以上描述,本领域技术人员应当对本发明壳聚糖-纳米金复合物膜及在其上固定黄曲霉毒素抗体形成用于黄曲霉毒素检测的生物敏感膜的制备方法有了清楚的认识。
需要说明的是,在附图或说明书正文中,未绘示或描述的实现方式,均为所属技术领域中普通技术人员所知的形式,并未进行详细说明。此外,上述对各元件和方法的定义并不仅限于实施例中提到的各种具体结构、形状或方式,本领域普通技术人员可对其进行简单地更改或替换,例如:
(1)电沉积方法可以用计时电位法的形式;
(2)集成在同一电极芯片上的对电极可以用分离的普通棒状金电极或铂电极来代替;
(3)乙酸水溶液可以用盐酸水溶液来代替;
(4)本文可提供包含特定值的参数的示范,但这些参数无需确切等于相应的值,而是可在可接受的误差容限或设计约束内近似于相应值;
(5)上述实施例可基于设计及可靠度的考虑,彼此混合搭配使用或与其他实施例混合搭配使用,即不同实施例中的技术特征可以自由组合形成更多的实施例。
综上所述,本发明以壳聚糖和氯金酸混合溶液为沉积溶液,在金微电极表面一步式电沉积制备壳聚糖-纳米金复合物膜,得到粒径均一的纳米金均匀分散在膜的内部和表面,实验证明壳聚糖-纳米金复合物膜可以为抗体等生物分子的固定提供相容性好且性能稳定的基底,适用于食品安全中黄曲霉毒素的检测以及生物传感器产业化的实际应用,具有较好的应用前景。
以上所述的具体实施例,对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明,所应理解的是,以上所述仅为本发明的具体实施例而已,并不用于限制本发明,凡在本发明的精神和原则之内,所做的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (8)
1.一种电化学生物传感器敏感膜的制备方法,其特征在于,包括:
步骤A:将pH值介于4~6之间的壳聚糖溶液与氯金酸溶液以预设比例混合,得到用于电沉积的混合溶液;
步骤B:将电化学生物传感器的电极浸入混合溶液中,采用电沉积方法,在电极表面形成壳聚糖-纳米金复合物膜;以及
步骤C:将用于靶标物质检测的生物分子固定于所述壳聚糖-纳米金复合物膜上。
2.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,所述步骤A中,所述混合溶液中,壳聚糖的质量体积百分比浓度介于0.05%~0.1%之间,氯金酸的质量体积百分比浓度介于0.03%~0.06%之间。
3.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,所述步骤A之前还包括:
将壳聚糖粉末溶解于乙酸水溶液中,过滤不溶物后得到壳聚糖溶液;
将氯金酸粉末溶解于去离子水中,得到氯金酸水溶液。
4.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,所述步骤B中,电沉积方法为计时电流法或循环伏安法。
5.根据权利要求4所述的制备方法,其特征在于:
当采用计时电流法时,温度为室温,其在-1.1V沉积300s,从而得到壳聚糖-纳米金复合物膜;或者
当采用循环伏安法时,温度为室温,其在0~-1.5V范围内扫描10圈,从而得到壳聚糖-纳米金复合物膜。
6.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,所述步骤B中,所述电极为微电极,该微电极的面积范围为10-4~1mm2。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的制备方法,其特征在于,所述步骤C中,用于靶标物质检测的生物分子为抗体、抗原或酶。
8.根据权利要求7所述的制备方法,其特征在于,所述用于靶标物质检测的生物分子为黄曲霉毒素抗体;
所述步骤C包括:用EDC/HNS活化黄曲霉毒素抗体的羧基,然后将抗体滴加在修饰电极表面,抗体以共价交联的方式固定在壳聚糖-纳米金复合物膜表面。
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C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20160406 |
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WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |