CN105452486B - 用于差分检测的嵌入染料 - Google Patents

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Abstract

提供了用于检测和定量核酸序列的方法和组合物。

Description

用于差分检测的嵌入染料
相关申请的交叉参考
本申请要求于2014年1月10日提交的美国临时申请61/926,172号的优先权，该文的全部内容通过引用纳入本文用于所有目的。
背景技术
可检测或定量核酸以搜索有用的基因、诊断疾病或鉴定生物体。设计为检测或定量核酸的分子方法可用于检测突变、检测稀有核酸、定量基因表达、测量RNA稳定性等。这类分子方法可用于确定核酸的相对比例。例如，分子方法可用于确定与样品中野生型核酸的丰度相比突变或多态性核酸的丰度。
用于检测或定量核酸的方法和组合物包括数字方法，其中样品被分为多个混合物划分产物并确定各划分产物中是否存在一种或多种感兴趣的核酸。在一些情况中，两种或多种检测试剂或探针被用于检测划分产物中两种或多种感兴趣的核酸。在这类情况中，探针或其他检测试剂的交叉反应性可使得难以明确地检测或定量感兴趣的核酸。例如，当一种感兴趣的核酸比另一种更普遍时，例如当一种核酸代表野生型序列且另一种代表突变时，检测试剂的交叉反应性可造成特别的困难。当一种感兴趣的核酸与另一种非常类似时，交叉反应性也可造成特别的困难。
发明内容
在一些实施方式中，本发明提供一种核酸序列检测方法，包括：提供包含DNA或RNA核酸的样品；将所述样品划分为一组混合物划分产物；使用序列特异性检测试剂检测划分产物中是否存在靶核酸；以及使用非特异性检测试剂检测划分产物中是否存在双链核酸，从而检测划分产物中靶核酸与总核酸的比率。
在一些方面中，在检测前扩增核酸。在一些情况中，该非特异性检测试剂是标记的核苷三磷酸，且检测是否存在双链核酸的步骤包括在扩增后洗去未掺入的标记的核苷三磷酸。例如，该非特异性检测试剂是在扩增步骤期间掺入至一个或多个结构上不同的扩增子中的标记的核苷三磷酸，且检测是否存在双链核酸的步骤包括在扩增后洗去未掺入的标记的核苷三磷酸，并检测一个或多个结构上不同的扩增子中掺入的标记物。
在一些方面中，该非特异性检测试剂是嵌入染料。例如，该嵌入染料可选自：EvaGreen、picogreen、溴化乙啶、SYBR Green I、SYBR Gold、Yo-Yo、Yo-Pro、TOTO、BOXTO和BEBO。在一些方面中，该序列特异性检测试剂选自结构化探针(structured probe)和线性探针。在一些情况中，该结构化探针选自分子信标和蝎型探针(scorpion probe)。在一些情况中，该线性探针选自杂交探针和水解探针。
在一些方面中，该非特异性检测试剂是检测总双链核酸的引物(或引物的混合物，如随机引物的混合物)。
在前述实施方式、方面或情况的任一种的一个方面中，该核酸是RNA，且该方法还包括逆转录该RNA核酸。
在前述实施方式、方面或情况的任一种的一个方面中，该方法包括扩增两种或多种潜在的扩增子。在一些方面中，在存在双链核酸的混合物划分产物中，潜在的扩增子之一的量为小于50％、40％、30％、20％、10％、5％、1％、0.5％、0.1％、0.05％、0.01％或更少。在一些情况中，该序列特异性检测试剂检测一种特异性扩增子，且该非序列特异性检测试剂检测任何扩增子。
在前述实施方式、方面或情况的任一种的一个方面中，该序列特异性检测试剂检测序列变体。在一些情况中，该序列变体是稀有序列变体。在一些情况中，双链核酸存在于多个混合物划分产物中，且该稀有序列变体存在于小于约50％、40％、30％、20％、10％、5％、1％、0.5％、0.1％、0.05％、0.01％或更少的混合物划分产物中。
在前述实施方式、方面或情况的任一种的一个方面中，该方法包括通过对混合物划分产物数目进行计数来确定总核酸浓度，所述混合物划分产物中非特异性检测试剂检测到核酸或检测到扩增的核酸。在一些情况中，该方法还包括通过对混合物划分产物数目进行计数来确定靶核酸序列浓度，所述混合物划分产物中序列特异性检测试剂检测到核酸或检测到扩增的核酸。在一些情况中，该方法还包括确定其中序列特异性检测试剂检测到核酸(如扩增的核酸)的混合物划分产物与其中非序列特异性检测试剂检测到核酸(如扩增的核酸)的混合物划分产物的比率，该比率表示样品中包含靶核酸的核酸比例。在一些情况中，该方法还包括报告该比率。
在一个实施方式中，本发明提供一种核酸序列检测方法，包括：提供包含DNA或RNA核酸的样品，该DNA或RNA核酸包含第一靶标和第二靶标；将所述样品划分为一组混合物划分产物；以及使用结合第一靶标(如果存在)的特异性检测试剂(如特异性检测第一靶标而非第二靶标)和结合并从而检测两种靶标(如果存在)的非特异性检测试剂来检测至少一个混合物划分产物中的第一靶标和第二靶标；从而确定样品中第一靶标的浓度以及第一和第二靶标的浓度。
在一个方面中，该方法还包括在混合物划分产物中扩增这些靶标；检测包括检测第一和第二靶标的扩增；且该特异性检测试剂结合代表第一靶标的扩增子(例如特异性结合并从而检测第一靶标而非第二靶标的扩增子)且该非特异性检测试剂结合并从而检测代表第一和/或第二靶标的扩增子。
在一个方面中，该检测包括在至少一个混合物划分产物中确定是否存在第一靶标且确定是否存在第一或第二靶标。在一些情况中，对多种混合物划分产物进行检测。在一些情况中，该方法还包括确定包含第一靶标的混合物划分产物与包含第一或第二靶标的混合物划分产物的比率。在一些情况中，该方法还包括报告该比率。
在一个方面中，该第一靶标是突变体或多态性且该第二靶标是野生型核苷酸序列。
在一个实施方式中，本发明提供了一种包含少于约100nL的混合物划分产物的组合物，其包含：包含DNA或RNA的核酸；非特异性检测试剂；和序列特异性检测试剂。在一个方面中，该组合物还包含扩增试剂。在一个方面中，该非特异性检测试剂选自：EvaGreen、溴化乙啶、SYBR Green I、SYBR Gold、Yo-Yo、Yo-Pro、TOTO、BOXTO和BEBO。该非特异性检测试剂可以是检测总双链核酸的引物。该非特异性检测试剂可以是标记的核苷三磷酸。该序列特异性检测试剂可选自分子信标、蝎型探针、杂交探针和水解探针。
在一个实施方式中，本发明提供了一组混合物划分产物，其中，多个混合物划分产物包含前述组合物之一。在一些情况中，该组包含至少约100、200、500或1000个混合物划分产物。在一些情况中，多个混合物划分产物包含双链核酸。在一些情况中，大多数包含双链核酸的混合物划分产物不包含靶核酸。在一些情况中，该靶核酸是序列变体。
附图简要说明
图1：描述了通过使用两种序列特异性探针的数字液滴PCR检测含有DNA分子群体的样品中稀有SNP的典型实验。其中未检测到野生型或稀有变体的液滴表示为“--”且归类在左下象限。其中仅检测到野生型核酸的液滴表示为“+-”且归类在右下象限。其中检测到野生型和稀有变体的液滴表示为“++”且归类在右上象限。其中仅检测到稀有变体的液滴表示为“-+”且归类在左上象限。
图2：描述了通过使用一种序列特异性探针和一种非特异性探针的数字液滴PCR检测含有DNA分子群体的样品中稀有SNP的实验。其中未检测到野生型或稀有变体的液滴表示为“--”且归类在左下象限。其中仅检测到野生型核酸的液滴表示为“+-”且归类在右下象限。其中检测到野生型和稀有变体的液滴表示为“++”且归类在右上象限。其中仅检测到稀有变体的液滴表示为“-+”且也归类在右上象限。
定义
除非另外定义，本文中使用的技术和科学术语具有本领域普通技术人员通常所理解的同样含义。参见例如Lackie，DICTIONARY OF CELLANDMOLECULAR BIOLOGY(《细胞分子生物学词典》)，埃尔斯威尔出版社(Elsevier)(第4版2007)；Sambrook等，MOLECULARCLONING,ALABORATORY MANUAL(《分子克隆，实验室手册》)，冷泉港实验室出版社(冷泉港，纽约1989)。术语“一个”或“一种”意在表示“一个(种)或多个(种)”。当术语“包含”及其各种变体例如“包括”和“含有”位于叙述步骤或要素之前时，是用来表示添加其它的步骤或要素是任选的，并且是非排它性的。本发明的实践中可以使用与本文所述类似或等价的任何方法、装置和材料。提供的以下定义是用来帮助理解本文经常用到的某些术语，且不对本发明的范围构成限制。
