CN109735548A - Ev71单链dna适配体及利用双适配体检测肠道病毒71型的化学发光检测试剂盒 - Google Patents
Ev71单链dna适配体及利用双适配体检测肠道病毒71型的化学发光检测试剂盒 Download PDFInfo
- Publication number
- CN109735548A CN109735548A CN201910227016.9A CN201910227016A CN109735548A CN 109735548 A CN109735548 A CN 109735548A CN 201910227016 A CN201910227016 A CN 201910227016A CN 109735548 A CN109735548 A CN 109735548A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- aptamers
- detection
- sequence
- kit
- seq
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 108091023037 Aptamer Proteins 0.000 title claims abstract description 88
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 title claims abstract description 18
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 title claims abstract description 12
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 title claims abstract description 11
- 238000002038 chemiluminescence detection Methods 0.000 title abstract description 4
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims abstract description 53
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims abstract description 35
- 239000011324 bead Substances 0.000 claims abstract description 29
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims abstract description 23
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims abstract description 16
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims abstract description 15
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims abstract description 11
- 230000008878 coupling Effects 0.000 claims abstract description 6
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 claims abstract description 6
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 claims abstract description 6
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims abstract description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims abstract description 3
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 16
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 12
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 claims description 8
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 claims description 7
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 claims description 7
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 claims description 7
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 6
- 238000004020 luminiscence type Methods 0.000 claims description 5
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 claims description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 3
- 229960002163 hydrogen peroxide Drugs 0.000 claims description 3
- 239000003446 ligand Substances 0.000 claims description 3
- HWYHZTIRURJOHG-UHFFFAOYSA-N luminol Chemical compound O=C1NNC(=O)C2=C1C(N)=CC=C2 HWYHZTIRURJOHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 238000000034 method Methods 0.000 abstract description 25
- 208000020061 Hand, Foot and Mouth Disease Diseases 0.000 abstract description 9
- 208000025713 Hand-foot-and-mouth disease Diseases 0.000 abstract description 8
- 230000008569 process Effects 0.000 abstract description 5
- 208000002352 blister Diseases 0.000 abstract description 4
- 210000000436 anus Anatomy 0.000 abstract description 2
- 210000001175 cerebrospinal fluid Anatomy 0.000 abstract 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 13
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 11
- 239000000047 product Substances 0.000 description 9
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 description 8
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 7
- 238000000504 luminescence detection Methods 0.000 description 7
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 7
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 6
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 6
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 6
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 6
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 5
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 5
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 4
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 4
- 239000012148 binding buffer Substances 0.000 description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 4
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 4
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 4
- 241001429382 Coxsackievirus A16 Species 0.000 description 3
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 3
- 241000709661 Enterovirus Species 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 150000002460 imidazoles Chemical class 0.000 description 3
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- PXFBZOLANLWPMH-UHFFFAOYSA-N 16-Epiaffinine Natural products C1C(C2=CC=CC=C2N2)=C2C(=O)CC2C(=CC)CN(C)C1C2CO PXFBZOLANLWPMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 2
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 230000004087 circulation Effects 0.000 description 2
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 2
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 210000000214 mouth Anatomy 0.000 description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 2
- 238000007781 pre-processing Methods 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QCVGEOXPDFCNHA-UHFFFAOYSA-N 5,5-dimethyl-2,4-dioxo-1,3-oxazolidine-3-carboxamide Chemical compound CC1(C)OC(=O)N(C(N)=O)C1=O QCVGEOXPDFCNHA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 208000031504 Asymptomatic Infections Diseases 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- 102000002322 Egg Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010000912 Egg Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000701959 Escherichia virus Lambda Species 0.000 description 1
- 208000007212 Foot-and-Mouth Disease Diseases 0.000 description 1
- 241000710198 Foot-and-mouth disease virus Species 0.000 description 1
- 208000009525 Myocarditis Diseases 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 206010037423 Pulmonary oedema Diseases 0.000 description 1
- 206010037660 Pyrexia Diseases 0.000 description 1
- 208000025865 Ulcer Diseases 0.000 description 1
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 238000005034 decoration Methods 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 1
- 239000012154 double-distilled water Substances 0.000 description 1
- 235000014103 egg white Nutrition 0.000 description 1
- 210000000969 egg white Anatomy 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 206010014599 encephalitis Diseases 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 230000002550 fecal effect Effects 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 239000006210 lotion Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 201000011475 meningoencephalitis Diseases 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 210000002200 mouth mucosa Anatomy 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 108091008104 nucleic acid aptamers Proteins 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 208000005333 pulmonary edema Diseases 0.000 description 1
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 1
- 230000003252 repetitive effect Effects 0.000 description 1
- 210000002345 respiratory system Anatomy 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 238000011895 specific detection Methods 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- 231100000397 ulcer Toxicity 0.000 description 1
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 1
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本专利涉及一种EV71单链DNA适配体及利用双适配体检测肠道病毒71型的化学发光检测试剂盒。所述适配体是序列如SEQ ID NO.1的适配体V11、序列如SEQ ID NO.2适配体V21，以及序列如SEQ ID NO.3适配体V7。本发明试剂盒，是以适配体V21为捕获探针，以适配体V11为信号探针。具体包括：捕获探针偶联的免疫磁珠、分析缓冲液、信号探针偶联的酶结合物、SA‑HRP溶液、发光底物液。本试剂盒对EV71的检测有高度的特异性；能从疑似手足口病患者的脑脊液、疱疹液、咽拭子和肛拭子等标本中定性检测EV71；利用本发明试剂盒检测操作简单快速，检测过程仅需45分钟左右。
Description
技术领域
本发明涉及针对EV71的单链DNA适配体，以及利用双适配体检测肠道病毒71型(EV71)的化学发光试剂盒及其应用，适用于EV71病毒定性检测。
背景技术
手足口病(Hand，foot and mouth disease,HFMD)是由肠道病毒引起的传染病，近年来各地均有散在发生。该病常见于学龄前儿童，婴幼儿多见，可引起发热和手、足、口腔等部位的皮疹、溃疡，一般预后良好，个别患者可引起心肌炎、肺水肿、无菌性脑膜脑炎等并发症。手足口病的传染源为病人和隐性感染者，主要是通过密切接触感染者的粪便、口腔分泌物、皮肤疱疹液中的病毒，经粪－口途径或呼吸道(主要是口腔粘膜和鼻腔粘膜)传播。肠道病毒71型是引起手足口病的最主要病原体之一，且引发重症感染的比例较大，病死率也较高。因此，对可引起重症手足口病的对于疾病的控制和治疗非常重要。现EV71的检测主要是荧光定量PCR技术，其操作较繁琐，且费用昂贵，亟待有更好的检测方法。
核酸适配体是一段经体外筛选得到的寡核苷酸序列,能与相应的配体进行高亲和力和强特异性的结合，利用适配体技术建立检测方法具有极大的应用价值。但是，至今还没有基于适配体技术检测EV71的相关报道。
本发明以磁珠为载体使用两条不同的适配体分别用于捕获EV71和信号转换构建了磁珠-适配体1-EV71-适配体2-辣根过氧化物酶的三明治结构的适配体生物传感器，经过筛选得到的适配体能特异性的结合样本中的EV71病毒，无需对样本提取核酸或做预处理，通过发光值，直接得到对样本的定性检测结果。
发明内容
本发明的目的是提供一种EV71的核酸适配体及筛选方法及适配体技术的检测EV71的化学发光试剂盒。本发明是利用SELEX技术筛选出能够与EV71结构结构蛋白特异性和高亲和力结合的单链DNA核酸适配体序列，并利用得到的核酸适配体构建能够对EV71进行高灵敏和高特异性检测的化学发光试剂盒。该试剂盒能快速准确的对待测样品中的EV71进行定性检测。该方法可用全自动化学发光仪完成检测，检测时长约45分钟。
一种EV71单链DNA双适配体，其特征在于，所述双适配体是序列如SEQ ID NO.1的适配体V11、序列如SEQ ID NO.2的适配体V21、或序列如SEQ ID NO.3的适配体V7。
本发明提供了一种EV71的单链DNA适配体的筛选及选择及应用其化学发光检测方法。包括以下步骤：步骤一：利用EV71结构蛋白来筛选EV71的单链DNA适配体；步骤二：对筛选得到的核酸序列进行TA克隆和测序；步骤三：对筛选得到的适配体进行亲和性和特异性检测；步骤四：利用亲和性最高的两条适配体构建两种双适配体的化学法光EV71检测方法，进行比较。步骤五：选择较优的双适配体化学发光EV71检测方法用于设计EV71化学发光定性试剂盒。
本发明经SELEX技术筛选，得到的适配体序列分别为，
V11(SEQ ID NO.1):
5’-actaagccaccgtgtccacccUcgccgagUUUUcgUaacUaUaUcUUgUggUUccUaUUgcUgcgUcacUcUggaU-3’；
V21(SEQ ID NO.2):5’-
actaagccaccgtgtccaUUcgaUUcgaUcUaaUUUggUUcUUUccUcacUUUUcagUgcUgcgUcacUcUggaU-3’。
V7(SEQ ID NO.3):5’-
ctaagccaccgtgtccaUcaaUggUgUgUgcaUUcgUgUgUUgUgUUgUUUgUUgUUUgcUgcgUcacUcUggaU-3’；
通过ELISA对得到的三条适配体(V7、V11、V21)进行亲和性测试，分别为32.72nM、4.28nM、4.55nM。故选择对EV71结构蛋白亲和性更高的V11及V21用于设计EV71的双适配体化学发光检测方法。分别构建以V21为捕获探针，V11为信号探针及V11为捕获探针，V21为信号探针的EV71的双适配体化学发光检测方法，发现以V21为捕获探针，V11为信号探针的EV71检测方法具有更高的信噪比，故采用V21为捕获探针，V11为信号探针来构建EV71的化学发光定性试剂盒。
本发明所说的检测EV71的化学发光定性试剂盒，其适配体1(捕获探针)为适配体V21，适配体2(信号探针)为适配体V11。
具体地，一种双适配体检测EV71的化学发光试剂盒，包括：(1)捕获探针偶联的免疫磁珠；(2)分析缓冲液；(3)信号探针偶联的酶结合物；(4)SA-HRP溶液；(5)发光底物液。
各成分具体是：
(1)捕获探针偶联的免疫磁珠:表面固定有适配体V21的免疫磁珠，用于捕获样本中的EV71病毒；
(2)分析缓冲液：1xPBS，5mM MgCl2，0.02％tween-20；
(3)信号探针溶液：1xPBS，500nM适配体V11，5mM MgCl2，1％BSA，1μg/ml tRNA，0.02％tween-20，
(4)SA-HRP溶液：SA-HRP：分析缓冲液1:1000；
(5)发光底物液：辣根过氧化物酶作用的发光底物液，包括鲁米诺和过氧化氢溶液。
利用本发明的化学发光EV71试剂盒检测样本中的EV71，可以快速的得到样品中EV71的大致含量，对指导疾病控制人员的相关卫生防疫工作，帮助临床医生更好的掌握对EV71感染手足口病的治疗、预后和转归有重要意义。
本发明的有益效果主要体现在：(1)本发明中筛选得到的适配体均对EV71结构蛋白具有高度的亲和性(解离常数Kd分别在nM范围)。(2)本试剂盒对EV71的检测有高度的特异性，与其他肠道病毒无明显交叉反应；检测的灵敏度达103拷贝数，可直接从疑似手足口病患者的脑脊、疱疹液、咽拭子和肛拭子等标本中检测EV71结构；利用本发明试剂盒检测操作简单快速，检测过程仅需45分钟左右，且该试剂盒的检测过程可以通过自动化仪器实现。
附图说明
图1是适配体筛选过程中的测序结果
图2是适配体V7的亲和力结果
图3是适配体V11的亲和力结果
图4是适配体V21的亲和力结果
图5是适配体V7、V11、V21的特异性结果
图6是适配体化学发光检测方法原理示意图
图7是捕获探针及信号探针选择的实验结果
具体实施方式
