CN1908629A - 血清中肌酸激酶的化学发光测定方法 - Google Patents

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高淑舫
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Abstract

本发明血清中肌酸激酶的化学发光测定方法，涉及一种在生化分析中医用试剂的化学发光测定方法。它所要解决的是现有检测范围窄、灵敏度低、操作烦琐、准确性低等技术问题。解决该技术问题的主要技术方案：血清中肌酸激酶的化学发光测定方法，其特征在于利用肌酸激酶催化磷酸肌酸与二磷酸腺苷反应生成三磷酸腺苷与肌酸；再用甘油激酶催化三磷酸腺苷及甘油生成3－磷酸甘油；后者被磷酸甘油氧化酶氧化，并产生过氧化氢；再经过氧化物酶作用，过氧化氢使化学发光物氧化而发光；肌酸激酶浓度越大发出的光信号越强；用已知浓度的肌酸激酶与测出的光信号，作出剂量－反应曲线；未知样品的肌酸激酶含量可从该曲线推算出来。它适于各类医疗机构广泛应用。

Description

血清中肌酸激酶的化学发光测定方法
技术领域：本发明涉及一种医用试剂检测方法，特别涉及血清中肌酸激酶的化学发光测定方法。
背景技术：利用现代生物技术所开发的超微量测定方法，极大的推动了生物和医学各领域的各项临床和科研工作的快速发展，为人类的科学事业和社会进步作出了非凡的贡献。
上世纪七十年代由Arakawa首先发表了应用鲁米诺——过氧化物酶的化学发光反应进行酶免分析的技术，这一技术由于灵敏度高达10-18mol，可在20分钟内快速测定出结果，可简便实现完全自动化，有效期长达一年以上，无放射性和致畸物质，利于环保而受到普遍欢迎，是目前发展最迅速的检测技术。
目前，化学发光技术在免疫分析中已得到相当普及的程度，已发展为能检测多种生物活性物质的常规监床检测方法，从免疫反应方式分，该方法有两种基本类型，即化学发光免疫分析(CLIA)和免疫化学发光分析(ICMA)；从发光方式上看，一是将发光物质直接标记到抗体或抗原上，免疫反应后，在起动剂的作用下而发光，另一种是用酶标记抗体或抗原，免疫反应后，加入化学发光底物，在酶催作用下而发光。
该方法虽有突出的优点，但目前仅限于免疫分析，而在生化分析中还是空白。
肌酸激酶(CK)主要存在于骨骼肌和心肌，在脑组织中也有存在。下列情况可使CK活性增高：急性心肌梗塞后2～4小时开始增高，可高达正常上限的10～12倍，2～4天恢复正常。测定CK对心肌梗塞的诊断优于AST、LD等；病毒性心肌炎明显升高，对其诊断和预后有参考价值；脑血管意外、脑膜炎、甲状腺功能低下患者；剧烈运动、各种插管和手术、肌肉注射冬眠灵和抗生素等。
现在普遍使用的测定血清中肌酸激酶的方法为比色法，该法是利用CK催化磷酸肌酸(CrP)与二磷酸腺苷(ADP)反应生成三磷酸腺苷(ATP)与肌酸(Cr)，己糖激酶(HK)催化葡萄糖与ATP反应，形成葡萄糖-6-磷酸，葡萄糖-6-磷酸脱氢酶催化葡萄糖-6-磷酸氧化，形成6-磷酸葡萄糖内酯及NADPH，NADPH生成的速率代表CK活力。该法的不足之处主要有：
1、线性范围窄。由于检测光吸收，其分辨率不像化学发光那么敏感，线性范围不能完全满足临床检测的需要，对高浓度的样品需要经稀释后测定，带来一定不便。
2、灵敏度不如化学发光。化学发光是测定光信号，灵敏度要比测光吸收高出许多。
3、试剂成份复杂，操作烦琐，容易造成误差，影响测定结果的准确性。
发明内容：本发明所要解决的技术问题是一种提供能克服上述缺陷、且灵敏度高、线性范围宽、方便、安全的血清中肌酸激酶的化学发光测定方法。解决该技术问题采用的主要技术方案：血清中肌酸激酶的化学发光测定方法，其特征在于利用CK催化磷酸肌酸(CrP)与二磷酸腺苷(ADP)反应生成三磷酸腺苷(ATP)与肌酸(Cr)；再用甘油激酶(GK)催化三磷酸腺苷(ATP)及甘油生成3-磷酸甘油(G-3-P)；3-磷酸甘油(G-3-P)被磷酸甘油氧化酶(GPO)氧化，并产生过氧化氢；再经过氧化物酶作用，过氧化氢使化学发光物氧化而发光；光信号的大小与肌酸激酶的浓度呈正相关，即肌酸激酶浓度越大发出的光信号越强；记录这种光信号即可推测肌酸激酶的浓度；用已知浓度的肌酸激酶与测出的光信号，作出剂量-反应曲线；未知样品的肌酸激酶含量可从该曲线推算出来；所述的化学发光物为鲁米诺。本发明与现有技术相比有如下优点：用化学发光物代替显色物，达到更灵敏、更稳定、范围宽、更安全的目的。用该方法可以制备相应的定量测定血清中肌酸激酶的商品试剂盒。具体优点是：①灵敏度更高。传统方法是检测颜色深浅，而化学发光是测光信号，可一个一个光子计数，所测的最低限更小，因而灵敏度更高。②线性范围宽。测颜色的深浅的分辨率比光子计数的精度要低得多，化学发光的检测范围高达105。③安全适用。化学发光物如鲁米诺等很安全，整个检测过程无有害物出现，无论是检测或处理废物都很安全，有利于环境保护。④便于普及。本发明所制备的试剂盒，可用于全自动测量，也可用于手工或半自动测量，适宜大、中、小各层次的医疗和研究机构使用。⑤巨大的社会效益。用化学发光法测定生化指标或免疫物质，可同用一台化学发光仪，不再需要进口昂贵的生化仪，节省大量资金，不只降低了成本，对医疗机构、患者及社会均大有益处。
具体实施方式：现举例说明本发明的实施例。利用CK催化磷酸肌酸(CrP)与二磷酸腺苷(ADP)反应生成三磷酸腺苷(ATP)与肌酸(Cr)；再用甘油激酶(GK)催化三磷酸腺苷(ATP)及甘油生成3-磷酸甘油(G-3-P)；3-磷酸甘油(G-3-P)被磷酸甘油氧化酶(GPO)氧化，并产生过氧化氢；再经过氧化物酶作用，过氧化氢使化学发光物氧化而发光；光信号的大小与肌酸激酶的浓度呈正相关，即肌酸激酶浓度越大发出的光信号越强；记录这种光信号即可推测肌酸激酶的浓度；用已知浓度的肌酸激酶与测出的光信号，作出剂量-反应曲线；未知样品的肌酸激酶含量可从该曲线推算出来；所述的化学发光物为鲁米诺；这便是本发明的体外血清中肌酸激酶的化学发光测定方法。本发明的反应原理用式子表示如下：
一、试剂包括：
混合酶液；
肌酸激酶(或替代品)标准：单一或系列浓度；
底物液
二、测定程序：
按下表进行，加样单位为μl。
  标准   样品
  标准   10
  样品   10
  酶液   100   100
  底物液   50   50
    混匀，室温或37℃温育后测量RLU
三、用适当方法处理作出剂量-反应曲线，根据样品的RLU值从该曲线求出其血清肌酸激酶的浓度。或直接由公式求出：
肌酸激酶浓度＝(样品RLU/标准RLU)×标准浓度
四、也可用双试剂测定。
本发明的灵敏度更高：因为传统方法是检测颜色深浅，而本发明是测光信号，可一个一个光子计数，所测的最低限更小，因而灵敏度更高。线性范围宽：这是因为传统的测颜色的深浅的分辨率比光子计数的精度要低得多，本发明的化学发光检测范围高达105。安全适用：本发明的化学发光物如鲁米诺等很安全，整个检测过程无有害物出现，无论是检测或处理废物都很安全，有利于环境保护。便于普及：本发明所制备的试剂盒，可用于全自动测量，也可用于手工或半自动测量，适宜大、中、小各层次的医疗和研究机构使用。社会效益巨大：用本发明的化学发光测定方法测定生化指标或免疫物质，可同用一台化学发光仪，不再需要进口昂贵的生化仪，节省大量资金，不只降低了成本，对医疗机构、患者及社会均大有益处。本发明方法简单，适于大、中、小医疗机构广泛推广应用。

Claims (2)

1、血清中肌酸激酶的化学发光测定方法，其特征在于利用CK催化磷酸肌酸(CrP)与二磷酸腺苷(ADP)反应生成三磷酸腺苷(ATP)与肌酸(Cr)；再用甘油激酶(GK)催化三磷酸腺苷(ATP)及甘油生成3-磷酸甘油(G-3-P)；3-磷酸甘油(G-3-P)被磷酸甘油氧化酶(GPO)氧化，并产生过氧化氢；再经过氧化物酶作用，过氧化氢使化学发光物氧化而发光；光信号的大小与肌酸激酶的浓度呈正相关，即肌酸激酶浓度越大发出的光信号越强；记录这种光信号即可推测肌酸激酶的浓度；用已知浓度的肌酸激酶与测出的光信号，作出剂量-反应曲线；未知样品的肌酸激酶含量可从该曲线推算出来。
2、根据权利要求1所述的血清中肌酸激酶的化学发光测定方法，其特征在于所述的化学发光物为鲁米诺。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN103472052A (zh) * 2013-07-02 2013-12-25 南昌大学 一种多功能纳米探针GOx/Au NPs/DNA的制备方法及其激酶检测应用

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