CN111996238A - 一种运用电化学发光扫描成像系统的新发病毒痕量检测方法 - Google Patents
一种运用电化学发光扫描成像系统的新发病毒痕量检测方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN111996238A CN111996238A CN202010808469.3A CN202010808469A CN111996238A CN 111996238 A CN111996238 A CN 111996238A CN 202010808469 A CN202010808469 A CN 202010808469A CN 111996238 A CN111996238 A CN 111996238A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- nucleic acid
- virus
- electrochemiluminescence
- probe
- minutes
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 241000700605 Viruses Species 0.000 title claims abstract description 100
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 title claims abstract description 63
- 238000004020 luminiscence type Methods 0.000 title claims abstract description 45
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title claims abstract description 44
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims abstract description 141
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims abstract description 85
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims abstract description 75
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims abstract description 75
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims abstract description 65
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims abstract description 65
- 241000907316 Zika virus Species 0.000 claims abstract description 28
- 239000011324 bead Substances 0.000 claims abstract description 26
- 229910021642 ultra pure water Inorganic materials 0.000 claims abstract description 24
- 239000012498 ultrapure water Substances 0.000 claims abstract description 24
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 claims abstract description 22
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims abstract description 22
- 238000000605 extraction Methods 0.000 claims abstract description 14
- 239000006148 magnetic separator Substances 0.000 claims abstract description 12
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims abstract description 9
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 43
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 41
- 239000000047 product Substances 0.000 claims description 32
- 230000010355 oscillation Effects 0.000 claims description 26
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 claims description 24
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims description 20
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 18
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 claims description 15
- 238000005336 cracking Methods 0.000 claims description 13
- PEEHTFAAVSWFBL-UHFFFAOYSA-N Maleimide Chemical compound O=C1NC(=O)C=C1 PEEHTFAAVSWFBL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 claims description 12
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 claims description 12
- 239000011616 biotin Substances 0.000 claims description 12
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 12
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 claims description 12
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 claims description 12
- KJTLSVCANCCWHF-UHFFFAOYSA-N Ruthenium Chemical compound [Ru] KJTLSVCANCCWHF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 229910052707 ruthenium Inorganic materials 0.000 claims description 10
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 9
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 claims description 7
- 241000700721 Hepatitis B virus Species 0.000 claims description 6
- 238000007710 freezing Methods 0.000 claims description 6
- 230000008014 freezing Effects 0.000 claims description 6
- 238000010276 construction Methods 0.000 claims description 4
- 239000012265 solid product Substances 0.000 claims description 4
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 claims description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims description 2
- 238000001035 drying Methods 0.000 claims description 2
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 claims 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 abstract description 11
- 239000008280 blood Substances 0.000 abstract description 11
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 abstract description 9
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 abstract description 7
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 8
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 7
- 239000000306 component Substances 0.000 description 6
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 6
- 238000006073 displacement reaction Methods 0.000 description 6
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 6
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical group [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 5
- 238000013461 design Methods 0.000 description 4
- 238000011160 research Methods 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- 241000711573 Coronaviridae Species 0.000 description 3
- 239000008358 core component Substances 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 3
- 239000008055 phosphate buffer solution Substances 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 2
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 2
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 2
- 238000007639 printing Methods 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 2
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- 101000857682 Homo sapiens Runt-related transcription factor 2 Proteins 0.000 description 1
- 206010024229 Leprosy Diseases 0.000 description 1
- 102100025368 Runt-related transcription factor 2 Human genes 0.000 description 1
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 1
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000412 dendrimer Substances 0.000 description 1
- 229920000736 dendritic polymer Polymers 0.000 description 1
- 238000001378 electrochemiluminescence detection Methods 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 208000004141 microcephaly Diseases 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 208000017520 skin disease Diseases 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 238000002834 transmittance Methods 0.000 description 1
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 1
- 238000012800 visualization Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
- C12Q1/682—Signal amplification
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
- C12Q1/701—Specific hybridization probes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
- C12Q1/701—Specific hybridization probes
- C12Q1/706—Specific hybridization probes for hepatitis
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/75—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated
- G01N21/76—Chemiluminescence; Bioluminescence
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
- G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Abstract
本发明公开一种运用电化学发光扫描成像系统的新发病毒痕量检测方法，步骤包括：构建电化学发光信号放大探针，往病毒核酸提取样品中加入电化学发光信号放大探针，使病毒核酸与电化学发光信号放大探针连接，加入捕捉探针，使病毒核酸与捕捉探针连接；加入链霉亲和素磁珠，充分涡旋混匀后使病毒核酸与链霉亲和素磁珠连接，然后磁分离器分离；用超纯水混匀所得产物，然后置于电化学发光成像系统中检测发光信号。本发明的优点有：实现将唾液、血液、尿液等复杂液体系统中的病毒转化为荧光信号，ZIKV病毒最低检出浓度是50拷贝数，SARS‑Cov2最低检出浓度是10拷贝数，为检测新发病毒提供了一种简单、快速、灵敏度高的检测方法。
Description
技术领域
本发明涉及病毒核酸检测技术领域，尤其涉及运用电化学发光扫描成像系统的病毒核酸检测技术领域。
背景技术
近年来，新发病毒导致的传染病给人类社会带来了巨大的影响。在美洲爆发的寨卡病毒(ZIKV)导致大量婴儿出生时即患有小头畸形；2019年开始新型冠状病毒(SARS-Cov2)在全球范围内的传播造成了不可估量的损失。然而，由于现有技术检测新发病毒样品的处理步骤复杂且耗时费力等因素，对新发病毒的快速检测以及后续的科学研究造成了巨大的阻碍。因此，开发通用的、高灵敏度、兼容性好且仪器试剂可共用的多功能检测平台，研发运用该检测平台适用多种病毒检测的技术对高致病性新发病毒的监测具有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种运用电化学发光扫描成像系统的新发病毒痕量检测方法，以解决现有技术检测新发病毒样品的处理步骤复杂且耗时费力的问题。
本发明合成了树状三联吡啶钌分子，并以该分子为基础构建信号放大体系，为电化学发光扫描成像系统提供放大的电化学发光信号，最终实现检测痕量病毒的目的。本发明开发的电化学发光成像识别系统由电化学模块、显微成像及图像采集系统组成：电化学发光模块采用芯片模式，并装配可拆卸印刷电极以克服传统电极易氧化及重现性差的问题；显微成像系统采用高分辨率显微镜，并配合高精度步进位移台及芯片固定支架，最终得到稳定的、完整的显微图像信息；高灵敏度电荷耦合器件(CCD)作为图像采集的核心部件，可实现高效的图像采集过程。在电化学发光成像识别系统的基础上，本发明针对ZIKV、SARS-Cov2、HBV病毒分别设计特异的序列识别、捕捉及信号放大探针等体系，最终达到高灵敏度检测病毒的目的。
本发明的目的通过下述技术方案实现：一种运用电化学发光扫描成像系统的病毒痕量检测方法，包括如下步骤：
(1)构建电化学发光信号放大探针，往1μL病毒核酸提取样品中加入所述电化学发光信号放大探针1μL，在37℃情况下孵育15分钟，使病毒核酸与电化学发光信号放大探针连接，得到体系1；往体系1中加入捕捉探针1μL，涡旋震荡，并在37℃情况下孵育15分钟，使病毒核酸与捕捉探针连接，得到体系2；往体系2中加入链霉亲和素磁珠过量，充分涡旋混匀后在37℃情况下孵育10分钟，使病毒核酸与链霉亲和素磁珠连接，然后磁分离器分离，用缓冲液冲洗；
(2)用超纯水混匀步骤(1)所得产物，然后置于电化学发光成像系统中检测发光信号。
进一步地，所述电化学发光信号放大探针的构建过程是：
(1)取10μM聚合度为20的树状三联吡啶钌聚合物，加入DNA识别域，并在37℃环境下孵育过夜，完成连接；
(2)取50K道尔顿的超滤管，将步骤(1)所得的初产物移至超滤管，5000转/分钟冷冻离心5分钟，直至超滤管中液体离心至下层；
(3)向步骤(2)中超滤管加入500μL 1×PBS缓冲液，5000转/分钟冷冻离心5分钟，直至超滤管中液体离心至下层；重复操作3次，将游离的DNA识别域离心至下层；
(4)用200μL的超纯水溶解上层中的电化学发光信号放大探针，反复冲洗上层管底部，充分溶解探针；
(5)取步骤(4)所得产物置于-20℃，并经过冷冻干燥，得到固体产物，即电化学发光信号放大探针，并储存于-20℃备用。
进一步地，所述病毒核酸是ZIKV病毒核酸或SARS-Cov2病毒核酸或HBV病毒核酸。
进一步地，所述病毒核酸是ZIKV病毒核酸，检测具体过程是：
(1)使用病毒裂解试剂盒把ZIKV病毒裂解后，65℃加热5分钟得到病毒核酸提取物；ZIKV病毒目的核酸序列：
GUUGGUAUGGAAUGGAGAUAAGGCCCAGGAAAGAACCAGA；
(2)取病毒核酸提取样品1μL，加入44.5μL超纯水中，并加入2.5μL20×磷酸盐缓冲液，涡旋震荡；
(3)向步骤(2)所得混合物中加入电化学发光信号放大探针1μL，涡旋震荡，并在37℃情况下孵育15分钟，使电化学发光信号放大探针与目标病毒核酸充分杂交；电化学发光信号放大探针的DNA识别域5’端是顺丁烯二酰亚胺修饰的，该DNA识别域的序列是：
TCTGGTTCTTTCCTGGGCCT；
(4)向步骤(3)体系中加入1μL捕捉探针，涡旋震荡，并在37℃情况下孵育15分钟，使捕捉探针与核酸充分杂交；所述的捕捉探针3’端是生物素修饰的，捕捉探针的序列是：
5′-TATCTCCATTCCATACCAAC-3′；
(5)向步骤(4)体系中加入过量的链霉亲和素磁珠，充分涡旋混匀后，在37℃情况下孵育10分钟；
(6)将步骤(5)所得产物用磁分离器分离，并用1×PBS缓冲液清洗，重复三次。
(7)将步骤(6)所得产物用超纯水混匀，并用最终用电化学发光成像系统检测信号。
进一步地，所述病毒核酸是SARS-Cov2核酸，检测的具体过程是：
(1)SARS-Cov2病毒经商品化病毒裂解试剂盒(主要成分为十二烷基硫酸钠)裂解后，65℃加热5分钟得到病毒核酸提取物；SARS-Cov2核酸序列如下：
SEQ NO.1：
TTATCAGACTCAGACTAATTCTCCTCGGCGGGCACGTAGT；
SEQ NO.2：
CGGGAACGTGGTTGACCTACACAGGTGCCATCAAATTGGA；
(2)取病毒核酸提取样品1μL，加入44.5μL超纯水中，并加入2.5μL20×磷酸盐缓冲液，涡旋震荡；
(3)向步骤(2)所得混合物中加入电化学发光信号放大探针1μL，涡旋震荡，并在37℃情况下孵育15分钟，使电化学发光信号放大探针与目标病毒核酸充分杂交；
与序列SEQ NO.1匹配的电化学发光放大探针的DNA识别域1的5’端是顺丁烯二酰亚胺修饰的，DNA识别域1的序列是：
ACTACGTGCCCGCCGAGGAG；
与序列SEQ NO.2匹配的电化学发光放大探针的DNA识别域2的5’端是顺丁烯二酰亚胺修饰的，DNA识别域2的序列是：
TCCAATTTGATGGCACCTGT；
(4)向步骤(3)体系中加入1μL捕捉探针，涡旋震荡，并在37℃情况下孵育15分钟，使捕捉探针与核酸充分杂交；
与序列SEQ NO.1匹配的捕捉探针1的3’是生物素修饰的，捕捉探针1的序列是：
AATTAGTCTGAGTCTGATAA；
与序列SEQ NO.2匹配的捕捉探针2的3’是生物素修饰的，捕捉探针2的序列是：
GTAGGTCAACCACGTTCCCG。
(5)向步骤(4)体系中加入过量的链霉亲和素磁珠，充分涡旋混匀后，在37℃情况下孵育10分钟；
(6)将步骤(5)所得产物用磁分离器分离，并用1×PBS缓冲液清洗，重复三次；
(7)将步骤(6)所得产物用超纯水混匀，并用最终用电化学发光仪器检测信号。
进一步地，所述病毒核酸是HBV病毒，其检测具体过程是：
(1)HBV病毒经商品化病毒裂解试剂盒(主要成分为十二烷基硫酸钠)裂解后，65℃加热5分钟得到病毒核酸提取物；
HBV病毒核酸序列：
ACTAGTAAACTGAGCATACTGGCCAGGACACGTGGGTGC；
(2)取病毒核酸提取样品1μL，加入44.5μL超纯水中，并加入2.5μL20×磷酸盐缓冲液，涡旋震荡；
(3)向步骤(2)所得混合物中加入电化学发光信号放大探针1μL，涡旋震荡，并在37℃情况下孵育15分钟，使电化学发光信号放大探针与目标病毒核酸充分杂交；
所述电化学信号放大探针的DNA识别域的5’端是顺丁烯二酰亚胺修饰的，DNA识别域的序列是：
GGAGCAGGAGCACCCACGTGTCCTGGCC；
(4)向步骤(3)体系中加入1μL捕捉探针，涡旋震荡，并在37℃情况下孵育15分钟，使捕捉探针与核酸充分杂交；所述的捕捉探针的3’是生物素修饰的，捕捉探针的序列是：5′-GCTCAGTTTACTAGTGCCATTT-3′；
(5)向步骤(4)体系中加入过量的链霉亲和素磁珠，充分涡旋混匀后，在37℃情况下孵育10分钟；
(6)将步骤(5)所得产物用磁分离器分离，并用1×PBS缓冲液清洗，重复三次；
(7)将步骤(6)所得产物用超纯水混匀，并用最终用电化学发光仪器检测信号。
本发明以ZIKV、SARS-Cov2、HBV等病毒为研究对象，以高效的电化学发光放大方法作为技术支撑，开发了新型的电化学发光扫描成像方法，实现了病毒痕量检测。本发明构建了特异的病毒基因序列识别、捕捉及信号放大探针等体系，可实现将唾液、血液、尿液等复杂液体系统中的病毒转化为荧光信号，可检测50拷贝数的病毒量，为检测新发病毒提供了一种简单、快速、灵敏度高的检测方法。
附图说明
此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本申请的一部分，并不构成对本发明的不当限定，在附图中：
图1.电化学发光扫描成像识别方法技术路线图；
图2.电化学发光扫描系统的整体结构图；
图3.高精度步进位移台；
图4.芯片结构示意图；
图5.电化学发光扫描成像识别方法技术设计流程图。A.树状聚合物探针的形成过程；B.树状三联吡啶钌聚合物信号放大电化学发光扫描成像系统的电化学发光检测过程；
图6.基于电化学发光扫描成像识别方法的病毒RNA检测方法原理图；
图7.A电化学发光扫描成像系统光场下磁珠表面活化钌聚合物成像识别；
B电化学发光扫描成像系统暗场下磁珠表面活化钌聚合物成像识别；
图8.链霉亲和素标记磁珠、链霉亲和素标记磁珠的电化学发光信号复合物的粒度和Zeta电位；
图9.系统数据采集时间的优化；
图10.电化学发光扫描成像系统检测ZIKV病毒的敏感性和特异性；
图11.ZIKV病毒感染小鼠模型血液样品检测实验结果；
图12.ZIKV病毒感染小鼠模型尿液样品检测实验结果；
图13-15.
加标人血液样品ZIKV核酸检测实验结果；
图16-18.加标人尿液样品ZIKV核酸检测实验结果；
图19.电化学发光扫描成像系统检测SARS-Cov2核酸的敏感性实验结果；
图20.电化学发光扫描成像系统检测SARS-Cov2核酸的特异性实验结果；
图21.加标人唾液样品SARS-Cov2核酸检测；
图22.加标人血液样品SARS-Cov2核酸检测。.
具体实施方式
下面将结合附图以及具体实施例来详细说明本发明，在此以本发明的示意性实施例及说明用来解释本发明，但并不作为对本发明的限定。
实施例1电化学发光扫描成像识别方法
(1)总体技术路线及流程
本发明旨在于构建电化学发光扫描成像识别系统，并最终实现基于ZIKV、SARS-Cov2、HBV的病毒检测方法。本发明的技术路线如图1所示：
①本发明合成了树状三联吡啶钌分子，并以此构建聚合物放大体系，为单分子电化学发光成像系统提供放大的电化学发光信号，最终实现病毒特异性识别的目的。
②如图2-4所示，本发明开发的电化学发光成像识别系统由电化学发光系统、显微镜系统及高灵敏度电荷耦合器件(CCD)1组成：电化学发光系统采用芯片模式，并装配可拆卸印刷电极8以克服传统电极易氧化及重现性差的问题；显微镜系统采用高分辨率显微镜2，并配合高精度步进位移台7，最终得到稳定的、完整的显微图像信息。
③高灵敏度电荷耦合器件(CCD)1作为图像采集的核心部件，可实现高效的图像采集过程。
④在单分子电化学发光成像识别系统的基础上，本发明针对ZIKV、SARS-Cov2、HBV病毒分别设计特异的序列识别、捕捉及信号放大探针等体系，最终达到高灵敏度检测病毒的目的。
⑤为了进一步提升便捷性、扩宽其应用范围，本发明开发与单分子电化学发光成像识别系统配套的样品采集、提取及信号放大等一系列技术，并最终通过检测血清、尿液、唾液等加标样品中的病毒，验证该方案的可行性、提高稳定性及可操作性，以期实现标准化痕量病毒检测技术的开发及应用。本发明的技术流程图如图5所示。
(2)聚合物电化学发光探针的构建
本发明的电化学发光信号放大探针用聚合度为20的树状三联吡啶钌聚合物作为信号放大基团，并连接DNA识别域，最终完成电化学发光信号放大探针的构建，探针识别过程如图6所示，其主要包含以下步骤：
①分别取10μM树状三联吡啶钌聚合物，加入DNA识别域，并在37℃环境下孵育过夜，完成信号放大基团与DNA识别域的连接；
②取50K道尔顿的超滤管，将步骤①所得的初产物移至超滤管，5000转/分钟冷冻离心5分钟，直至超滤管中液体离心至下层；
③向步骤②中超滤管加入500μL 1×PBS缓冲液，5000转/分钟冷冻离心5分钟，直至超滤管中液体离心至下层；重复操作3次，将游离的DNA识别域离心至下层；
④用200μL的超纯水溶解上层中的电化学发光信号放大探针，反复冲洗上层管底部，充分溶解探针；
⑤取步骤④所得产物置于-20℃，并经过冷冻干燥，得到固体产物，即电化学发光信号放大探针，并储存于-20℃备用；
单分子电化学发光成像识别系统主要由以下部件组成：电化学模块、显微成像及图像采集系统组成。如图2-4所示，
(1)电化学发光模块
电化学发光系统主要由电化学发光芯片8和高精度步进位移台(X、Y轴方向)构成。
(2)显微镜系统
显微镜系统采用高分辨率光学显微镜2作为该系统的主体部分，为了达到较好的成像效果，该显微镜拟配备高透、高倍物镜。该显微成像系统还需具备与图像采集系统相配套的采集窗，以便于和图像采集耦合。在高分辨率光学显微镜2基础上，配合如图3所示高精度步进位移台(微米级)7，从而实现XY平面的成像信息，步进位移台7移动速率需与图像采集系统采集频率相配合，移动一个视野的距离采集一次图像。再加上图像采集系统的可根据光强度在Z轴形成图像信息，最终得到稳定的、完整的显微图像信息。
(3)高灵敏度电荷耦合器件(CCD)
CCD1作为图像采集过程中的核心部件，能够识别单光子，进而保证检测痕量病毒的灵敏度。
为了验证电化学发光成像系统的性能及可行性，我们对磁珠表面的电化学发光探针进行了成像实验，实验结果如图7A-B所示。在暗视场的情况下，本平台得到了磁珠表面稳定的成像结果，由此证明了本发明的可行性，如图8所示是链霉亲和素标记磁珠、链霉亲和素标记磁珠的电化学发光信号复合物的粒度和Zeta电位。图9所示，是电化学发光成像系统数据不同采集时间的成像结果。
实施例2电化学发光成像识别方法在ZIKV病毒检测中的运用
本发明以聚合物放大的电化学发光成像技术为依托，以ZIKV病毒感染小鼠模型血液样品及尿液样品，加标人血液样品、加标人尿液样品做实验，其技术流程如图5所示，主要由以下步骤组成：
①ZIKV病毒经商品化病毒裂解试剂盒(主要成分为十二烷基硫酸钠)裂解后，65℃加热5分钟得到病毒核酸提取物；
ZIKV病毒目的核酸序列：
GUUGGUAUGGAAUGGAGAUAAGGCCCAGGAAAGAACCAGA；
②取病毒核酸提取样品1μL，加入44.5μL超纯水中，并加入2.5μL20×磷酸盐缓冲液，涡旋震荡；
③向步骤②所得混合物中加入电化学发光信号放大探针1μL，涡旋震荡，并在37℃情况下孵育15分钟，使电化学发光信号放大探针与目标病毒核酸充分杂交；
电化学发光信号放大探针的DNA识别域5’端是顺丁烯二酰亚胺修饰的，该DNA识别域的序列是：
TCTGGTTCTTTCCTGGGCCT；
④向步骤③体系中加入1μL捕捉探针，涡旋震荡，并在37℃情况下孵育15分钟，使捕捉探针与核酸充分杂交；所述的捕捉探针3’端是生物素修饰的，捕捉探针的序列是：5′-TATCTCCATTCCATACCAAC-3′；
⑤向步骤④体系中加入过量的链霉亲和素磁珠，充分涡旋混匀后，在37℃情况下孵育10分钟；
⑥将步骤⑤所得产物用磁分离器分离，并用1×PBS缓冲液清洗，重复三次；
⑦将步骤⑥所得产物用超纯水混匀，并用最终用电化学发光仪器检测信号。其原理图如图5和图6所示。实验结果如图10-18所示，当ZIKV病毒存在血液、尿液样品时，电化学发光成像识别系统可得到稳定的响应信号，从图10中可以看出最低检出浓度是50copies。
实施例3电化学发光成像识别方法在SARS-Cov2检测中的运用
本发明以聚合物放大的电化学发光成像技术为依托，以加标人血液样品、加标人唾液样品进行试验，其技术流程，如图5所示，主要由以下步骤组成：
①SARS-Cov2病毒经商品化病毒裂解试剂盒(主要成分为十二烷基硫酸钠)裂解后，65℃加热5分钟得到病毒核酸提取物；
SARS-Cov2核酸序列如下：
SEQ NO.1：
TTATCAGACTCAGACTAATTCTCCTCGGCGGGCACGTAGT；