下面结合具体实施例,进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明要求保护的范围，下列实施例中未注明具体实验条件和方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1：
EV71适配体的筛选：
1)主要试剂：
Binding Buffer：1*PBS，5mM MgCl2，1％BSA，1μg/ml tRNA，0.02％tween-20，5mM咪唑Washing Buffer：1*PBS，5mM MgCl2，0.02％tween-20
表1筛选库和引物序列
2)第一轮SELEX
a.library加水溶解至终浓度20μM。
b.配置延伸体系
延伸程序如下：95℃60s，58℃60s，72℃60min
c.产物加入SA agarose bead室温孵育10min，洗去未结合序列。
d.加入150mM NaOH室温孵育5min，吸取上清，加入300mM HCl中和。
e.以水为对照，Nanodrop测定修饰单链DNA浓度。
f.95℃变性5min，冰浴后加入Binding Buffer至1ml，室温静置5min。
g.加入肠道病毒71型结构蛋白(简写EV)50pmol，室温孵育30min。
h.加入His-Mag磁珠50s-，室温孵育30min。
i.磁分离，Washing Buffer洗涤磁珠三次，每次1ml。最后一次洗涤后尽量吸干管中液体。
j.加入500mM咪唑500m，静置5min。取出上清液体。
k.预扩增10个循环，扩增产物合并收集至一个干净的EP管中。
l.循环数梯度PCR，设置6、8、10、12、14cycle各一管。
m.选取最合适的循环数，对筛选库进行大量扩增。
n.纯化柱回收双链产物，Nanodrop测定产物浓度。
3)第2～9轮SELEX
a.取上一轮制备的dsDNA产物，碱变性法释放磷酸标记的单链。
b.延伸制备修饰碱基单链，产物过柱纯化。
c.Lambda外切酶消化30min，95℃加热5min，立即置于冰上，静置5min。冰浴完毕后产物，加入950μl Binding Buffer，室温静置5min。
d.加入20μl空磁珠反筛，杂交炉中室温孵育30min。
e.取上清，加入肠道病毒71型结构蛋白(简写EV)和柯萨奇病毒A16结构蛋白(简写cox)各20pmol，杂交炉中室温孵育30min。
f.加入His-Mag磁珠20μl，室温孵育30min。
g.Washing Buffer洗涤磁珠六次，每次1ml。最后一次洗涤后尽量吸干管中液体。
h.加入500mM咪唑50μl，静置5min。取出上清液体。
i.预扩增10个循环，扩增产物合并收集至一个干净的EP管中。
j.循环数梯度PCR，设置6、8、10、12、14cycle各一管。
k.选取最合适的循环数，对筛选库进行大量扩增。
l.纯化柱回收双链产物，Nanodrop测定产物浓度。产物用于后一轮筛选。
4)TA克隆与测序：
a.将第六轮最适循环数产物用于配置连接体系，16℃3h。
b.将连接产物在无菌条件下转移至100μl感受态细胞中，并用移液器轻轻混匀。
c.冰浴30min后于42℃水浴精确热激60s，冰浴2～3min。
d.加入900μl无抗生素的LB液体培养基，在37℃摇床中160rpm下复苏45～60min。
e.5 000rpm离心3min，留200～300μl液体与菌体混匀，涂布在带有氨苄青霉素抗性的LB固体平板上，将平板封好后倒置于37℃恒温箱中培养12～18h。
f.挑取分离良好的单克隆，接种于装有1ml带相应抗生素的LB液体培养基的离心管中，37℃培养8h。
g.菌检PCR体系鉴定阳性克隆电泳，挑选片段大小为232bp左右的克隆送测序。
h.序列用Vector NTI分析、比对。测序结果见图1，共获得47条序列，比对后发现11组重复序列。合成序列情况如表2，候选序列送合成。
表2
实施例2：
适配体亲和性实验(ELISA)：
a.PBS稀释蛋白至终浓度为200ng/ml，每个实验组设2个复孔，每孔加50μl。盖上封板膜后，4℃过夜。
b.洗板：每孔加满Washing Buffer，静置5秒后倒掉洗液，再重复3次。最后一次拍干。
c.每孔加150μl含有1％BSA的PBS封闭，室温孵育1h。
d.洗板：操作同步骤b。
e.用Binding Buffer稀释aptamer至目标浓度。
f.取包被好的板条，每孔加50μl。室温孵育1h。
g.洗板：操作同步骤b。
h.取Streptavidin-HRP与Aassay Diluent1:200稀释。每孔加50μl。室温孵育0.5h。
i.洗板：操作同包被中的步骤b。
j.每孔加50μl显色液。室温孵育20min，避光。
k.加50μl 0.5M H2SO4终止反应。轻轻震荡，以保证充分反应。
l.酶标仪读数：450nm。参比波长：650nm。三条序列亲和曲线如图2-4所示。V7、V11、V21的Kd值分别为32.72nM、4.28nM和4.55nM。
实施例3：
适配体特异性实验(ELISA):
参照实施例2的实验方法，共设100ng/ml、200ng/ml、500ng/ml、1000ng/ml四个包被浓度，固定每孔适配体用量为200nM。结果如图5所示，各个包被浓度的BSA蛋白都不和适配体结合。在较高包被浓度的条件下，适配体也会和柯萨奇病毒A16(cox)有一定的结合，但结合能力显著低于肠道病毒71型(EV)。
实施例4：免疫磁珠制作(100样本份为例)
1)25ul磁珠溶液，ddH2O洗3次，100ul 0.4M MES溶液重悬，
2)活化羧基磁珠：加入100ul预冷的EDC溶液(1mg EDC,100ul预冷的0.4M MES溶液)；震荡30分钟(室温，600rpm)；
3)适配体偶联：加入适配体2溶液(100uM)15ul，震荡6小时(室温，600rpm)；
4)封闭：磁性分离，弃上清，加封闭液(无锡百迈格公司提供)100ul，震荡1.5小时(室温，600rpm)，分析缓冲液清洗3次，100ul分析缓冲液重悬后于4℃保存。
实施例5：
双适配体化学发光法检测EV71型试剂盒组成包括：
1)免疫磁珠:表面固定有适配体1(捕获探针)的免疫磁珠，用于捕获样本中的EV71病毒；