本文所用术语“划分”或“划分的”指将样品分为多个部分或多个“划分产物”。划分产物可以是固体或流体。在一些实施方式中，划分产物是固体划分产物，例如微米或纳米通道。在一些实施方式中，划分产物是流体划分产物，例如液滴。在一些实施方式中，流体划分产物(如液滴)是不互溶的流体(如水和油)的混合物，或乳液。在一些实施方式中，流体划分产物(如液滴)是水性液滴，其被不互溶的运载体流体(如油)包围。在其它实施方式中，流体划分产物是与相邻水性液滴在物理或化学上分开的水性液滴，使得一个液滴中的核酸、缓冲剂、盐或其他分子不会扩散到相邻液滴中。
术语“检测试剂”指与靶分子相互作用或结合靶分子(如核酸)的分子(例如染料、蛋白质、核酸、适体等)。与靶分子相互作用或结合靶分子的分子的非限制性示例包括染料(如嵌入染料)、核酸(如寡核苷酸)、蛋白质(如抗体、转录因子、锌指蛋白、非抗体蛋白支架等)和适体。
术语“序列特异性检测试剂”指特异性结合特定序列或特异性检测特定序列的分子(例如核酸、蛋白质、适体等)。在一些实施方式中，序列特异性检测试剂可与非靶核酸具有交叉反应性。
术语“特异性结合”或“与……特异性相互作用”指检测试剂(如寡核苷酸、适体或抗体)与靶序列的结合亲和力比一种或多种非靶序列高至少2倍，例如至少4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、25倍、50倍、100倍或1000倍或更高。本文中，较高的亲和力可测量为例如较低的解离常数(Kd)。例如，特异性结合特定靶核酸的检测试剂将通常以与一种或多种非靶核酸相比高至少10倍的亲和力结合靶核酸(例如，Kd是与非靶核酸的Kd的1/10)。在一些情况中，该非靶核酸包括与靶核酸基本类似的核酸。例如，在一些情况中，该非靶核酸包括与靶核酸相差约1个核苷酸(例如相差1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个核苷酸)的核酸。作为另一个示例，该非靶核酸可包括与靶核酸基本类似的保守区域或结构域和基本不同的其他区域或结构域。在一些方面中，该非靶核酸包括与靶核酸基本不同的核酸。在一些情况中，特异性结合特定靶核酸的检测试剂将与该靶核酸杂交，其解链温度比与非靶核酸杂交时的解链温度高至少0.5、1、2、5、10、15、20或25℃。
在一些情况中，“特异性结合”或“与……特异性相互作用”指在复合混合物中结合并检测靶序列但基本不结合或检测非靶序列的检测试剂(如寡核苷酸、适体或抗体)。例如，特异性结合靶序列的检测试剂可不检测或基本不检测包含生物体或样品的基因组或转录组的细胞裂解物或核酸制备物中存在的非靶核酸。
术语“非特异性检测试剂”指结合或检测总体核酸(例如总核酸、总扩增的核酸、总逆转录的核酸、总DNA或总双链核酸)的分子。例如，非特异性检测试剂可包括结合核酸的染料，如嵌入染料。或者，非特异性检测试剂可包括结合或检测掺入至核酸的通用序列的核苷酸。例如，可通过一种或多种含有可检测序列的引物来扩增样品中的核酸。该非特异性检测试剂可检测扩增反应期间纳入的可检测序列。在一些情况中，该非特异性检测试剂可区分经扩增和未扩增的核酸。在其他情况中，该非特异性检测试剂可区分单链和双链核酸。在一些情况中，该非特异性检测试剂可区分DNA和RNA。在一些情况中，该非特异性检测试剂在结合核酸时发荧光或增加荧光。
术语“标记物”和“可检测标记物”可互换地指可通过光谱、光化学、生物化学、免疫化学、化学或其它物理手段检测的组合物。例如，可用的标记物包括荧光染料、发光剂、放射性同位素(如32P、3H)、高电子密度试剂、酶、生物素、地高辛或半抗原以及可被检测的蛋白质、核酸或其他实体，例如通过将放射性标记物掺入至与靶分子特异性反应的抗体、肽或寡核苷酸中。可以采用本领域已知的用于使寡核苷酸偶联所述标记物的任何方法，例如，使用如下文献中所述的方法：Hermanson，《生物偶联技术》(Bioconjugate Techniques)1996，圣迭戈的学术出版社有限公司(Academic Press，Inc.)。
“连接”至标记物的分子(例如本文所述经标记探针)是共价(通过接头或化学键)或非共价(通过离子、范德华力、静电或氢键)地结合标记物的分子，从而可通过检测与该分子结合的标记物来检测是否存在该分子。
“嵌入染料”指嵌入双链核酸(如双链DNA)的分子。在一些实施方式中，嵌入染料发荧光。在一些情况中，与在溶液中游离时的荧光相比，嵌入染料在结合核酸时的荧光增加。多种嵌入染料是本领域已知的。一些非限制性示例包括：9-氨基吖啶、溴化乙啶、菲啶染料、EvaGreen、PICO GREEN(P-7581，分子探针公司(Molecular Probes))、EB(E-8751，西格玛公司(Sigma))、碘化丙啶(P-4170，西格玛公司)、吖啶橙(A-6014，西格玛公司)、噻唑橙、噁唑黄、7-氨基放线菌素D(A-1310，分子探针公司)、花青染料(如TOTO、YOYO、BOBO和POPO)、SYTO、SYBR Green I(美国专利号5,436,134：N',N'-二甲基-N-[4-[(E)-(3-甲基-1,3-苯并噻唑-2-亚基)甲基]-1-苯基喹啉-1-鎓-2-基]-N-丙基丙烷-1,3-二胺)、SYBR Green II(美国专利号5,658,751)、SYBR DX、OliGreen、CyQuant GR、SYTOX Green、SYTO9、SYTO10、SYTO17、SYBR14、FUN-1、DEAD Red、碘化己啶、溴化乙啶、二氢乙啶、溴乙啡锭二聚体、9-氨基-6-氯-2-甲氧基吖啶、DAPI、DIPI、吲哚染料、咪唑染料、放线菌素D、羟芪巴脒、LDS 751(美国专利号6,210,885)，以及以下文献中描述的染料：Georghiou,Photochemistry andPhotobiology(《光化学和光生物学》)，26:59-68，培格曼出版公司(Pergamon Press)(1977)；Kubota等，Biophys.Chem.,6:279-284(1977)；Genest等，Nuc.Ac.Res.,13:2603-2615(1985)；Asseline,EMBO J.,3:795-800(1984)；Richardson等，美国专利号4,257,774；以及Letsinger等，美国专利号4,547,569。
“Sybr Green I”指N',N'-二甲基-N-[4-[(E)-(3-甲基-1,3-苯并噻唑-2-亚基)甲基]-1-苯基喹啉-1-鎓-2-基]-N-丙基丙烷-1,3-二胺。
发明详述
引言
核苷酸序列的分子检测通常受限于试验的特异性。例如，检测试剂可结合靶核苷酸且还与非靶核苷酸交叉反应。这类交叉反应性代表同时差分检测两种核酸期间的困难。此外，当一种感兴趣的核酸在序列上非常类似于另一种感兴趣的核酸时，难以避免交叉反应性。
其中样品被划分为一组小混合物划分产物并随后检测核苷酸的数字方法还可与交叉反应的检测试剂混淆。此外，当一种感兴趣的核酸是常见的且浓度显著高于待检测的另一种稀有核苷酸(例如高2、3、4、5、6、7、10、15、20、25、30、50、100、200、400、500、1000、10000倍或更高)时，难以区分同时含有常见和稀有核苷酸的划分产物与仅含有常见核苷酸的划分产物。例如，为确保适当数目的含有稀有核苷酸的划分产物，可以每个划分产物高浓度的核苷酸样品加载各划分产物。所得划分产物中许多可含有高浓度的常见序列且很少或没有核苷酸含有稀有序列。
在一些情况中，检测试剂的交叉反应性和/或两种靶核苷酸浓度的巨大差异可导致对应于常见序列的一个检测通道中的强信号和对应于稀有序列的第二检测通道中的弱信号。此外，同时含有常见(如野生型)序列和稀有序列的划分产物簇(++)可扩散到接触仅常见(如野生型)划分产物(+-)的扩散云(diffuse cloud)。这可导致难以区分仅含有常见序列的划分产物与同时含有常见和稀有序列的划分产物(如图1所示)。具体而言，在图1中箭头附近聚集的划分产物难以明确地归类为++或+-。
包括划分步骤的用于同时检测或定量多种感兴趣的核酸的方法可通过使用一种序列特异性检测试剂和一种非特异性检测试剂测试划分产物来改进。这类方法可提供测量各划分产物中是否存在对应于序列特异性检测试剂的靶核酸和各划分产物中是否存在总核酸(如总核酸、总扩增的核酸、总逆转录的核酸、总DNA或总双链核酸)的能力，如图2所示。含靶核酸的划分产物数目可对应于含稀有物质(如突变、序列变体或多态性)的划分产物数目。此外，含有总核酸的划分产物数目可对应于含有稀有物质的划分产物数目加含有常见物质的划分产物数目(例如含有具有突变序列的核酸、野生型核酸或上述两者的划分产物数目)。在一些实施方式中，可随后通过将其中序列特异性检测试剂检测到存在靶核酸的划分产物数目除以其中非特异性检测试剂检测到存在核酸的划分产物数目来计算稀有物质的相对比例。