SEQ NO.2：
CGGGAACGTGGTTGACCTACACAGGTGCCATCAAATTGGA；
②取病毒核酸提取样品1μL，加入44.5μL超纯水中，并加入2.5μL20×磷酸盐缓冲液，涡旋震荡；
③向步骤②所得混合物中加入电化学发光信号放大探针1μL，涡旋震荡，并在37℃情况下孵育15分钟，使电化学发光信号放大探针与目标病毒核酸充分杂交；
与序列SEQ NO.1匹配的电化学发光放大探针的DNA识别域1的5’端是顺丁烯二酰亚胺修饰的，DNA识别域1的序列是：
ACTACGTGCCCGCCGAGGAG；
与序列SEQ NO.2匹配的电化学发光放大探针的DNA识别域2的5’端是顺丁烯二酰亚胺修饰的，DNA识别域2的序列是：
TCCAATTTGATGGCACCTGT；
④向步骤③体系中加入1μL捕捉探针，涡旋震荡，并在37℃情况下孵育15分钟，使捕捉探针与核酸充分杂交；
与序列SEQ NO.1匹配的捕捉探针1的3’是生物素修饰的，捕捉探针1的序列是：
AATTAGTCTGAGTCTGATAA；
与序列SEQ NO.2匹配的捕捉探针2的3’是生物素修饰的，捕捉探针2的序列是：
GTAGGTCAACCACGTTCCCG。
⑤向步骤④体系中加入过量的链霉亲和素磁珠，充分涡旋混匀后，在37℃情况下孵育10分钟；
⑥将步骤⑤所得产物用磁分离器分离，并用1×PBS缓冲液清洗，重复三次；
⑦将步骤⑥所得产物用超纯水混匀，并最终用电化学发光仪器检测信号。其原理图如图5和图6所示。实验结果如图19-22所示，当SARS-Cov2存在人血液样品、人唾液样品时，电化学发光成像识别系统可得到稳定的响应信号。从图19中可以看出最低检出浓度是10copies，图20的横坐标control是对照组，不添加任何核酸样品；RS1和RS2是检测两个随机核酸序列，Test是检测SARS-Cov2加标样品。
实施例4电化学发光成像识别方法在HBV检测中的运用
本发明以聚合物放大的电化学发光成像技术为依托，其技术流程如图5所示，主要由以下步骤组成：
①HBV病毒经商品化病毒裂解试剂盒(主要成分为十二烷基硫酸钠)裂解后，65℃加热5分钟得到病毒核酸提取物；
HBV病毒核酸序列：
ACTAGTAAACTGAGCATACTGGCCAGGACACGTGGGTGC；
②取病毒核酸提取样品1μL，加入44.5μL超纯水中，并加入2.5μL20×磷酸盐缓冲液，涡旋震荡；
③向步骤②所得混合物中加入电化学发光信号放大探针1μL，涡旋震荡，并在37℃情况下孵育15分钟，使电化学发光信号放大探针与目标病毒核酸充分杂交；
所述电化学信号放大探针的DNA识别域的5’端是顺丁烯二酰亚胺修饰的，DNA识别域的序列是：
GGAGCAGGAGCACCCACGTGTCCTGGCC；
④向步骤③体系中加入1μL捕捉探针，涡旋震荡，并在37℃情况下孵育15分钟，使捕捉探针与核酸充分杂交；所述的捕捉探针的3’是生物素修饰的，捕捉探针的序列是：5′-GCTCAGTTTACTAGTGCCATTT-3′；
⑤向步骤④体系中加入过量的链霉亲和素磁珠，充分涡旋混匀后，在37℃情况下孵育10分钟；
⑥将步骤⑤所得产物用磁分离器分离，并用1×PBS缓冲液清洗，重复三次；
⑦将步骤⑥所得产物用超纯水混匀，并最终用电化学发光仪器检测信号。其原理图如图5和图6所示。当HBV存在时，电化学发光成像识别系统可得到稳定的响应信号。
本发明相对于现有技术，具有如下的优点及效果：
(1)信号采集灵敏度高、形象化且可定量化统计分析
本发明采用高灵敏度CCD做为电化学发光信号的接收体系，具有灵敏度高、实验结果形象化的优点，且可对图形化的实验结果进行定量化的统计分析；
(2)样品兼容性好
本发明在构建电化学发光扫描成像识别平台的基础上，可同时针对ZIKV、SARS-Cov2、HBV等多种病毒设计检测流程，具有样品兼容性好的特点，应用范围广；
(3)操作简单快速、无需进行样品扩增
本发明检测过程简单，经过简单的样品提取过程即可进行病毒检测，耗时短，省去了扩增步骤，检测快速；
(4)可用于复杂体液系统的病毒检测
本发明提出的检测方法可用于唾液、血液、尿液等复杂液体系统中的病毒检测，对后续进行关于新发病毒的科学研究提供了便利条件。
以上对本发明实施例所提供的技术方案进行了详细介绍，本文中应用了具体个例对本发明实施例的原理以及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只适用于帮助理解本发明实施例的原理；同时，对于本领域的一般技术人员，依据本发明实施例，在具体实施方式以及应用范围上均会有改变之处，综上所述，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。
序列表
<110> 南方医科大学皮肤病医院（广东省皮肤病医院、广东省皮肤性病防治中心、中国麻风防治研究中心）
<120> 一种运用电化学发光扫描成像系统的新发病毒痕量检测方法
<130> 2020
<160> 12
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 40
<212> RNA
<213> 寨卡病毒(ZIKV)
<400> 1
guugguaugg aauggagaua aggcccagga aagaaccaga 40
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 2
tctggttctt tcctgggcct 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 3
tatctccatt ccataccaac 20
<210> 4
<211> 40
<212> DNA
<213> 新型冠状病毒(SARS-Cov2)
<400> 4
ttatcagact cagactaatt ctcctcggcg ggcacgtagt 40
<210> 5
<211> 40
<212> DNA
<213> 新型冠状病毒(SARS-Cov2)
<400> 5
cgggaacgtg gttgacctac acaggtgcca tcaaattgga 40
