CN103103248A

CN103103248A - 检测基因点突变的液相芯片和方法

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Publication number: CN103103248A
Application number: CN2011103348427A
Authority: CN
Inventors: 程昌明
Original assignee: SHANGHAI BIOCHIP CO Ltd
Current assignee: SHANGHAI BIOCHIP CO Ltd
Priority date: 2011-10-28
Filing date: 2011-10-28
Publication date: 2013-05-15
Anticipated expiration: 2031-10-28
Also published as: CN103103248B

Abstract

本发明公开了一种检测基因点突变的液相芯片，包括：针对基因突变位点设计的引物对、微球、以及信号报告分子，该引物对中，正向引物3’端最后一个碱基与待检测基因突变位点的碱基互补，与野生型基因不互补，该正向引物序列中还人工引入的一个与突变型和野生型基因均不互补的碱基，该正向引物与微球通过连接臂相连接；反向引物与突变型基因完全互补，其5’端标记有信号报告分子。本发明还公开了检测基因点突变的方法，包括步骤：针对基因突变位点设计上述引物对；用该引物对在油包水乳液中对待检测突变基因进行扩增；检测微球表面的荧光信号。本发明检测基因点突变的液相芯片和方法，显著提高了大量野生型基因背景下低丰度基因点突变的检测灵敏度。

Description

检测基因点突变的液相芯片和方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种检测基因点突变的液相芯片和方法。

背景技术

随着人类基因组计划研究进展，越来越多的证据表明基因突变在人类疾病中具有重要作用，通过对基因突变的检测，可以对疾病进行有效的预防、诊断和治疗。基因突变是指由于DNA碱基对的置换、增添或缺失而引起的基因结构的变化，它包括单个碱基改变所引起的点突变，或多个碱基的缺失、重复和插入，其中以点突变最为常见。

点突变所造成的基因理化特性改变甚微，无疑使点突变的检测非常困难。特别是当待检测的突变基因丰度较低，且存在于大量未发生突变的野生型基因背景中时，对点突变的检测变得更加困难。传统的基因点突变检测方法操作复杂，测定结果需经电泳、测序获得，费时繁琐，且特异性、敏感性差。

液相芯片技术的出现提高了基因点突变的检测灵敏度，其原理是将与待检测突变基因互补的一段寡核苷酸序列固定在微球表面，通过微球表面寡核苷酸与突变基因的反向杂交过程，检测突变基因。相比将寡核苷酸序列固定在玻片表面的传统生物芯片，液相芯片更有利于提高待检测基因与寡核苷酸的杂交效率。但是，如果检测样本中存在大量未发生突变的野生型基因时，由于野生型基因与寡核苷酸间的竞争杂交反应，使得直接通过液相芯片反向杂交方法检测低丰度点突变基因难以实现。在这种情况下，需要通过扩增反应提高突变基因的丰度。然而，由于大量野生型基因背景的存在，普通的聚合酶链式反应(PCR)不仅无法提高突变基因的相对丰度，反而可能进一步降低检测样本中突变基因的比例。因此，本领域迫切需要一种检测低丰度基因点突变的液相芯片和方法。

发明内容

本发明要解决目前基因点突变检测灵敏度不高、检测过程易受样本中野生型基因干扰的技术问题，提供一种检测基因点突变的液相芯片，该液相芯片适用于大量野生型基因背景下低丰度点突变基因的检测。