2)分析缓冲液：1xPBS，5mM MgCl2，0.02％tween-20；
3)适配体2(信号探针)溶液：1xPBS，500nM适配体2，5mM MgCl2，1％BSA，1μg/mltRNA，0.02％tween-20，
3)SA-HRP溶液：SA-HRP：分析缓冲液1:1000；
4)发光底物液：辣根过氧化物酶作用的发光底物液，包括鲁米诺和过氧化氢溶液。
磁珠购自无锡百迈格生物科技有限公司，适配体均由上海生物工程公司合成修饰。
实施例6：快速检测肠道病毒71型中的具体应用方案
检测原理如图6所示；
1)样本预处理：冻融三次后4000rpm离心五分钟，取上清液检测。
2)病毒颗粒/EV71结构蛋白捕获：将500ul样本加入免疫磁珠，(常温，150rpm，20min)，分析缓冲液清洗磁珠3次，收集磁珠；
3)适配体2标记目标病毒/蛋白-免疫磁珠复合物：加入适配体2溶液100ul，(常温，600rpm，5min)，分析缓冲液清洗磁珠3次，收集磁珠；
4)HRP标记适配体2-目标病毒/蛋白-免疫磁珠复合物：加入SA-HRP溶液，(常温，600rpm，15min)，分析缓冲液清洗磁珠3次，收集磁珠，100ul分析缓冲液重悬；
5)化学发光法检测病毒/EV71结构蛋白含量：加入发光底物液，混匀，利用复合物上连接的HRP与底物液发生酶促反应，产生强烈的425mm荧光，荧光读书器检测荧光强度，Cut-off值＝阴性对照荧光强度*3，结果判断：若样本荧光强度/Cut-off值>1，样本为阳性；若样本荧光强度/Cut-off值≤1，样本为阴性；阳性样本中EV71病毒含量高低与发光值成正比。
6)以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内、利用本发明的适配体序列的任何修改、等同替换和改进，均应包含在本发明的保护范围之内。
实施列7：
利用适配体V11、V21设计两种EV71的双适配体化学发光检测方法，并进行比较。
1)根据实施例2所得到的三条适配体的亲和力的结果，参照实施列4-6，分别以V11作为捕获探针(适配体1)，V21作为信号探针(适配体2)及V21作为捕获探针(适配体1)，V11作为信号探针(适配体2)来构建两种EV71的化学发光检测方法。
2)用两种方法分别检测分析缓冲液、柯萨奇病毒A16阳性样本(荧光定量PCR检测阳性)、EV71阳性样本(荧光定量PCR检测阳性)。结果如图7所示，以V11作为适配体1的EV71化学发光检测方法中的信噪比(CLEV71/CLCA16)为2.88；以V21作为适配体1的EV71化学发光检测方法中的信噪比(CLEV71/CLCA16)为4.39。故选择V21作为适配体1,V11作为适配体2。
利用本发明的化学发光EV71试剂盒直接检测样本中的EV71病毒，可以快速的得到样品中EV71的大致含量，对指导疾病控制人员的相关卫生防疫工作，帮助临床医生更好的掌握对EV71感染手足口病的治疗、预后和转归有重要意义。
本发明的有益效果主要体现在：本试剂盒对EV71的检测有高度的特异性，与其他肠道病毒无明显交叉反应；检测的灵敏度达103拷贝数，可直接从疑似手足口病患者的脑脊液、疱疹液和咽拭子等标本中检测EV71病毒；利用本发明试剂盒检测操作简单快速，检测过程仅需45min左右，且该试剂盒的检测过程可以实现自动化，实现大批量、自动化检测。
SEQUENCE LISTING
<110> 镇江市第一人民医院
<120> EV71单链DNA适配体及利用双适配体检测肠道病毒71型的化学发光检测试剂
盒
<130>
<160> 6
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 76
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
actaagccac cgtgtccacc cucgccgagu uuucguaacu auaucuugug guuccuauug 60
cugcgucacu cuggau 76
<210> 2
<211> 75
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
actaagccac cgtgtccauu cgauucgauc uaauuugguu cuuuccucac uuuucagugc 60
ugcgucacuc uggau 75
<210> 3
<211> 75
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
ctaagccacc gtgtccauca auggugugug cauucgugug uuguguuguu uguuguuugc 60
ugcgucacuc uggau 75
<210> 4
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (19)..(19)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 4
atccagagtg acgcagcant ggacacggtg gcttagt 37
<210> 5
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
atccagagtg acgcagca 18
<210> 6
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
actaagccac cgtgtcca 18
Claims (4)
1.一种针对EV71的单链DNA适配体，其特征在于，所述适配体是序列如SEQ ID NO.1的适配体V11、序列如SEQ ID NO.2的适配体V21，以及序列如SEQ ID NO.3的适配体V7。
2.一种双适配体检测EV71的化学发光试剂盒，其特征在于，以序列如SEQ ID NO.2的适配体V21为捕获探针，以序列如SEQ ID NO.1的适配体V11为信号探针。
3.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，包括：