例如，在使用检测稀有序列变体的序列特异性检测试剂和检测总核酸的非特异性检测试剂(如嵌入染料)对液滴进行数字检测后，含有稀有变体的液滴百分比可计算为％v＝[v]/([wt]+[v])。在该情况中，v表示序列变体(例如突变或多态性，如单核苷酸多态性(SNP))，wt表示野生型，且括号对应于浓度或含有括号中物质的液体相对数目。例如，[v]可对应于其中序列特异性检测试剂检测到变体的液滴数目，且([wt]+[v])可对应于其中非特异性检测试剂检测到核酸的液滴数目。
在一些实施方式中，本发明提供了用于定量稀有核酸的相对比例的方法、组合物和试剂盒。这类方法、组合物和试剂盒可用于诊断疾病或确定靶细胞(如癌细胞)的丰度。
组合物
样品
本文所述的方法和组合物可用于检测任何类型样品中的核酸。在一些实施方式中，该样品是生物样品。生物样品可获自任何生物体，例如动物、植物、真菌、细菌或任何其他生物体。在一些实施方式中，该生物样品来自动物，例如哺乳动物(如人或非人灵长类动物、奶牛、马、猪、绵羊、猫、狗、小鼠或大鼠)、鸟(如鸡)或鱼。生物样品可以是获自生物体的任何组织或体液，例如血液，血液成分或血液产品(如血清、血浆、血小板、血红细胞等)，痰液或唾液，组织(如肾、肺、肝、心、脑、神经组织、甲状腺、眼、骨骼肌、软骨或骨组织)；培养的细胞，例如原代培养物、外植体、转化的细胞、干细胞、粪便、尿液等。
该样品可含有核酸。在一些实施方式中，该样品含有待使用序列特异性检测试剂检测的靶核酸。在一些情况中，该样品不含有待使用序列特异性检测试剂检测的靶核酸。在一些情况中，该样品可能含有待使用序列特异性检测试剂检测的靶核酸。在一些情况中，该样品含有靶核酸和非靶核酸的混合物。
可制备样品以改进靶核酸和/或总核酸的高效鉴定。例如，可对样品进行纯化、分段、分级、匀化或超声。在一些实施方式中，可从样品(如生物样品)中提取或分离核酸或含有核酸的子组分。在一些实施方式中，针对存在的一种或多种核酸或靶核酸富集该样品。在一些实施方式中，通过亲和方法(如免疫亲和富集)或通过杂交在样品中富集核酸或靶核酸。例如，可通过免疫亲和、离心或本领域已知的其他方法来针对靶核酸富集样品。
在一些实施方式中，使用尺寸选择(如除去非常小的片段或分子或非常长的片段或分子)在样品中富集靶核酸。在其他实施方式中，通过选择真核信使RNA的聚A尾来富集样品中的RNA分子。例如，可使该样品通过寡dT柱，并可洗脱富聚A RNA以用于进一步分析。
序列特异性检测试剂
适用于根据本文所述的方法的序列特异性检测试剂是与感兴趣的核酸特异性相互作用或特异性结合感兴趣的核酸的任何分子。同样地，本发明的序列特异性检测试剂可用于检测是否存在其结合的核酸序列。在一些情况中，该序列特异性检测试剂可区分相差例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个核苷酸的核酸。
例如，在一些情况中，序列特异性检测试剂可用于检测靶核酸序列且不或基本不检测或与相差例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个核苷酸的核酸交叉反应。在一些实施方式中，该序列特异性检测试剂可特异性结合或检测序列变体、突变或多态性。在一些情况中，该序列特异性检测试剂可结合或检测稀有序列。例如，在一些情况中，该序列特异性检测试剂结合或检测稀有核酸序列变体，所述稀有核酸序列变体在样品中的含量为少于含有野生型序列的划分产物的约10％、5％、1％、0.5％、0.1％、0.05％、0.01％、0.005％、0.001％、0.0005％、0.00001％或更少。例如，在一些情况中，该序列特异性检测试剂结合或检测稀有核酸序列变体，所述稀有核酸序列变体在样品中的含量为少于含有野生型序列的划分产物的约10％、5％、1％、0.5％、0.1％、0.05％、0.01％、0.005％、0.001％、0.0005％、0.00001％或更少，但其基本不结合或检测野生型序列。
在一些实施方式中，该样品在划分样品前与序列特异性检测试剂孵育。在一些实施方式中，该样品在划分样品后与序列特异性检测试剂孵育。在一些实施方式中，该序列特异性检测试剂存在于混合物中。含有序列特异性检测试剂的混合物可包含一种或多种缓冲剂(如水性缓冲剂)、一种或多种添加剂(例如封闭剂或生物防腐剂)、一种或多种扩增试剂(例如核苷酸、引物或聚合酶)，或一种或多种非特异性检测试剂。
在一些实施方式中，两种或更多种序列特异性检测试剂可特异性结合同一靶标(如果存在)(例如在同一靶标的不同位置或序列处)。例如，两种或更多种序列特异性检测试剂各自可结合同一基因的不同区域。在一些实施方式中，两种或更多种序列特异性检测试剂设计为特异性结合不同的靶核酸(如果存在)。例如，一种序列特异性检测试剂可结合或检测基因或其他感兴趣的核苷酸序列(如序列变体、突变或多态性)且另一序列特异性检测试剂可结合野生型序列或对照序列。在一些实施方式中，该样品在适用于两种或更多种序列特异性检测试剂特异性结合一种或多种靶标的条件下与两种或更多种序列特异性检测试剂孵育(例如在具有两种或更多种序列特异性检测试剂的混合物中)，从而结合一种或多种靶核酸。
在一些实施方式中，2、3、4、5或更多种序列特异性检测试剂是相同类型的分子(例如全部都是核酸)。在一些实施方式中，2、3、4、5或更多种序列特异性检测试剂中至少两种是相同类型的分子(例如至少两种是核酸)。在一些实施方式中，2、3、4、5或更多种序列特异性检测试剂是不同类型的分子(例如抗体和核酸)。
在一些实施方式中，该序列特异性检测试剂是肽、多肽或蛋白质。本文所用术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”可互换地指代两个或更多个氨基酸残基的聚合物。该术语应用于其中一个或多个氨基酸残基是相应天然产生氨基酸的人造化学模拟物的氨基酸聚合物，以及天然产生的氨基酸聚合物和非天然产生的氨基酸聚合物。在一些实施方式中，该序列特异性检测试剂是抗体。本文所用“抗体”指免疫球蛋白家族的多肽或包含能够非共价、可逆并以特异性方式结合相应抗原的免疫球蛋白的片段的多肽。
术语抗体也包括通过全抗体修饰，或用重组DNA方法从头合成所产生(例如，单链Fv)，或用噬菌体展示文库鉴定的抗体片段(参见如McCafferty等，Nature 348:552-554(1990))。制备抗体的方法是本领域已知的；参见例如Kohler和Milstein,Nature 256:495-497(1975)；Kozbor等，Immunology Today 4:72(1983)；Cole等，Monoclonal Antibodiesand Cancer Therapy(《单克隆抗体和癌症治疗》)，第77-96页，ARL公司(Alan R.Liss,Inc.)1985。在一些实施方式中，该序列特异性检测试剂是非抗体蛋白支架。本文所用“非抗体蛋白支架”指能够以高特异性结合鉴定特征的非免疫原性多肽。在一些实施方式中，该蛋白支架具有衍生自蛋白A、脂质运载蛋白、纤连蛋白结构域、锚蛋白共有重复结构域或硫氧还蛋白的结构。制备非抗体支架的方法是本领域已知的；参见例如Binz和Pluckthun,CurrOpinBiotechnol 16:459-469(2005)；Koide等，J MolBiol 415:393-405(2012)；以及Gilbreth和Koide,CurrOpinStructBiol 22:413-420(2012)。
在一些实施方式中，该序列特异性检测试剂是核酸。本文所用术语“核酸”和“多核苷酸”互换使用以表示脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸及其单链或双链形式的聚合物。基于核酸的检测试剂的示例描述于Juskowiak,Anal Bioanal Chem.2011年3月；399(9):3157–3176，其通过引用纳入本文。该术语包括含有已知核苷酸类似物或修饰的主链残基或连接的核酸，其可以是合成、天然产生的和非天然产生的，其与参比核酸具有相似结合性质，且以与参比核苷酸相似的方式代谢。这类类似物的例子包括但不限于：硫代磷酸酯、氨基磷酸酯(phosphoramidate)、膦酸甲酯、手性-膦酸甲酯、2-O-甲基核糖核苷酸、肽-核酸(PNA)。合成多核苷酸的方法是本领域已知的。参见例如Carruthers等，Cold Spring HarborSymp.Quant.Biol.47:411-418(1982)，和Adams等，J.Am.Chem.Soc.105:661(1983)。在一些实施方式中，该序列特异性检测试剂是与感兴趣的核酸或序列杂交的寡核苷酸探针。在一些实施方式中，寡核苷酸探针的长度是至少约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、40、45、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000或更多个核苷酸。
在一些情况中，待使用序列特异性检测试剂检测的序列与靶或非靶核酸上序列之间的单个错配可导致检测试剂与靶或非靶核酸之间相互作用的解链温度下降约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、15、18、20或约20℃。在一些情况中，额外的错配可导致解链温度的更大下降。
在一些实施方式中，该序列特异性检测试剂是线性寡核苷酸探针。例如，该序列特异性检测试剂可含有与感兴趣的核酸杂交的核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸、核苷酸类似物或其组合的线性序列。在一些情况中，线性寡核苷酸探针可含有标记物或条码或额外的核酸序列，例如用于扩增或检测。在一些情况中，该序列特异性检测试剂含有在相邻位置处结合核酸的两种寡核苷酸。例如，在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或约20个核苷酸内结合的两种探针。在一些情况中，探针之一被供体分子标记且另一相邻探针被受体分子标记。供体分子的激发可导致荧光能量转移至相邻受体分子，如果两种探针都结合小于约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或约20个核苷酸的距离内的模板核酸。
在一些情况中，该线性探针是水解探针。例如，双重标记的发荧光寡核苷酸探针通常在文献中称作“TaqMan”探针。序列特异性水解探针可含有两种不同的荧光染料标记的短(例如，长度为约20-25个碱基)多核苷酸。在一些情况中，该探针的5'末端接合报告染料，而3'末端接合淬灭部分。在其它情况中，染料可在探针上的其它位置处接合。所述探针可设计为与靶核酸上的探针结合位点具有至少基本的序列互补性。与侧接探针结合位点的区域结合的上游和下游PCR引物也可包括在反应混合物中。当所述发荧光探针完整时，荧光剂和淬灭剂部分之间发生能量转移，淬灭荧光剂的发射。PCR延伸阶段中，探针被切割(例如通过核酸聚合酶例如Taq聚合酶的5'核酸酶活性，或通过切割结合探针的单独提供的核酸酶活性)，从而使荧光剂和淬灭剂部分分离。这导致报告发射强度的增加，可用合适的检测器测量。
或者，该序列特异性试剂可以是结构化探针。结构化探针(例如，“分子信标”或“蝎型探针”)提供了检测核酸的另一种方法。通过分子信标，探针与靶核酸的互补区域杂交时对探针构象的改变导致形成可检测信号。除了靶标特异性部分以外，所述分子信标包括其他部分，通常一部分在5'端另一部分在3'端，它们彼此互补。一端部分通常接合报告染料，而另一端部分通常接合淬灭剂染料。溶液中两种端部分可彼此杂交以形成茎环结构。该构象中，报告染料和淬灭剂足够接近，以致报告染料的荧光被淬灭剂有效淬灭。相反，杂交的分子信标产生线性化构象，其中降低了猝灭程度。因此，通过监测报告染料的发射变化，可以检测核酸。此类探针及其使用方法还描述于，例如Piatek,A.S.,等,Nat.Biotechnol.16:359-63(1998)；Tyagi,S.和Kramer,F.R.,Nature Biotechnology 14:303-308(1996)；和Tyagi,S.等，Nat.Biotechnol.16:49-53(1998)。
蝎型探针通常由单链双重标记的荧光探针组成，其由探针两端上的约4-6个核苷酸的互补茎序列维持为约20-25个核苷酸的发夹环构象。该探针含有5’端报告染料和与聚合酶引物的5’端经由阻断物(blocker)直接连接的内部淬灭染料。该阻断物阻止聚合酶延伸该引物。报告染料紧邻淬灭染料导致报告物天然荧光的淬灭。聚合酶反应期间，聚合酶延伸引物并合成特异性靶序列的互补链。变性和复性解开发夹环，且该环区域与新合成的靶序列分子内杂交。这增大了淬灭染料与报告染料之间的距离，导致荧光增加。
在一些实施方式中，该序列特异性检测试剂是适体。本文中，“适体”指对鉴定特征物(如蛋白质或核酸)具有特异性结合亲和性的DNA或RNA分子。在一些实施方式中，适体选自基于其以基于与靶分子的非沃森克里克相互作用的高亲和特异性结合其他分子能力的随机池(参见例如，Cox和Ellington,Bioorg.Med.Chem.9:2525-2531(2001)；Lee等，Nuc.Acids Res.32:D95-D100(2004))。例如，可使用称为通过指数富集的配体系统性演化(SELEX)的选择过程选择适体。参见例如Gold等，US 5,270,163。可选择结合例如核酸、蛋白质、小有机化合物、维生素或无机化合物的适体。
在一些实施方式中，该序列特异性检测试剂是核酸引物或一组核酸引物。例如，该序列特异性检测试剂可以是设计为与靶分子杂交并起始聚合酶反应的核酸引物。在一些情况中，该引物是用于从RNA模板中合成第一和/或第二链DNA的引物。在一些情况中，该引物是用于生成双链核酸(如双链DNA)的引物。在一些情况中，该引物是PCR引物或用于本领域已知的其他核酸扩增技术的引物，包括但不限于连接酶链式反应(LCR)、基于转录的扩增系统(TAS)、基于核酸序列的扩增(NASBA)、链置换扩增(SDA)、滚环扩增(RCA)、高分支RCA(HRCA)，和嗜热解旋酶依赖性DNA扩增(tHDA)。
非特异性检测试剂
本发明所述的非特异性检测试剂包括适用于检测核酸的任何染料。在一些实施方式中，该非特异性检测试剂是结合核酸的染料。在一些情况中，该染料是结合核酸的荧光染料。在一些情况中，该荧光染料在结合核酸后增加荧光。在一些情况中，该非特异性检测试剂是嵌入双链核酸(如双链DNA、双链RNA或RNA:DNA杂交体)中的染料。嵌入染料包括适用于检测双链核酸的任何嵌入染料。这类嵌入染料包括，例如，9-氨基吖啶、溴化乙啶、菲啶染料、EvaGreen、PICO GREEN(P-7581，分子探针公司(Molecular Probes))、EB(E-8751，西格玛公司(Sigma))、碘化丙啶(P-4170，西格玛公司)、吖啶橙(A-6014，西格玛公司)、噻唑橙、噁唑黄、7-氨基放线菌素D(A-1310，分子探针公司)、花青染料(如TOTO、YOYO、BOBO和POPO)、SYTO、SYBR Green I(美国专利号5,436,134：N',N'-二甲基-N-[4-[(E)-(3-甲基-1,3-苯并噻唑-2-亚基)甲基]-1-苯基喹啉-1-鎓-2-基]-N-丙基丙烷-1,3-二胺)、SYBR Green II(美国专利号5,658,751)、SYBR DX、OliGreen、CyQuant GR、SYTOX Green、SYTO9、SYTO10、SYTO17、SYBR14、FUN-1、DEAD Red、碘化己啶、溴化乙啶、二氢乙啶、溴乙啡锭二聚体、9-氨基-6-氯-2-甲氧基吖啶、DAPI、DIPI、吲哚染料、咪唑染料、放线菌素D、羟芪巴脒、LDS 751(美国专利号6,210,885)，以及以下文献中描述的染料：Georghiou,Photochemistry andPhotobiology(《光化学和光生物学》)，26:59-68，培格曼出版公司(Pergamon Press)(1977)；Kubota等，Biophys.Chem.,6:279-284(1977)；Genest等，Nuc.Ac.Res.,13:2603-2615(1985)；Asseline,EMBO J.,3:795-800(1984)；Richardson等，美国专利号4,257,774；以及Letsinger等，美国专利号4,547,569。
在一些实施方式中，该非特异性检测试剂是与可检测标记物偶联的非特异性核酸结合剂。例如，该非特异性检测试剂可以是与可检测标记物偶联的嵌入试剂。在一些情况中，该非特异性检测试剂可以是与可检测标记物偶联的蛋白质。能够非特异性结合核酸的示例性蛋白质包括单链DNA结合蛋白和组蛋白。
在一些实施方式中，该非特异性检测试剂是寡核苷酸。例如，与可检测标记物偶联的寡核苷酸。在一些实施方式中，核酸非特异性检测试剂与通用杂交序列杂交。在一些情况中，该通用杂交序列已通过扩增、连接或聚合化掺入至样品中的核酸中。例如，通过含有杂交序列的随机引物来扩增样品中的核酸。
在一些实施方式中，该非特异性检测试剂在聚合化期间生成。例如，扩增或第一或第二链合成期间从RNA模板中生成。在一些情况中，该非特异性检测试剂是经标记的核苷酸(例如标记有生物素、放射性同位素、荧光团等的核苷酸)，其通过扩增、连接或聚合化掺入样品中的核酸中。
可检测标记物
通过检测连接至各试剂的标记物来检测本文所述的检测试剂。该标记物可直接连接至检测试剂(例如通过共价键)或可以间接接合(例如使用螯合剂或接头分子)。术语“标记物”和“可检测标记物”在本文中同义使用。在一些实施方式中，各标记物(如连接至第一检测试剂的第一标记物、连接至第二检测试剂的第二标记物等)生成可检测信号且这些信号(例如第一标记物生成的第一信号、第二标记物生成的第二信号等)是可区分的。在一些实施方式中，两种或更多种标记物包含相同类型的试剂(例如第一标记物为第一荧光剂且第二标记物为第二荧光剂)。在一些实施方式中，两种或更多种标记物(如第一标记物、第二标记物等)联合生成可检测信号，该可检测信号是在一种或多种标记物不存在时无法生成的。
可检测标记物的示例包括但不限于：生物素/链霉亲和素标记物、核酸(例如寡核苷酸)标记物、化学反应性标记物、荧光标记物、酶标记物、放射性标记物、量子点、聚合物点、质量标记物及其组合。在一些实施方式中，该标记物可包括光学试剂，如荧光剂、磷光剂、化学发光剂等。多种试剂(如染料、探针或指示剂)是本领域已知的并可用于本发明。(参见例如英杰公司(Invitrogen)，The Handbook—A Guide to Fluorescent Probes andLabeling Technologies(《手册——荧光探针和标记技术指导》)，第10版(2005))。
荧光剂可包括多种有机和/或无机小分子或多种荧光蛋白及其衍生物。例如，荧光剂可包括但不限于：花青、酞菁、卟啉、吲哚菁、若丹明、吩噁嗪、苯基呫吨、吩噻嗪、吩硒嗪、荧光素(例如FITC、5-羧基荧光素和6-羧基荧光素)、苯并卟啉、方酸菁、二吡咯并嘧啶酮、并四苯、喹啉、吡嗪、咕啉、克酮酸、吖啶酮、菲啶、若丹明(例如TAMRA、TMR和若丹明红)、吖啶、蒽醌、硫族吡喃鎓(chalcogenopyrylium)类似物、氯、萘菁、次甲基染料、方菁染料、偶氮化合物、甘菊蓝、氮杂甘菊蓝、三苯基甲烷型染料、吲哚、苯并吲哚、吲哚羰花青、苯并吲哚羰花青、BODIPYTM和BODIPYTM衍生物，及其类似物。在一些实施方式中，荧光剂是Alexa Fluor染料。在一些实施方式中，荧光剂是聚合物点或量子点。荧光染料和荧光标记物试剂包括可购自英杰/分子探针公司(Invitrogen/Molecular Probes)(俄勒冈州尤金市)和皮尔斯生物技术公司(Pierce Biotechnology,Inc.)(伊利诺斯州洛克福德)。
在一些实施方式中，用于检测靶分子的序列特异性检测试剂都使用光学试剂标记，且各光学试剂标记的检测试剂都通过检测该光学试剂生成的信号来检测。在一些实施方式中，非特异性检测试剂使用光学试剂标记并通过检测该光学试剂生成的信号来检测。
在一些实施方式中，该标记物是放射性同位素。放射性同位素包括放射性核素，其发射γ射线、正电子、β和α粒子和X射线。合适的放射性核素包括但不限于：225Ac、72As、211At、11B、128Ba、212Bi、75Br、77Br、14C、109Cd、62Cu、64Cu、67Cu、18F、67Ga、68Ga、3H、166Ho、123I、124I、125I、130I、131I、111In、177Lu、13N、15O、32P、33P、212Pb、103Pd、186Re、188Re、47Sc、153Sm、89Sr、99mTc、88Y和90Y。在一些实施方式中，用于检测特异性核苷酸序列的序列特异性检测试剂各自用放射性同位素标记(例如使用第一放射性同位素标记第一检测试剂，使用第二放射性同位素标记第二检测试剂等)，且使用放射性同位素标记的各检测试剂通过检测该放射性同位素生成的放射性来检测。例如，一种检测试剂可标记有γ发射子，而一种检测试剂可标记有β发射子。或者，这些检测试剂可标记有以可区分的不同能级发射同一粒子(例如，α、β或γ)的放射性同位素。在一些实施方式中，用于检测靶分子的序列特异性检测试剂都使用放射性同位素标记，且各放射性同位素标记的检测试剂都通过检测该放射性同位素生成的信号来检测。在一些实施方式中，非特异性检测试剂使用放射性同位素标记并通过检测该放射性同位素生成的信号来检测。在一些情况中，该序列特异性检测试剂标记有放射性同位素且该非特异性检测试剂标记有光学试剂。在其他情况中，该序列特异性检测试剂标记有光学试剂且该非特异性检测试剂标记有放射性同位素。
在一些实施方式中，标记物是酶，并通过检测该酶生成的产物来检测检测试剂。合适的酶的示例包括但不限于：脲酶、碱性磷酸酶、(辣根)过氧化氢酶(HRP)、葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶、荧光素酶、碱性磷酸酶和水解二乙酸荧光素的酯酶。例如，辣根过氧化物酶检测系统可与生色底物四甲基联苯胺(TMB)联用，其在过氧化氢存在下产生在450nm处可检测的可溶产物。碱性磷酸酶检测系统可与生色底物对硝基苯基磷酸盐联用，其产生405nm处可检测的可溶性产物。β-半乳糖苷酶检测系统可与生色底物邻硝基苯-β-D-半乳糖苷(ONPG)联用，产生在410nm处可检测的可溶性产物。脲酶检测系统可与底物如脲溴甲酚紫(西格玛免疫化学品公司(Sigma Immunochemicals)，密苏里州圣路易斯)联用。
在一些实施方式中，序列特异性检测试剂各自标记有酶(例如第一探针标记有第一酶，第二探针标记有第二酶等)，且标记有酶的各序列特异性检测试剂通过检测该酶生成的产物来测得。在一些实施方式中，所有用于检测靶核酸的序列特异性检测试剂都使用酶标记，且各酶标记的检测试剂都通过检测该酶生成的产物来检测。在一些实施方式中，非特异性检测试剂使用酶标记并通过检测该酶生成的信号来检测。在一些情况中，该序列特异性检测试剂标记有酶且该非特异性检测试剂标记有光学试剂或放射性同位素。在其他情况中，该序列特异性检测试剂标记有光学试剂或放射性同位素且该非特异性检测试剂标记有酶。
在一些实施方式中，该标记物是亲和标签。合适的亲和标签的示例包括但不限于：生物素、肽标签(如FLAG标签、HA标签、His标签、Myc标签、S标签、SBP标签、Strep标签)和蛋白质标签(如GST标签、MBP标签、GFP标签)。
在一些实施方式中，该标记物是核酸标记物。合适的核酸标记物的示例包括但不限于：寡核苷酸序列、单链DNA、双链DNA、RNA(如mRNA或miRNA)或DNA-RNA杂交体。在一些实施方式中，该核酸标记物的长度是约10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900或1000个核苷酸。
在一些实施方式中，该标记物是核酸条码。如本文所用“条码”是专一限定检测试剂分子的或与检测试剂结合的核酸分子的短核苷酸序列(例如，长至少约4、6、8、10或12个核苷酸)。例如，可在不同划分产物中使用含有不同条码序列的引物扩增划分产物中的一种或多种核酸，从而将独特的条码掺入至不同划分产物的经扩增的核酸中。类似地，可在不同划分产物中使用含有不同条码序列的引物逆转录划分产物中的一种或多种核酸，从而将独特的条码序列掺入至不同划分产物的经逆转录的核酸中。替代地或组合地，划分产物中的一种或多种核酸可连接至条码，使得各划分产物中具有不同的条码序列。在一些情况中，序列特异性检测试剂含有对不同划分产物而言独特的条码。在一些情况中，非特异性检测试剂可含有对不同划分产物而言独特的条码。在一些情况中，序列特异性和非特异性检测试剂都含有对不同划分产物而言独特的条码。在这类情况中，对于给定划分产物中的特异性和非特异性检测试剂，这些条码可以是相同的。或者，对于给定划分产物中的特异性和非特异性检测试剂，该条码可以是不同的。随后可合并并任选扩增划分产物而不损失何种划分产物含有核酸的痕迹。然后可对是否存在含有各条码的核酸进行计数(例如通过测序)而无需维持物理划分产物。
条码序列的长度决定能区分多少独特性样品。例如，4个核苷酸的条码能区分不多于44或256个样品；6个核苷酸的条码能区分不多于4096个不同样品；而8个核苷酸的条码能标示不多于65536个不同样品。此外，条码可接合至双链核酸的两条链，例如通过用于从RNA模板中合成第一和第二链的条码化引物，通过用于DNA扩增的条码化引物，或者通过连接。在两条链上使用两种不同的条码增加了可区分的独立事件的数量。
或者，相同条码可接合至双链核酸的第一和第二链。在各划分产物中使用相同的条码(例如通过在用于从RNA模板合成第一和第二链、连接的引物中掺入相同的条码，或通过在DNA扩增期间掺入)可在两条链上产生相同的条码。双重条码化可提供对混杂下游分析的后续检测误差如测序或扩增误差的检验并且允许检测任一条或两条链中而不影响定量。本领域熟知条码技术的应用，参见例如Katsuyuki Shiroguchi等Digital RNA sequencingminimizes sequence-dependent bias and amplification noise with optimizedsingle-molecule barcodes(数字式RNA测序用优化的单分子条码最小化序列依赖性偏置和扩增噪音),PNAS(2012)和Smith,AM等，Highly-multiplexed barcode sequencing:anefficient method for parallel analysis of pooled samples(高度多重条码测序：一种对集中的样品平行分析的高效方法)，Nucleic Acids Research Can 11,(2010)。
在一些实施方式中，该标记物是“点击”化学部分。点击化学使用简单稳健的反应(如铜催化的炔和叠氮化物的环加成)来建立分子间连接。对于点击化学的综述，参见Kolb等，Agnew Chem 40:2004-2021(2001)。在一些实施方式中，点击化学部分(如叠氮化物或炔部分)可使用另一种可检测标记物(例如带荧光标记物、生物素化或放射性标记的炔或叠氮化物部分)来检测。
接合可检测标记物与检测试剂的技术是熟知的。例如，常见蛋白标记技术的综述可参见Biochemical Techniques:Theory and Practice(《生物化学技术：理论和实践》)，John F.Robyt和Bernard J.White，维弗兰德出版公司(Waveland Press,Inc.)(1987)。其他标记技术综述于，例如，R.Haugland,Excited States of Biopolymers(《生物聚合物的激发态》)，Steiner编，普莱南出版社(Plenum Press)(1983)；Fluorogenic Probe Designand Synthesis:A Technical Guide(《荧光探针设计与合成：技术指南》)，PE应用生物系统公司(PE Applied Biosystems)(1996)；以及G.T.Herman,Bioconjugate Techniques(《生物偶联技术》)，学术出版社(Academic Press)(1996)。
在一些实施方式中，两种或更多种检测试剂标记物(如第一标记物、第二标记物等)联合生成可检测信号，该可检测信号是在一种或多种标记物不存在时无法生成的。例如，在一些实施方式中，各标记物是酶，且这些酶的活性联合生成可检测信号来指示是否存在标记物(并因此指示各结合核酸的检测试剂)。联合生成可检测信号的酶的示例包括成对的试验，例如使用己糖激酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的成对试验；以及针对与葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、β-D-半乳糖苷酶或碱性磷酸酶试验偶联的NAD(P)H的化学发光试验。参见例如Maeda等，J BioluminChemilumin 1989,4:140-148。
检测核酸的方法
在一些实施方式中，提供了一种核酸序列检测方法，包括：
提供包含DNA或RNA核酸的样品；
将所述样品划分为一组混合物划分产物；
使用序列特异性检测试剂检测划分产物中是否存在靶核酸；以及
使用非特异性检测试剂检测划分产物中是否存在双链核酸，
从而检测划分产物中靶核酸与总核酸的比率。
在一些实施方式中，提供了一种核酸序列检测方法，包括：
提供包含DNA或RNA核酸的样品，该DNA或RNA核酸包含第一靶标和第二靶标；
将所述样品划分为一组混合物划分产物；以及
使用结合第一靶标的特异性检测试剂和结合两种靶标的非特异性检测试剂来检测至少一个混合物划分产物中的第一靶标和第二靶标；从而确定样品中第一靶标的浓度以及第一和第二靶标的浓度。
提供样品
可从基本上任何生物来源提供样品。样品可含有核酸或靶核酸。提供样品包括获得样品和制备样品用于本发明所述方法。例如，可对样品进行纯化、分级、富集或过滤。在一些情况中，可对样品中的核酸进行扩增、转录、逆转录或连接。在一些情况中，提供样品并在划分步骤前使样品接触检测试剂(如序列特异性检测试剂、非特异性检测试剂或其组合)。在一些情况中，划分样品并随后使划分的样品接触检测试剂。
划分
样品可被划分为多个划分产物。划分产物可包括多种类型的划分产物中的任一种，包括固体划分产物(如孔或管)和流体划分产物(如油相内的水性液滴)。在一些实施方式中，这些划分产物是液滴。在一些实施方式中，这些划分产物是微通道。划分样品的方法和组合物描述于，例如，公开的专利申请WO 2010/036352、US 2010/0173394、US 2011/0092373和US 2011/0092376，其各自通过引用全文纳入本文。
在一些情况中，划分样品并将检测试剂(如探针)掺入至划分的样品中。在其他情况中，使样品接触检测试剂并随后划分样品。在一些实施方式中，各试剂(如探针、引物、缓冲剂、酶、底物、核苷酸、盐等)在划分前混合在一起，随后划分样品。在一些情况中，在将各试剂混合在一起后立即划分样品，使得基本所有或大部分反应(如逆转录、DNA扩增、DNA切割等)在划分后发生。在其它情况中，在反应进行缓慢或完全不进行的温度下混合试剂，然后划分样品，并且调节反应温度以使反应进行。例如，可在冰上、低于5℃、或0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、20-25、25-30或30-35℃或更高温度下合并试剂。一般而言，本领域技术人员会知晓如何选择一种或多种反应受到抑制的温度。在一些示例中，采用温度和时间的组合以避免划分之前的明显反应。
此外，可使用一种或多种热启动酶(例如热启动逆转录酶或热启动DNA聚合酶)混合试剂和样品。因此，可混合样品和缓冲剂、盐、核苷酸、探针、标记物、酶等中的一种或多种并随后进行划分。随后，由热启动酶催化的反应可通过加热混合物划分产物以激活一种或多种热启动酶来起始。
此外，可在不存在起始打算的反应(如逆转录或DNA扩增)所需的一种或多种试剂的情况下将样品和试剂(例如缓冲剂、盐、核苷酸、探针、标记物、酶等中的一种或多种)混合在一起。混合物然后可被划分成一组第一混合物划分产物中，然后可通过融合这组第一混合物划分产物和提供必要试剂的一组第二混合物划分产物来提供一种或多种必要试剂。或者，可向第一混合物划分产物中加入必要试剂，而不形成第二混合物划分产物。例如，必要试剂可分散到这组第一混合物划分产物油包水液滴中。作为另一个示例，缺失的试剂可被导向含有这组第一混合物划分产物的一组微通道中。
在一些实施方式中，将样品划分成多个液滴。在一些实施方式中，液滴包含乳液组合物，即不互溶的流体(如水和油)的混合物。在一些实施方式中，液滴是水性液滴，其被不互溶的运载体流体(如油)包围。在一些实施方式中，液滴是油性液滴，其被不互溶的运载体流体(如水性溶液)包围。在一些实施方式中，本文所述液滴是相对稳定的并在两个或更多个液滴之间具有最小聚结。在一些实施方式中，由样品生成的液滴中不到0.0001％、0.0005％、0.001％、0.005％、0.01％、0.05％、0.1％、0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％或10％与其他液滴聚结。这些乳液还可具有有限的絮凝，一种分散相以薄片从悬浮液中产生的过程。
在一些实施方式中，使油相流过包含待检测核酸的水性样品，从而形成液滴。在一些实施方式中，包含待检测核酸的水性样品还包含缓冲的溶液和一种或多种用于检测核酸的序列特异性检测试剂。
该油相可包含氟化基础油，其可通过与氟化表面活性剂(如全氟聚醚)联用而进一步稳定。在一些实施方式中，该基础油包括以下一种或多种：HFE7500、FC-40、FC-43、FC-70或另一种常见氟化油。在一些实施方式中，该油相包含阴离子含氟表面活性剂。在一些实施方式中，该阴离子含氟表面活性剂是Ammonium Krytox(Krytox-AS)、Krytox FSH的铵盐或Krytox FSH的吗啉基衍生物。Krytox-AS的浓度可以是约0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1.0％、2.0％、3.0％或4.0％(w/w)。在一些实施方式中，Krytox-AS的浓度是约1.8％。在一些实施方式中，Krytox-AS的浓度是约1.62％。KrytoxFSH的吗啉基衍生物的浓度可以是约0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1.0％、2.0％、3.0％或4.0％(w/w)。在一些实施方式中，Krytox FSH的吗啉基衍生物的浓度是约1.8％。在一些实施方式中，Krytox FSH的吗啉基衍生物的浓度是约1.62％。
在一些实施方式中，该油相还包含用于调节油性质(如蒸气压、粘性或表面张力)的添加剂。非限制性示例包括全氟辛醇和1H,1H,2H,2H-全氟癸醇。在一些实施方式中，1H,1H,2H,2H-全氟癸醇以约0.05％、0.06％、0.07％、0.08％、0.09％、0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1.0％、1.25％、1.50％、1.75％、2.0％、2.25％、2.5％、2.75％或3.0％(w/w)的浓度添加。在一些实施方式中，1H,1H,2H,2H-全氟癸醇以约0.18％(w/w)的浓度添加。
在一些实施方式中，该乳液配制为生成具有类液界面膜的高度单分散液滴，其可通过加热转化为具有类固界面膜的微胶囊；这类微胶囊可作为生物反应器以通过一段时间的孵育保持其含量。转化为微胶囊形式可在一经加热后即发生。例如，这类转化可发生于超过约40°、50°、60°、70°、80°、90°或95℃的温度下。加热过程期间，流体或矿物油覆盖物可用于阻止蒸发。过量的连续相油可在加热前除去。这些微胶囊可在大范围的热和机械处理下抗聚结和/或絮凝。
转化后，这些微胶囊可储存于约-70°、-20°、0°、3°、4°、5°、6°、7°、8°、9°、10°、15°、20°、25°、30°、35°或40℃下。在一些实施方式中，这些微胶囊可用于储存或运输混合物划分产物。例如，可在一个位置处收集样品，划分为含有酶、缓冲剂和/或引物的液滴中，任选地可进行一个或多个逆转录、扩增或连接反应，然后可加热该划分产物以进行微囊化，并且可储存或运输微胶囊用于进一步分析。
这些微胶囊划分产物可含有一种或多种序列特异性或非特异性检测试剂并可抗聚结，特别是在高温下。因此，这些胶囊可在非常高的密度(例如每单位体积的划分产物数)下孵育。在一些实施方式中，可每毫升孵育超过100000、500000、1000000、1500000、2000000、2500000、5000000或10000000个划分产物。在一些实施方式中，样品-探针孵育发生在单个孔中，例如微量滴定板的孔，此时各划分产物之间没有内部混合。这些微胶囊还可含有孵育所需的其他组分。
在一些实施方式中，将样品划分成至少500个划分产物、至少1000个划分产物、至少2000个划分产物、至少3000个划分产物、至少4000个划分产物、至少5000个划分产物、至少6000个划分产物、至少7000个划分产物、至少8000个划分产物、至少10,000个划分产物、至少15,000个划分产物、至少20,000个划分产物、至少30,000个划分产物、至少40,000个划分产物、至少50,000个划分产物、至少60,000个划分产物、至少70,000个划分产物、至少80,000个划分产物、至少90,000个划分产物、至少100,000个划分产物、至少200,000个划分产物、至少300,000个划分产物、至少400,000个划分产物、至少500,000个划分产物、至少600,000个划分产物、至少700,000个划分产物、至少800,000个划分产物、至少900,000个划分产物、至少1,000,000个划分产物、至少2,000,000个划分产物、至少3,000,000个划分产物、至少4,000,000个划分产物、至少5,000,000个划分产物、至少10,000,000个划分产物、至少20,000,000个划分产物、至少30,000,000个划分产物、至少40,000,000个划分产物、至少50,000,000个划分产物、至少60,000,000个划分产物、至少70,000,000个划分产物、至少80,000,000个划分产物、至少90,000,000个划分产物、至少100,000,000个划分产物、至少150,000,000个划分产物或至少200,000,000个划分产物。
在一些实施方式中，该样品被划分为足量的划分产物，使得至少大部分划分产物具有不超过1个靶核酸(例如不超过约0.1、0.2、0.3、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个靶核酸)。在一些实施方式中，该样品被划分为使得一种靶核酸以高拷贝数/划分产物存在，而另一靶核酸以少量拷贝数/划分产物存在。例如，一种靶核酸可以是以约1、2、3、5、6、8、10、12、14、15、20、25、30、50或更多个拷贝/划分产物存在的野生型序列。以少量拷贝数/划分产物存在的靶核酸可以是以少于划分产物的约10％、5％、1％、0.5％、0.1％、0.05％、0.01％、0.005％、0.001％、0.0005％、0.00001％或更少存在的突变、多态性或稀有序列变体。在一些实施方式中，该样品被划分为足量的划分产物，使得至少大部分划分产物具有不超过5-10个靶和/或非靶核酸(例如不超过约0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个靶和/或非靶核酸)。在一些实施方式中，大部分划分产物具有不超过5-10个(例如不超过约0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)待检测核酸。在一些实施方式中，各划分产物中存在平均约0.001、0.005、0.01、0.05、0.1、0.5、1、2、3、4或5个序列特异性检测试剂分子。
在一些实施方式中，生成的液滴在形状和/或尺寸方面基本均匀。例如，在一些实施方式中，这些液滴在平均直径方面基本均匀。在一些实施方式中，生成的液滴的平均直径为约0.001微米、约0.005微米、约0.01微米、约0.05微米、约0.1微米、约0.5微米、约1微米、约5微米、约10微米、约20微米、约30微米、约40微米、约50微米、约60微米、约70微米、约80微米、约90微米、约100微米、约150微米、约200微米、约300微米、约400微米、约500微米、约600微米、约700微米、约800微米、约900微米或约1000微米。在一些实施方式中，生成的液滴的平均直径为小于约1000微米、小于约900微米、小于约800微米、小于约700微米、小于约600微米、小于约500微米、小于约400微米、小于约300微米、小于约200微米、小于约100微米、小于约50微米，或小于约25微米。在一些实施方式中，生成的液滴在形状和/或尺寸方面是不均匀的。
在一些实施方式中，生成的液滴在体积上基本均匀。例如，液体体积的标准偏差可以低于约1皮升、5皮升、10皮升、100皮升、1nL或低于约10nL。在一些示例中，液滴体积的标准偏差可低于平均液滴体积的约10-25％。在一些实施方式中，生成的液滴的平均体积为约0.001nL、约0.005nL、约0.01nL、约0.02nL、约0.03nL、约0.04nL、约0.05nL、约0.06nL、约0.07nL、约0.08nL、约0.09nL、约0.1nL、约0.2nL、约0.3nL、约0.4nL、约0.5nL、约0.6nL、约0.7nL、约0.8nL、约0.9nL、约1nL、约1.5nL、约2nL、约2.5nL、约3nL、约3.5nL、约4nL、约4.5nL、约5nL、约5.5nL、约6nL、约6.5nL、约7nL、约7.5nL、约8nL、约8.5nL、约9nL、约9.5nL、约10nL、约11nL、约12nL、约13nL、约14nL、约15nL、约16nL、约17nL、约18nL、约19nL、约20nL、约25nL、约30nL、约35nL、约40nL、约45nL或约50nL。
洗涤
在一些实施方式中，在适用于使序列特异性检测试剂特异性结合特异性核酸序列和/或使非特异性检测试剂结合核酸(如总核酸、总扩增的核酸、总逆转录的核酸、总DNA或总双链核酸)的条件下使样品与两种或更多种探针孵育后，洗涤样品以除去不特异性结合核酸的检测试剂。在一些实施方式中，将样品与第一检测试剂孵育，随后在将样品与第二检测试剂孵育前任选地经过洗涤条件。在一些实施方式中，对于两种、三种、四种、五种或更多种检测试剂，可依次将样品与检测试剂孵育，随后任选地将样品置于洗涤条件，随后将样品与不同的检测试剂孵育。