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 6
actacgtgcc cgccgaggag 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 7
tccaatttga tggcacctgt 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 8
aattagtctg agtctgataa 20
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 9
gtaggtcaac cacgttcccg 20
<210> 10
<211> 39
<212> DNA
<213> 乙型肝炎病毒(HBV)
<400> 10
actagtaaac tgagcatact ggccaggaca cgtgggtgc 39
<210> 11
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 11
ggagcaggag cacccacgtg tcctggcc 28
<210> 12
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 12
gctcagttta ctagtgccat tt 22
Claims (9)
1.一种运用电化学发光扫描成像系统的病毒痕量检测方法，其特征在于：
包括如下步骤：
(1)构建电化学发光信号放大探针，往1μL病毒核酸提取样品中加入所述电化学发光信号放大探针1μL，在37℃情况下孵育15分钟，使病毒核酸与电化学发光信号放大探针连接，得到体系1；往体系1中加入捕捉探针1μL，涡旋震荡，并在37℃情况下孵育15分钟，使病毒核酸与捕捉探针连接，得到体系2；往体系2中加入链霉亲和素磁珠过量，充分涡旋混匀后在37℃情况下孵育10分钟，使病毒核酸与链霉亲和素磁珠连接，然后磁分离器分离，用缓冲液冲洗；
(2)用超纯水混匀步骤(1)所得产物，然后置于电化学发光成像系统中检测发光信号。
2.根据权利要求1所述的一种运用电化学发光扫描成像系统的病毒痕量检测方法，其特征在于：
所述电化学发光信号放大探针的构建过程是：
(1)取10μM聚合度为20的树状三联吡啶钌聚合物，加入DNA识别域，并在37℃环境下孵育过夜，完成连接；
(2)取50K道尔顿的超滤管，将步骤(1)所得的初产物移至超滤管，5000转/分钟冷冻离心5分钟，直至超滤管中液体离心至下层；
(3)向步骤(2)中超滤管加入500μL 1×PBS缓冲液，5000转/分钟冷冻离心5分钟，直至超滤管中液体离心至下层；重复操作3次，将游离的DNA识别域离心至下层；
(4)用200μL的超纯水溶解上层中的电化学发光信号放大探针，反复冲洗上层管底部，充分溶解探针；
(5)取步骤(4)所得产物置于-20℃，并经过冷冻干燥，得到固体产物，即电化学发光信号放大探针，并储存于-20℃备用。
3.根据权利要求1或2所述的一种运用电化学发光扫描成像系统的新发病毒痕量检测方法，其特征在于：
所述病毒核酸是ZIKV病毒核酸或SARS-Cov2病毒核酸或HBV病毒核酸。
4.根据权利要求3所述的一种运用电化学发光扫描成像系统的新发病毒痕量检测方法，其特征在于：
所述病毒核酸是ZIKV病毒核酸，检测具体过程是：
(1)使用病毒裂解试剂盒把ZIKV病毒裂解后，65℃加热5分钟得到病毒核酸提取物；
(2)取病毒核酸提取样品1μL，加入44.5μL超纯水中，并加入2.5μL20×磷酸盐缓冲液，涡旋震荡；
(3)向步骤(2)所得混合物中加入电化学发光信号放大探针1μL，涡旋震荡，并在37℃情况下孵育15分钟，使电化学发光信号放大探针与目标病毒核酸充分杂交；
(4)向步骤(3)体系中加入1μL捕捉探针，涡旋震荡，并在37℃情况下孵育15分钟，使捕捉探针与核酸充分杂交；
(5)向步骤(4)体系中加入过量的链霉亲和素磁珠，充分涡旋混匀后，在37℃情况下孵育10分钟；
(6)将步骤(5)所得产物用磁分离器分离，并用1×PBS缓冲液清洗，重复三次；
(7)将步骤(6)所得产物用超纯水混匀，并用最终用电化学发光成像系统检测信号。
5.根据权利要求4所述的一种运用电化学发光扫描成像系统的新发病毒痕量检测方法，其特征在于：
所述ZIKV病毒目的核酸序列是：
GUUGGUAUGGAAUGGAGAUAAGGCCCAGGAAAGAACCAGA；
所述电化学发光信号放大探针的DNA识别域5’端是顺丁烯二酰亚胺修饰的，DNA识别域的序列是：
TCTGGTTCTTTCCTGGGCCT；
捕捉探针3’端是生物素修饰的，捕捉探针的序列是：
TATCTCCATTCCATACCAAC。
6.根据权利要求3所述的一种运用电化学发光扫描成像系统的新发病毒痕量检测方法，其特征在于：
所述病毒核酸是SARS-Cov2核酸，检测的具体过程是：
(1)使用病毒裂解试剂盒把SARS-Cov2病毒裂解后，65℃加热5分钟得到病毒核酸提取物；
(2)取病毒核酸提取样品1μL，加入44.5μL超纯水中，并加入2.5μL20×磷酸盐缓冲液，涡旋震荡；
(3)向步骤(2)所得混合物中加入电化学发光信号放大探针1μL，涡旋震荡，并在37℃情况下孵育15分钟，使电化学发光信号放大探针与目标病毒核酸充分杂交；
(4)向步骤(3)体系中加入1μL捕捉探针，涡旋震荡，并在37℃情况下孵育15分钟，使捕捉探针与核酸充分杂交；
(5)向步骤(4)体系中加入过量的链霉亲和素磁珠，充分涡旋混匀后，在37℃情况下孵育10分钟；
(6)将步骤(5)所得产物用磁分离器分离，并用1×PBS缓冲液清洗，重复三次；
(7)将步骤(6)所得产物用超纯水混匀，并最终用电化学发光仪器检测信号。
7.根据权利要求6所述的一种运用电化学发光扫描成像系统的新发病毒痕量检测方法，其特征在于：
所述SARS-Cov2病毒目的核酸序列是：
SEQ NO.1：
TTATCAGACTCAGACTAATTCTCCTCGGCGGGCACGTAGT；
SEQ NO.2：