(1)捕获探针偶联的免疫磁珠；
(2)分析缓冲液；
(3)信号探针偶联的酶结合物；
(4)SA-HRP溶液；
(5)发光底物液。
4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，具体是：
(1)捕获探针偶联的免疫磁珠:表面固定有适配体V21的免疫磁珠，用于捕获样本中的EV71病毒；
(2)分析缓冲液：1xPBS，5mM MgCl2，0.02％tween-20；
(3)信号探针溶液：1xPBS，500nM适配体V11，5mM MgCl2，1％BSA，1μg/ml tRNA，0.02％tween-20，
(4)SA-HRP溶液：SA-HRP：分析缓冲液1:1000；
(5)发光底物液：辣根过氧化物酶作用的发光底物液，包括鲁米诺和过氧化氢溶液。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201910227016.9A CN109735548B (zh) | 2019-03-25 | 2019-03-25 | Ev71单链dna适配体及利用双适配体检测肠道病毒71型的化学发光检测试剂盒 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201910227016.9A CN109735548B (zh) | 2019-03-25 | 2019-03-25 | Ev71单链dna适配体及利用双适配体检测肠道病毒71型的化学发光检测试剂盒 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN109735548A true CN109735548A (zh) | 2019-05-10 |
| CN109735548B CN109735548B (zh) | 2022-04-26 |
Family
ID=66371303
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201910227016.9A Expired - Fee Related CN109735548B (zh) | 2019-03-25 | 2019-03-25 | Ev71单链dna适配体及利用双适配体检测肠道病毒71型的化学发光检测试剂盒 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN109735548B (zh) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108707607A (zh) * | 2018-06-08 | 2018-10-26 | 邵玉芹 | 一种能特异性检测ev71病毒的适配体及试剂盒 |
| CN115011603A (zh) * | 2022-06-27 | 2022-09-06 | 华侨大学 | 手足口病主要病原ev71与ca16的dna适配体及其应用 |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102279172A (zh) * | 2011-03-20 | 2011-12-14 | 亓立峰 | 一种检测手足口病病原的纳米探针芯片及其应用方法 |
| CN108034764A (zh) * | 2017-12-22 | 2018-05-15 | 北京卓诚惠生生物科技股份有限公司 | 多重pcr检测柯萨奇病毒、肠道病毒71型和肠道病毒通用型用引物探针组 |
| US20180296702A1 (en) * | 2014-09-08 | 2018-10-18 | Massachusetts Institute Of Technology | Rna-based logic circuits with rna binding proteins, aptamers and small molecules |
| CN108707607A (zh) * | 2018-06-08 | 2018-10-26 | 邵玉芹 | 一种能特异性检测ev71病毒的适配体及试剂盒 |
-
2019
- 2019-03-25 CN CN201910227016.9A patent/CN109735548B/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102279172A (zh) * | 2011-03-20 | 2011-12-14 | 亓立峰 | 一种检测手足口病病原的纳米探针芯片及其应用方法 |
| US20180296702A1 (en) * | 2014-09-08 | 2018-10-18 | Massachusetts Institute Of Technology | Rna-based logic circuits with rna binding proteins, aptamers and small molecules |
| CN108034764A (zh) * | 2017-12-22 | 2018-05-15 | 北京卓诚惠生生物科技股份有限公司 | 多重pcr检测柯萨奇病毒、肠道病毒71型和肠道病毒通用型用引物探针组 |
| CN108707607A (zh) * | 2018-06-08 | 2018-10-26 | 邵玉芹 | 一种能特异性检测ev71病毒的适配体及试剂盒 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| XINRAN ZOU等: "DNA aptamer against EV-A71 VP1 protein: selection and application", 《VIROLOGY JOURNAL》 * |
| 王晓琴等: "改良石墨烯检测体系对手足口病常见病毒的快速检测", 《现代预防医学》 * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108707607A (zh) * | 2018-06-08 | 2018-10-26 | 邵玉芹 | 一种能特异性检测ev71病毒的适配体及试剂盒 |
| CN115011603A (zh) * | 2022-06-27 | 2022-09-06 | 华侨大学 | 手足口病主要病原ev71与ca16的dna适配体及其应用 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN109735548B (zh) | 2022-04-26 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Bordería et al. | Group selection and contribution of minority variants during virus adaptation determines virus fitness and phenotype | |
| CN111856027B (zh) | 适用于无明显症状者排查的新冠病毒抗体检测试剂盒 | |
| Roberts et al. | Japanese encephalitis virus: a review on emerging diagnostic techniques | |
| CN111537743B (zh) | SARS-CoV-2新冠病毒抗体检测试剂盒 | |
| WO2006047928A1 (fr) | Préparation et applications de puces immunodétectrices pour la détection de cellules cancéreuses | |
| SK15752003A3 (sk) | Diagnostické skúšky pre parvovírus B19 | |
| CN111575407B (zh) | 对猪瘟野毒及其疫苗、非洲猪瘟病毒、猪非典型瘟病毒鉴别诊断的基因芯片以及检测方法 | |
| Heggestad et al. | Rapid test to assess the escape of SARS-CoV-2 variants of concern | |
| CN109735548A (zh) | Ev71单链dna适配体及利用双适配体检测肠道病毒71型的化学发光检测试剂盒 | |
| Grudlewska-Buda et al. | SARS-CoV-2—morphology, transmission and diagnosis during pandemic, review with element of meta-analysis | |
| CN102337351A (zh) | 一种流感病毒分型检测试剂盒 | |
| TW201300421A (zh) | 用於偵測豬繁殖及呼吸道綜合症病毒（ｐｒｒｓｖ）之試劑及方法 | |
| Mostafa et al. | Current trends in COVID-19 diagnosis and its new variants in physiological fluids: Surface antigens, antibodies, nucleic acids, and RNA sequencing | |
| CN104237512A (zh) | 一种免疫胶体金试纸条及制备方法及应用 | |
| CN103499685B (zh) | 人泌尿系统病原菌感染临床诊断的免疫荧光诊断试剂的制备方法 | |
| Wang et al. | An eight-year epidemiologic study based on baculovirus-expressed type-specific spike proteins for the differentiation of type I and II feline coronavirus infections | |
| CN106636149A (zh) | 斯氏副柔线虫丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶Pj_STPK基因克隆、原核表达方法及应用 | |
| Aloraij et al. | Development of a rapid immuno-based screening assay for the detection of adenovirus in eye infections | |
| CN110904194A (zh) | 一种肺炎支原体和肺炎衣原体核酸联合检测试剂盒及其应用 | |
| Naher et al. | Seroprevalence and co-infection of hepatitis A and hepatitis E viruses in children–a hospital based study in Bangladesh | |
| CA3108832A1 (en) | Synthetic peptide for detecting hiv-1 | |
| Aw-Yong et al. | Diagnosis of human enterovirus A71 infection in Malaysia using a commercial IgM-capture enzyme-linked immunosorbent assay and an IgM-colloidal gold immunochromatographic assay. | |
| CN111575404B (zh) | 对猪瘟野毒及其疫苗、非洲猪瘟病毒进行鉴别诊断的基因芯片以及检测方法 | |
| CN110261620B (zh) | 测定人血清磷酸酪氨酸衔接蛋白ShcA抗体的细胞免疫荧光试剂盒及其制备方法和应用 | |
| CN112611866A (zh) | 一种csfv的ipma中和抗体检测方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20220426 |