适当洗涤条件、洗涤缓冲液等的选择将基于诸如检测试剂、靶分子等的条件变化且可由本领域技术人员确定。例如，在一些实施方式中，其中检测试剂-核酸复合物比单独的检测试剂更密集，可通过离心洗涤样品以沉淀检测试剂-核酸复合物，随后重悬在缺少检测试剂的缓冲液中。作为另一个示例，在一些实施方式中，可使样品通过密度梯度或其他梯度(如通过电荷分离)以分离检测试剂-核酸复合物与未结合的检测试剂。作为另一个示例，在一些实施方式中，可使样品通过柱(如尺寸排阻柱)来洗涤检测试剂-核酸复合物以分离复合物与未结合的检测试剂。需要时，可重复洗涤过程以进行额外的洗涤。在一些实施方式中，在划分前洗涤样品。在一些实施方式中，在划分后洗涤样品。在一些实施方式中，在使样品与检测试剂孵育后和检测检测试剂前不进行间插的洗涤步骤。
在一些实施方式中，在划分样品之前、期间和/或之后，将样品维持在受控的温度或温度范围下。在一些实施方式中，在划分样品之前、期间和/或之后，将样品维持在约20°、25°、30°、35°、40°、45°、50°、55°、60°、65°、70°、75°、80°、85°、90°或95℃的温度下，例如允许由一种或多种经标记探针所生成信号扩增的温度下。在一些情况中，在划分之前或之后循环样品温度。在一些情况中，温度循环提供检测试剂、标记物和/或靶核酸的扩增。
检测
可使用多种检测装置中的任一种来检测检测试剂或可检测标记物。示例性检测方法包括放射性检测、光学检测(如吸光度、荧光或化学发光)或质谱检测。作为非限制性示例，可使用配备生成激发光的模块(所述激发光可被荧光团吸收)以及检测由荧光团发射的光的模块的检测装置来检测荧光标记物。
在一些实施方式中，可整体检测经划分的样品中的可检测标记物。例如，可将经划分的样品(如液滴)合并至板(如96孔或384孔板)的一个或多个孔中，并可使用酶标仪检测信号(如荧光信号)。在一些情况中，可在合并划分产物后使用条码来维持划分信息。
在一些实施方式中，该检测器还包括对经划分的样品(如液滴)的操作能力，通过单独划分的样品进入检测器，进行检测，然后退出检测器。在一些实施方式中，经划分的样品(如液滴)可在所述经划分的样品流动时连续检测。在一些实施方式中，经划分的样品(如液滴)排列在表面，而检测器相对所述表面运动，在含信号划分产物的各位置检测信号。检测器的示例如WO 2010/036352所示，其内容通过引用纳入本文。在一些实施方式中，经划分样品中的可检测标记物可连续检测而无需使经划分的样品流动(如使用载玻片)。
获取荧光检测数据后，可使用通用目的计算机系统(本文中称作“主机”)来储存和处理数据。可使用计算机可执行逻辑进行诸如扣减背景信号、对靶和/或参考序列赋值和量化数据的功能。主机可用于显示、储存、检索或计算来自核酸检测的结果；储存、检索或计算来自核酸检测的原始数据；或者显示、储存、检索或计算可用于本发明的方法中的任何样品或患者信息。
在一些实施方式中，主机或任何其他计算机可用于计算样品中存在的序列变体的比例。例如，序列变体(如突变、多态性等)的比例的计算方法可以是：将其中序列特异性检测试剂检测到序列变体的划分产物数目除以其中非特异性检测试剂检测到含有核酸(如总核酸、总扩增的核酸、总逆转录的核酸、总DNA或总双链核酸)的划分产物的划分产物数目。
在一些情况中，可报告其中序列特异性检测试剂检测到靶核酸与非特异检测试剂检测到核酸的划分产物的比率。在一些情况中，该报告包括诊断或一种或多种诊断的可能性。在一些情况中，该报告包括推荐的治疗，例如药物或化疗剂。在一些情况中，该报告显示在主机的显示屏上。该报告还可储存于计算机可读取介质上，经传输，或打印在人可读取介质上。
主机可配置许多不同的硬件组件并可以许多尺寸和形式制造(例如台式PC、笔记本、平板PC、手持式计算机、服务器、工作站、大型机)。可包含标准组件，例如监视器、键盘、磁盘驱动器、CD和/或DVD驱动器等。当主机与网络相连时，可通过任何合适的传输介质(如有线、光和/或无线介质)和任何合适的通信协议(如TCP/IP)来提供连接；主机可包括合适的网络硬件(例如调制解调器、以太网卡、WiFi卡)。主机可使用多种操作系统中的任一种，包括UNIX、Linux、Microsoft Windows、MacOS或任何其他操作系统。
可以多种语言编写用于实施本发明的各方面的计算机代码，包括PERL、C、C++、Java、JavaScript、VBScript、AWK或任何其他的可在主机上执行或可经编译在主机上执行的脚本或编程语言。代码也可以低级语言编写或分配，例如汇编语言或机器语言。
主机系统通过用户控制操作的工具有利地提供界面。在本文所述的实施例中，软件工具以脚本方式实施(例如使用PERL)，其执行可由用户从操作系统(如Linux或UNIX)的标准控制线界面起始。本领域技术人员应理解，需要时，可使命令适用于操作系统。在其他实施方式中，可提供图形化用户界面，使用户使用点击设备控制操作。因此，本发明不限于任何特定的用户界面。
可在用于储存和/或传输的多种计算机可读取介质上编码整合本发明的多种特征的脚本或程序。合适的介质的示例包括：磁盘或磁带、光学储存介质(如光盘(CD)或DVD(数字多功能光盘))、闪速存储器以及经由遵循多种协议的有线、光纤和/或无线网络(包括因特网)的适用于传输的载波信号。
通过引用将本申请引用的所有专利、专利申请和其它公开文献包括GenBank登录号全文纳入本文用于所有目的。

Claims (18)

1.一种用于检测基因中的序列变体的核酸序列检测方法，所述方法包括：
提供包含DNA或RNA核酸的样品，其中所述样品包含野生型核苷酸序列和基因的突变体核苷酸序列；
将所述样品划分为一组混合物划分产物；
使用序列特异性检测试剂检测所述划分产物中是否存在靶核酸，其中靶核酸是基因的突变体核苷酸序列，其中序列特异性检测试剂包含与突变体核苷酸序列特异性结合的可检测标记的寡核苷酸探针；以及
使用非特异性检测试剂检测所述划分产物中是否存在基因的总双链核酸，其中非特异性检测试剂是荧光嵌入染料；和
将其中序列特异性检测试剂检测到存在突变体序列的划分产物数目与其中非特异性检测试剂检测到存在基因的总双链核酸的划分产物数目比较，来计算突变体序列的相对比例。
2.如权利要求1所述的方法，其中，在检测前扩增所述核酸。
3.如权利要求1所述的方法，所述嵌入染料选自：EvaGreen、picogreen、溴化乙锭、SYBRGreen I、SYBR Gold、Yo-Yo、Yo-Pro、TOTO、BOXTO和BEBO。
4.如权利要求1-3中任一项所述的方法，所述序列特异性检测试剂选自结构化探针和线性探针。
5.如权利要求4所述的方法，所述结构化探针选自分子信标和蝎型探针。
6.如权利要求4所述的方法，所述线性探针选自杂交探针和水解探针。
7.如权利要求1所述的方法，所述核酸是RNA，且所述方法还包括逆转录所述RNA核酸。
8.如权利要求1所述的方法，所述方法包括扩增两种或更多种潜在扩增子。
9.如权利要求8所述的方法，其中，存在有双链核酸的混合物划分产物中，所述潜在扩增子之一的量为小于50％。
10.如权利要求1所述的方法，所述方法还包括通过计数其中非特异性检测试剂检测到核酸的混合物划分产物的数目来确定总核酸浓度。
11.如权利要求10所述的方法，所述方法还包括通过计数其中序列特异性检测试剂检测到核酸的混合物划分产物的数目来确定靶核酸序列浓度。
12.如权利要求11所述的方法，所述方法还包括确定其中序列特异性检测试剂检测到核酸的混合物划分产物与其中非序列特异性检测试剂检测到核酸的混合物划分产物的比率，所述比率表示所述样品中包含所述靶核酸的核酸比例。
13.如权利要求12所述的方法，所述方法还包括报告所述比率。
14.一种用于检测基因中的序列变体的核酸序列检测方法，所述方法包括：
提供包含DNA或RNA核酸的样品，所述DNA或RNA核酸包含第一靶标和第二靶标，其中所述第一靶标是基因的突变体核苷酸序列，所述第二靶标是野生型核苷酸序列；
将所述样品划分为一组混合物划分产物；以及
使用结合所述第一靶标的序列特异性检测试剂和结合两种靶标的非特异性检测试剂来检测至少一个混合物划分产物中的所述第一靶标和所述第二靶标的存在与否，其中序列特异性检测试剂包含与突变体核苷酸序列特异性结合的可检测标记的寡核苷酸探针，其中非特异性检测试剂是嵌入染料；和
比较含有第一靶标的划分数目和其中非序列特异性检测试剂检测到第一或第二核酸的划分数目，从而决定突变体序列的相对比例。
15.如权利要求14所述的方法，对多个混合物划分产物进行所述检测。
16.如权利要求15所述的方法，所述方法还包括确定包含所述第一靶标的混合物划分产物与包含所述第一或第二靶标的混合物划分产物的比率。
17.如权利要求16所述的方法，所述方法还包括报告所述比率。
18.如权利要求14所述的方法，所述第一靶标是突变体或多态性且所述第二靶标是野生型核苷酸序列。
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