此外，还需要提供一种检测基因点突变的方法，该方法显著提高了突变基因的检测灵敏度。

为了解决上述技术问题，本发明通过如下技术方案实现：

在本发明的一个方面，提供了一种检测基因点突变的液相芯片，包括：针对基因突变位点设计的引物对、微球、以及信号报告分子；

所述引物对中的正向引物具有下述式I所示的结构：

5’-S2-B2-S1-B1-3’(式I)，

式I中，

B1表示正向引物3’端最后一个碱基，该碱基与待检测基因突变位点的碱基互补，与野生型基因不互补；

B2表示人工引入的一个与突变型和野生型基因均不互补的碱基；

S1表示与突变型基因互补的结合区3’端序列，长度为0-4bp；

S2表示与突变型基因互补的结合区5’端序列，长度为10-39bp；

该正向引物5’端设有连接臂，用于与微球相连接；

所述引物对中的反向引物与突变型基因完全互补，其5’端标记有信号报告分子。

优选的，所述S1序列的长度为1-2bp。

所述连接臂的序列选自下述任意一种：长度为10-30bp的多聚A、长度为10-30bp的多聚T、或长度为6-12个碳原子的序列。

所述反向引物的长度为15-40bp；该反向引物5’端标记的信号报告分子包括：生物素、地高辛、核酸适配体、或荧光染料分子。

在本发明的另一方面，还提供了一种检测基因点突变的方法，包括以下步骤：

针对基因突变位点设计权利要求1所述的引物对，该引物对中的正向引物与微球通过连接臂相连接，反向引物的5’端标记信号报告分子；

用所述引物对在油包水乳液中对待检测突变基因进行扩增；

检测微球表面的荧光信号，得检测结果。

在本发明中，突变基因的扩增在油包水乳液中进行。油包水乳液由水相和油相组成，水相的体积比为10-35％(v/v)，其中包括待检测的突变基因、特异性引物，以及其它基因扩增所需的反应物。油相由一种或多种有机烃类组成，体积比为65-90％。将水相滴加入油相中，并通过外力使之混合均匀，形成平均粒径为5-10μm的油包水乳液滴。在形成的油包水液滴中，至少有一部分液滴内同时包含待检测的一条突变基因、一个微球，液滴内还包括若干特异性引物，以及其它基因扩增所需的反应物。液滴内的突变基因经过扩增后，在微球表面形成的突变基因的扩增产物的长度为80-120bp，且带有信号报告分子。通过上述扩增过程，检测样本中起始的突变分子数量被转化成了发生扩增的微球数量。再通过流式细胞仪检测微球表面的信号报告分子即可检测出样本中是否包含突变基因，以及表面发生扩增的微球数量，从而获得样本中突变基因的相对含量。

本发明检测基因点突变的液相芯片，对现有的液相芯片技术进行了改进，在油包水乳液中，通过设计的特异性引物有效地扩增了样本中的低丰度突变基因，排除了野生型基因背景的影响，将突变的数量转化为发生扩增的微球数量，实现了微量突变的定量检测，同时显著提高了突变基因检测灵敏度，增强了检测信号的信噪比，使得检测结果更加准确可靠。

附图说明

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。

图1是本发明基于液相芯片的检测基因点突变的方法示意图；

图2是本发明针对基因突变位点设计的引物对与突变基因模板结合示意图；

图3是本发明实施例1流式细胞仪得到的突变比例(MT％)与PE荧光阳性区磁珠比例(M2％Gated)间的线性相关图；

图4是本发明实施例2流式细胞仪得到的突变比例(MT％)与CY5荧光阳性区磁珠比例(M2％Gated)间的线性相关图；

图5是本发明实施例3中采用等位基因特异性延伸反应(ASPE)与采用本发明方法时对样本中低丰度突变基因的检测结果比较图。

具体实施方式

为了提高大量野生型基因背景下低丰度基因点突变的检测灵敏度，本发明研制出了检测基因点突变的液相芯片，包括：针对基因突变位点设计的引物对、微球、以及信号报告分子；引物对中的正向引物具有下述式I所示的结构：