CGGGAACGTGGTTGACCTACACAGGTGCCATCAAATTGGA；
与序列SEQ NO.1匹配的电化学发光放大探针的DNA识别域1的5’端是顺丁烯二酰亚胺修饰的，DNA识别域1的序列是：
ACTACGTGCCCGCCGAGGAG；
与序列SEQ NO.1匹配的捕捉探针1的3’是生物素修饰的，捕捉探针1的序列是：
AATTAGTCTGAGTCTGATAA；
与序列SEQ NO.2匹配的电化学发光放大探针的DNA识别域2的5’端是顺丁烯二酰亚胺修饰的，DNA识别域2的序列是：
TCCAATTTGATGGCACCTGT；
与序列SEQ NO.2匹配的捕捉探针2的3’是生物素修饰的，捕捉探针2的序列是：
GTAGGTCAACCACGTTCCCG。
8.根据权利要求3所述的一种运用电化学发光扫描成像系统的新发病毒痕量检测方法，其特征在于：
所述病毒核酸是HBV病毒，其检测具体过程是：
(1)使用病毒裂解试剂盒把HBV病毒裂解后，65℃加热5分钟得到病毒核酸提取物；
(2)取病毒核酸提取样品1μL，加入44.5μL超纯水中，并加入2.5μL20×磷酸盐缓冲液，涡旋震荡；
(3)向步骤(2)所得混合物中加入电化学发光信号放大探针1μL，涡旋震荡，并在37℃情况下孵育15分钟，使电化学发光信号放大探针与目标病毒核酸充分杂交；
(4)向步骤(3)体系中加入1μL捕捉探针，涡旋震荡，并在37℃情况下孵育15分钟，使捕捉探针与核酸充分杂交；
(5)向步骤(4)体系中加入过量的链霉亲和素磁珠，充分涡旋混匀后，在37℃情况下孵育10分钟；
(6)将步骤(5)所得产物用磁分离器分离，并用1×PBS缓冲液清洗，重复三次；
(7)将步骤(6)所得产物用超纯水混匀，并最终用电化学发光仪器检测信号。
9.根据权利要求8所述的一种运用电化学发光扫描成像系统的新发病毒痕量检测方法，其特征在于：
所述HBV病毒目的核酸序列是：
ACTAGTAAACTGAGCATACTGGCCAGGACACGTGGGTGC；
所述电化学信号放大探针的DNA识别域的5’端是顺丁烯二酰亚胺修饰的，DNA识别域的序列是：
GGAGCAGGAGCACCCACGTGTCCTGGCC；
所述捕捉探针的3’是生物素修饰的，捕捉探针的序列是：
GCTCAGTTTACTAGTGCCATTT。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202010808469.3A CN111996238B (zh) | 2020-08-12 | 2020-08-12 | 一种运用电化学发光扫描成像系统的新发病毒痕量检测方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202010808469.3A CN111996238B (zh) | 2020-08-12 | 2020-08-12 | 一种运用电化学发光扫描成像系统的新发病毒痕量检测方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN111996238A true CN111996238A (zh) | 2020-11-27 |
| CN111996238B CN111996238B (zh) | 2024-04-05 |
Family
ID=73464174
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202010808469.3A Active CN111996238B (zh) | 2020-08-12 | 2020-08-12 | 一种运用电化学发光扫描成像系统的新发病毒痕量检测方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN111996238B (zh) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN115304781A (zh) * | 2022-08-08 | 2022-11-08 | 南方医科大学皮肤病医院（广东省皮肤病医院、广东省皮肤性病防治中心、中国麻风防治研究中心） | 一种基于mof框架的免扩增高效电化学发光探针及其制备方法与应用 |
| WO2023015836A1 (zh) * | 2021-08-07 | 2023-02-16 | 浙江大学 | 一种电化学发光的单光子信号采集方法、成像系统及其应用 |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107418559A (zh) * | 2017-07-20 | 2017-12-01 | 广州博徕斯生物科技有限公司 | 一种噬菌体电化学发光信号扩增探针及其制备方法和应用 |
| CN107475454A (zh) * | 2017-09-21 | 2017-12-15 | 中山大学 | 基于电化学发光放大原理的寨卡病毒核酸检测方法 |
| CN111270020A (zh) * | 2020-04-07 | 2020-06-12 | 微岩医学科技(北京)有限公司 | 核酸检测试剂及其在新型冠状病毒检测中的应用 |
| CN111334615A (zh) * | 2020-04-28 | 2020-06-26 | 上海星耀医学科技发展有限公司 | 一种新型冠状病毒检测方法与试剂盒 |
-
2020
- 2020-08-12 CN CN202010808469.3A patent/CN111996238B/zh active Active
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107418559A (zh) * | 2017-07-20 | 2017-12-01 | 广州博徕斯生物科技有限公司 | 一种噬菌体电化学发光信号扩增探针及其制备方法和应用 |
| CN107475454A (zh) * | 2017-09-21 | 2017-12-15 | 中山大学 | 基于电化学发光放大原理的寨卡病毒核酸检测方法 |