5’-S2-B2-S1-B1-3’(式I)，

式I中，

S1表示与突变型基因互补的结合区3’端序列，长度为0-4bp；

S2表示与突变型基因互补的结合区5’端序列，长度为10-39bp；

该正向引物5’端设有连接臂，用于与微球相连接；

引物对中的反向引物与突变型基因完全互补，其5’端标记有信号报告分子。

如图1所示，本发明基于液相芯片的检测基因点突变的方法，包括以下步骤：

针对基因突变位点设计上述引物对，该引物对中的正向引物包被于微球表面，正向引物与微球通过连接臂相连接，反向引物的5’端标记信号报告分子；

用上述引物对在油包水乳液中对待检测突变基因进行扩增，扩增反应在微球表面进行，连接在微球表面的正向引物与突变型DNA模板结合并进行扩增(见图2)，突变型基因在微球表面大量扩增，而野生型基因在微球表面基本不扩增，突变型基因的扩增产物连接在微球表面，其长度为80-120bp，且该扩增产物带有信号报告分子；

用流式细胞仪等光学检测方法检测微球表面的荧光信号，得检测结果。

实施例1本发明液相芯片对样本的检测

1.一对特殊设计的特异性引物

针对P53基因的常见突变位点Y220C，设计一对特异性引物，其结构如下：

其中正向引物包被在微球表面，其3’端第一个碱基C与待检测基因突变位点的碱基互补，与野生型基因不互补；3’端第3个碱基A是人工引入的一个与突变型和野生型基因均不互补的碱基；5’端的10碱基A是引物序列与微球之间的连接臂。反向引物的5’端修饰有生物素(Biotin)，作为信号报告分子。

2.油包水乳液中突变基因的扩增

(1)水相的体积为72μl，其中所含的扩增反应物如下表所示：

其中所用的酶为Takara公司提供的热启动Taq酶，以及附属的PCR缓冲液、dNTP混合液；待检测基因是混合在野生型基因中的突变型P53基因，其含量为0.1-1％。磁性微球的平均粒径为1μm，表面包被的正向引物浓度约为0.2nmol/mg磁性微球。

(2)油相的各组成成份由ABI公司的emPCR试剂盒提供，各成份的体积比例如下表所示：

将上述成份混合后，以1400rpm速度涡旋混合5分钟，然后静置20分钟左右，待用。

(3)将72μl水相溶液滴加到120μl混合好的油相中，同时以1500rpm涡旋混合，3分钟加完水相，然后继续2000rpm涡旋混合2分钟。

(4)将形成的微乳液加入到PCR管中，约60μl/管，并按以下升降温程序进行扩增反应：

(5)在反应后的PCR管中各加入20μl的2-丁醇，用枪吹打后将乳液收集到1.5ml离心管中，6000rpm离心1分钟，小心的抽取出上层半透明油状液体；

(6)再加入100μl的2-丁醇，混合均匀，磁力沉降，除去上清液；

(7)小心的吸去上清液，再加入100μl的杂交液(其各成份配比为：0.2M NaCl，0.1MTris，0.08％Triton X-100，pH 8.0)，混合均匀后将微球悬浮液移入新的1.5ml离心管中，磁力沉降，弃上清，用100μl杂交液洗涤磁性微球一次，弃去上清液，待用；

(8)将链霉亲和素(Streptavidin，SA)标记的藻红素(Phycoerythrin，PE)，用杂交液配制成浓度为2μg/ml的溶液(以下简称为SA-PE)；

(9)取经步骤(7)处理的磁性微球，在暗室中加入50μl SA-PE溶液，并混合均匀；在避光条件下，于37℃温度中反应20分钟，反应过程中保持溶液不断搅动；

(10)在暗室中磁力沉降磁性微球，用50μl杂交液洗涤3次，然后用100μl杂交液重悬磁性微球，用于流式细胞检测。

检测结果如图3所示，图3是流式细胞仪得到的检测样本中突变基因比例(MT％)与PE荧光阳性区磁珠比例(M2％Gated)间的线性相关图，由该图可知，样本中突变基因的数量与流式细胞仪检测的PE荧光阳性区磁珠比例间存在较好的线性关系，随着样本中突变基因比例的升高，荧光阳性磁珠比例也随之升高，因此通过荧光阳性磁珠的比例即可推算出样本中突变基因的比例。此外，样本中突变基因比例为0.1％时(突变型基因/野生型基因)，流式细胞仪检测到的荧光阳性磁珠比例显著高于纯野生型基因对照样本中阳性磁珠的比例，表明本方法可有效减少检测样本中大量野生型基因对突变基因检测的干扰，对样本中突变基因的检测灵敏度可达到0.1％，具有很好的应用前景。

实施例2本发明液相芯片对样本的检测

1.一对特殊设计的特异性引物

其中正向引物包被在微球表面，其3’端第一个碱基C与待检测基因突变位点的碱基互补，与野生型基因不互补；3’端第3个碱基A是人工引入的一个与突变型和野生型基因均不互补的碱基；5’端的6个碳原子(C6)是引物序列与微球之间的连接臂。反向引物的5’端修饰有CY5荧光素，作为信号报告分子。

2.油包水乳液中突变基因的扩增

(1)水相的体积为100μl，其中所含的扩增反应物如下表所示：

其中所用的酶为Takara公司提供的热启动Taq酶，以及附属的PCR缓冲液、dNTP混合液；待检测基因是混合在野生型基因中的突变型P53基因，其突变型基因的含量为0.1-1％。磁性微球的平均粒径为1μm，表面包被的正向引物浓度约为0.2nmol/mg磁性微球。

(2)油相的各组成成份如下表所示。其中ABIL EM 90(十六烷基二甲基矽氧烷共聚物)由EVONIK公司提供，Triton X-100和矿物油(Mineral Oil)由Sigma试剂公司提供。

(3)将100μl水相溶液滴加到900μl混合好的油相中，同时以1500rpm涡旋混合，3分钟加完水相，然后继续2000rpm涡旋混合2分钟。

(7)小心的吸去上清液，再加入100μl的杂交液(其各成份配比为：0.2M NaCl，0.1MTris，0.08％Triton X-100，pH 8.0)，混合均匀后将微球悬浮液移入新的1.5ml离心管中；

(8)磁力沉降，弃上清，用100μl杂交液洗涤磁性微球一次，弃去上清液，最后用100μlTm杂交液重悬磁性微球，用于流式细胞检测。

检测结果如图4所示，图4是流式细胞仪得到的检测样本中突变基因比例(MT％)与CY5荧光阳性区磁珠比例(M2％Gated)间的线性相关图，由该图可知，样本中突变基因的数量与流式细胞仪检测的CY5荧光阳性区磁珠比例间存在较好的线性关系，通过荧光阳性磁珠的比例即可推算出样本中突变基因的比例。当样本中突变基因比例为0.1％(突变型基因/野生型基因)时，流式细胞仪检测到的荧光阳性磁珠比例显著高于纯野生型基因对照样本中阳性磁珠的比例，对样本中突变基因的检测灵敏度可达到0.1％，具有很好的应用前景。

实施例3本发明与等位基因特异性引物延伸法的比较实验

等位基因特异性引物延伸法(Allele specific primer extension，ASPE)，是检测基因点突变的常用方法，其原理是利用PCR过程中引物3’末端的碱基对产物延伸的决定性作用，设计一条特殊的引物，将突变与正常等位基因所不同的那个碱基安排在引物的3’最末端，使得引物与突变型基因完全配对，引物结合突变基因模板后发生延伸反应；而引物的3’最末端碱基与野生型基因为错配，结合野生型基因模板后不发生延伸反应，通过检测延伸产物即可检测样本中是否含有突变型基因。

本实施例比较了本发明与ASPE方法在检测基因点突变时的灵敏度。为了便于与本发明的检测结果进行直观比较，在ASPE反应后通过磁珠捕获了延伸产物并利用流式细胞仪进行了检测。

1.本发明检测基因点突变的实验过程如实施例1所示。

2.ASPE方法检测基因点突变的实验过程如下：

(1)延伸反应：通过在反应物中掺入Biotin-dCTP的方式，为下一步流式细胞仪荧光检测作准备。延伸反应中各反应物的浓度如下所示：

反应条件为：94℃2分钟，30个循环(94℃30秒，55℃1分钟，72℃1分钟)，72℃5分钟。

其中所用的TSP聚合酶、PCR缓冲液、dNTP混合液以及Biotin-dCTP均为Invitrigen公司提供，待检测基因是混合在野生型基因中的突变型P53基因，其突变型基因的含量为0.1-1％。为了便于后续ASPE延伸产物的分离，ASPE引物的5’端加入了一段与目标序列无关的Tag序列，ASPE引物和Tag的序列如下表所示：

(2)延伸产物的分离与荧光标记

在粒径为3μm的磁珠表面偶联与Tag序列互补的Anti-Tag寡核苷酸片段，磁珠表面Anti-Tag的浓度约为2nmol/(mg磁珠)，磁珠分散在2倍浓度的杂交液中，磁珠的浓度为(2μg/μl)。磁珠为西大北美基因公司提供，杂交液的成分为0.2M NaCl，0.1M Tris，0.08％Triton X-100，pH 8.0。

在ASPE延伸产物中加入50μg表面接有与Tag序列互补(Anti-Tag)的磁珠。将上述反应物置于37℃杂交炉中杂交30分钟。杂交过程完毕后，磁力沉降，弃去上清液，分离出磁珠，用50μl杂交液洗两次。

然后再向分离出的磁珠中加入50μl分散在杂交液中，浓度为2μg/ml链霉亲和素标记的藻红素(SA-PE)。将上述反应物置于37℃杂交炉中反应30分钟，磁力沉降，弃去上清液，收集磁珠，用50μl杂交液洗涤磁珠两次，最后用50μl杂交液重悬磁珠，4℃保存待测。

两种方法对点突变基因的检测结果如图5所示，横坐标代表检测样本中突变基因比例(MT％)，纵坐标代表PE荧光呈阳性的磁珠比例(M2％Gated)。由该图可知，当检测样本中突变型基因的比例低于1％时，采用ASPE方法检测的样本信号与纯野生型基因(WT)的信号没有显著的差异(图5A)。而采用本发明方法时，可以检测出样本中含量仅为0.1％的突变基因信号，与纯野生型的信号存在显著差异(图5B)。表明本发明提供的方法在检测过程中不受样本中大量野生型基因的干扰作用，为检测低丰度基因点突变提供了一种实用、可靠、灵敏的新方法。

以上所述实施例仅表达了本发明的实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims

1.一种检测基因点突变的液相芯片，其特征在于，包括：针对基因突变位点设计的引物对、微球、以及信号报告分子；

所述引物对中的正向引物具有下述式I所示的结构：

5’-S2-B2-S1-B1-3’(式I)，

式I中，

S1表示与突变型基因互补的结合区3’端序列，长度为0-4bp；

S2表示与突变型基因互补的结合区5’端序列，长度为10-39bp；

该正向引物5’端设有连接臂，用于与微球相连接；

2.根据权利要求1所述的液相芯片，其特征在于，所述S1序列的长度为1-2bp。

3.根据权利要求1所述的液相芯片，其特征在于，所述连接臂的序列选自下述任意一种：长度为10-30bp的多聚A、长度为10-30bp的多聚T、或长度为6-12个碳原子的序列。

4.根据权利要求1所述的液相芯片，其特征在于，所述反向引物的长度为15-40bp。

5.根据权利要求1所述的液相芯片，其特征在于，所述信号报告分子包括：生物素、地高辛、核酸适配体、或荧光染料分子。

6.一种检测基因点突变的方法，其特征在于，包括以下步骤：

用所述引物对在油包水乳液中对待检测突变基因进行扩增；

检测微球表面的荧光信号，得检测结果。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述油包水乳液由水相和油相组成，水相的体积比为10-35％，油相的体积比为65-90％。

8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于，所述油包水乳液的液滴平均粒径为5-10μm。

9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述扩增产物的长度为80-120bp。