| CN111270020A (zh) * | 2020-04-07 | 2020-06-12 | 微岩医学科技(北京)有限公司 | 核酸检测试剂及其在新型冠状病毒检测中的应用 |
| CN111334615A (zh) * | 2020-04-28 | 2020-06-26 | 上海星耀医学科技发展有限公司 | 一种新型冠状病毒检测方法与试剂盒 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| YUNXIA WU ET AL.: "Trace Analysis of Emerging Virus: An Ultrasensitive ECL-Scan Imaging System for Viral Infectious Disease" * |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2023015836A1 (zh) * | 2021-08-07 | 2023-02-16 | 浙江大学 | 一种电化学发光的单光子信号采集方法、成像系统及其应用 |
| CN115304781A (zh) * | 2022-08-08 | 2022-11-08 | 南方医科大学皮肤病医院（广东省皮肤病医院、广东省皮肤性病防治中心、中国麻风防治研究中心） | 一种基于mof框架的免扩增高效电化学发光探针及其制备方法与应用 |
| CN115304781B (zh) * | 2022-08-08 | 2023-12-01 | 南方医科大学皮肤病医院（广东省皮肤病医院、广东省皮肤性病防治中心、中国麻风防治研究中心） | 一种基于mof框架的免扩增高效电化学发光探针及其制备方法与应用 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN111996238B (zh) | 2024-04-05 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP6408552B2 (ja) | 改善されたアッセイ方法 | |
| CN111996238A (zh) | 一种运用电化学发光扫描成像系统的新发病毒痕量检测方法 | |
| Cheng et al. | Novel biosensing methodologies for ultrasensitive detection of viruses | |
| CN105441595B (zh) | 一种用于检测hbv-b/c的数字pcr绝对定量分型检测试剂盒 | |
| CN102586450A (zh) | 基于滚环扩增比色检测靶核酸或蛋白的方法 | |
| CN108676920A (zh) | 一种快速检测小鼠诺如病毒引物、试剂盒及其rt-rpa方法 | |
| CN110716040A (zh) | 一种基于MXene纳米片光热放大的邻近杂交双模式免疫传感器的制备及应用 | |
| Hu et al. | Light‐Start CRISPR‐Cas12a Reaction with Caged crRNA Enables Rapid and Sensitive Nucleic Acid Detection | |
| CN108913812A (zh) | 一种猪病毒性腹泻病原的多重液相芯片检测方法及其构建 | |
| Zhang et al. | Multiplexed CRISPR/Cas9 quantifications based on bioinspired photonic barcodes | |
| CN111424115A (zh) | 一种利用血糖仪检测新型冠状病毒的方法 | |
| Wang et al. | A signal on–off strategy based on the digestion of DNA cubes assisted by the CRISPR–Cas12a system for ultrasensitive HBV detection in solid-state nanopores | |
| Narasimhan et al. | Nucleic Acid Amplification‐Based Technologies (NAAT)—Toward Accessible, Autonomous, and Mobile Diagnostics | |
| CN107764803B (zh) | 一种运用电化学发光成像识别技术的生物标志物检测方法 | |
| CN103233073B (zh) | 一种基于滚环扩增的微小rna的比色检测方法 | |
| CN114088943B (zh) | 一种用于检测克氏原螯虾白斑综合征病毒的金纳米探针及其制备方法和应用 | |
| Bi et al. | Development of a handheld nano-centrifugal device for visual virus detection | |
| CN106755590A (zh) | 一种用于检测传单患者eb病毒fish检测探针 | |
| CN113189059B (zh) | 基于适配体和声表面波的病毒分选富集检测系统及方法 | |
| CN114717228A (zh) | 一种使用磁珠法快速提取痰液样本基因组的方法 | |
| CN117701778B (zh) | 一种用于快速检测眼内病毒核酸的外置燃料型纳米耀斑探针及其应用 | |
| CN112143489B (zh) | 一种运用金岛增强型多重量子点荧光策略的循环肿瘤核酸检测方法 | |
| CN109439730B (zh) | 一种单链式核酸多重检测方法 | |
| CN103852582B (zh) | 纳米荧光微粒用作多重pcr产物的液相蛋白芯片的用途 | |
| CN111690774A (zh) | 一种用于检测小鼠肝炎病毒的超快速实时荧光vpcr试剂盒和方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |