CN114921461B - 用于桢楠种质鉴定的ssr分子标记引物组合及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了用于桢楠种质鉴定的SSR分子标记引物组合，所述SSR分子标记引物有5对，分别为PZmk03、PZmf07、PZmf05、PZmf06和PZmf10。本发明开发5对SSR特异性标记引物克服形态学标记准确性低的缺点，弥补现有的AFLP、RAPD、ISSR等分子标记技术缺乏特异性的缺点，可实现对桢楠种质的高效、科学、准确的鉴定。

Description

用于桢楠种质鉴定的SSR分子标记引物组合及应用
技术领域
本发明属于分子生物学领域，具体涉及用于桢楠种质鉴定的SSR分子标记引物组合及应用。
背景技术
遗传标记是基因型的特殊的易于识别的表现形式。理想的遗传标记应具备以下4个条件：(1)具有较强的多态性；(2)表现为共显性，因而能够鉴别出纯和基因型或杂合基因型；(3)对主要的农艺性状没有影响；(4)经济方便，容易观察记载。形态标记即植物的外部特征特性，如树高、胸径、叶色、叶形等。此种形态标记简单直观，长期以来作为种质资源鉴定及育种材料选择的基本方法。但是形态标记数少、多态性差、易受环境条件的影响，容易造成种质资源鉴定错误。相较于形态标记，分子标记具有以下优势：(1)直接以DNA的形式呈现，在植物的各组织、各发育时期均可检测到，不受季节、环境限制，不存在表达与否的问题；(2)数量极多，遍及整个基因组；(3)多态性高，存在许多等位变异；(4)表现为“中性”，不影响目标性状的表达，与不良性状无必然的连锁；(5)许多标记表现为共显性，能够鉴别出纯和基因型和杂合基因型，提供完整的遗传信息。在林木基因组中存在着许多由1-4个碱基对组成的简单重复序列，如(GA)n、(AC)n、(GAA)n(其中n为重复次数)等，这些重复序列分布遍及所有的染色体及染色体的各个区段，称为简单重复序列(SSR)，又称为微卫星。SSR可直接反映遗传信息，并具有操作简单、稳定性好以及通用性好等优点，被广泛应用于品种鉴定、分子育种等方面。
王英等.3种楠木DNA提取及其ISSR标记鉴别.四川农业大学学报,2016,34(4):450-477.这篇文献从20条ISSR引物中筛选出7条引物对紫楠、浙江楠和桢楠3种木材进行PCR扩增，可用于鉴别和区分3种楠属植物木材。该方法存在以下不足：(1)所使用的引物为ISSR引物，ISSR引物为通用引物，即所有的植物均可以从ISSR引物库中筛选出合适的引物序列，特异性差；(2)ISSR为显性遗传标记，不能区分显性纯和基因型和杂合基因型；(3)该文筛选的ISSR引物适用于楠木不同种间的木材鉴别，无法对种内的个体种质资源进行有效区分和鉴别。
张炜.桢楠种质资源遗传多样性和水肥管理技术对幼树生长和生理特性的影响.四川农业大学博士学位论文,2015.建立了桢楠AFLP分子标记技术体系，选择12对AFLP分子标记引物对桢楠种质进行遗传多样性分析，根据条带迁移率来分析桢楠的遗传变异。该方法存在以下不足：(1)AFLP为光谱型的分子标记技术，引物为通用引物，不具有特异性；(2)AFLP分子标记技术通过聚丙烯酰胺凝胶电泳进行检测，分辨率低；(3)采用荧光标记的引物进行荧光电泳检测，成本高。
张炜，龙汉利，贾廷彬，等.桢楠DNA提取和RAPD条件的优化.四川林业科技，2011，32(4)：55-62.提供了桢楠新鲜叶片、硅胶干燥叶片材料的DNA提取方法，并对影响RAPD反应的各因素进行优化，得到了桢楠RAPD的优化反应体系及程序。该方法存在以下不足：(1)DNA提取方法并不十分合理，依照文献提供的方法得到高质量DNA的几率偏低；(2)未提供相当的适合用于桢楠种质鉴定的RAPD引物，只是提供了一种可进行RAPD-PCR的方法；(3)RAPD是一种随机扩增多态性DNA，是一种显性标记，扩增目标是随机不定的，重复性较差。
时小东，朱学慧，盛玉珍，等.基于转录组序列的楠木SSR分子标记开发.林业科学，2016，52(11)：71-78.根据桢楠转录组序列，开发9对SSR引物，可用于桢楠遗传相关研究。该方法存在以下不足：(1)提供的引物仅能进行桢楠PCR扩增，并不清楚是否能够适用于种质鉴定；(2)经验证，文章提供的SSR引物，仅部分能正常扩增出条带；(3)并未提供文章中SSR引物可用于种质鉴定的证据和鉴定方案。
目前，国内外仍缺乏楠木全基因组和分子标记信息的研究，虽已建立了楠木AFLP、ISSR和SSR体系，但均是用于评估楠木群体遗传多样性和用于不同楠属植物木材真伪鉴定，尚未有用于楠木种质鉴定的SSR标记引物。
发明内容
本发明所要解决的技术问题为：针对目前未有对桢楠苗木种质鉴定可行分子鉴定方案的问题，本发明开发5对SSR特异性标记引物，克服形态学标记准确性低的缺点，弥补现有的AFLP、RAPD、ISSR等分子标记技术缺乏特异性的缺点，可实现对桢楠种质的高效、科学、准确的鉴定。
本发明的技术方案为：用于桢楠种质鉴定的SSR分子标记引物组合，所述SSR分子标记引物有5对，分别为PZmk03、PZmf07、PZmf05、PZmf06和PZmf10，其中：
PZmk03的前向引物序列如SEQ ID No.1所示，后向引物序列如SEQ ID No.2所示；
PZmf07的前向引物序列如SEQ ID No.3所示，后向引物序列如SEQ ID No.4所示；
PZmf05的前向引物序列如SEQ ID No.5所示，后向引物序列如SEQ ID No.6所示；
PZmf06的前向引物序列如SEQ ID No.7所示，后向引物序列如SEQ ID No.8所示；
PZmf10的前向引物序列如SEQ ID No.9所示，后向引物序列如SEQ ID No.10所示。
一种用于桢楠种质鉴定的试剂盒，所述试剂盒包含上述所述的SSR分子标记引物组合。
上述所述的SSR分子标记引物组合或试剂盒在桢楠种质鉴定或指纹图谱构建中的应用。
一种桢楠SSR指纹图谱的构建方法，包括如下步骤：
(1)提取桢楠植株的总DNA；
(2)以步骤(1)的总DNA为模板，以上述所述的5对SSR分子标记引物进行PCR扩增；
(3)毛细管电泳检测步骤(2)的扩增产物，收集数据；
(4)对步骤(3)的数据进行处理，构建出桢楠的SSR指纹图谱。
PCR扩增中：
PCR反应体系共25uL:上下游引物各1uL，DNA模板1uL，PCR mix 12.5uL，9.5uL的无酶无菌水；
PCR反应程序:94℃预变性4min；94℃变性30s，56-60℃复性30s，72℃延伸1min，35个循环；最后72℃延伸5min。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明开发5对SSR特异性标记引物(PZmk03、PZmf07、PZmf05、PZmf06和PZmf10)，克服形态学标记准确性低的缺点，弥补现有的AFLP、RAPD、ISSR等分子标记技术缺乏特异性的缺点，可实现对桢楠种质的高效、科学、准确的鉴定。
附图说明
图1为11对有效扩增SSR引物在6桢楠种质的扩增条带情况；从左向右，自上而下以此为PZkf01、PZmf02、ZPmf04、PZmf05、PZmf06、PZmf07、PZmf08、PZmf10、PZmf11和PZmk03；
图2为5对SSR引物在92份桢楠种质中的等位基因频率分布；
图3基于5对SSR引物的92份桢楠种质的聚类分析。
具体实施方式
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为从商业渠道购买得到的。
本发明中所使用的92份桢楠(Phoebe zhennan)种质资源为团队在桢楠全分布区内调查、评价、收集和保存的桢楠优良种质资源，保存在四川玉蟾山楠木培育国家长期科研基地,公众可以从该基地获得上述所有种质资源。已经在非专利文献：张炜.桢楠种质资源遗传多样性和水肥管理技术对幼苗生长与生理特性的影响.四川农业大学博士i学位论文，2015.中公开使用，申请人保证从申请日起20年内向公众发放。种质编号如下表所示(本表中的采样点编号与文献“桢楠种质资源遗传多样性和水肥管理技术对幼苗生长与生理特性的影响”中的编号ID对应，为同一株种质)：
表1 92份桢楠种质资源信息
Figure BDA0003680060600000041
Figure BDA0003680060600000051
Figure BDA0003680060600000061
一、实验方法：
(1)DNA提取
采用本发明改良的CTAB法提取桢楠基因组DNA，具体方法步骤如下：
1、取幼嫩桢楠叶片，加入适量PVP，于液氮中研磨成粉末状；
2、取0.1-0.4g粉末样品，加入55℃预热的2×CTAB提取缓冲液1-4mL(与样品粉末比例为1：10)，加入4％(40-160uL)β-巯基乙醇，加入10-40uL RNase A(根据样品量等比例增加，0.1g样品加10uL RNase A)，充分振荡混匀，55℃水浴15min取出；
3、加入等体积氯仿，抽提，翻转混匀(氯仿层颜色深绿，继续混匀不再变色为止，混匀时要注意频率和速度，尽量轻)，10000×g离心5min，取上清液；
4、加入等体积氯仿：异戊醇(24：1)，抽提细胞残渣和叶绿体，盖上盖子，翻转混匀(标准同3)，10000×g离心5min；
5、将上清液转到一支新的离心管中，加入等体积经-20℃预冷的异丙醇，盖紧盖子，翻转混匀(轻、稳)，以沉淀DNA，10000×g离心2min，倒掉分离液相，吸取4mL 70％酒精轻轻将DNA沉淀冲下，转入新的2mL离心管中；
6、加入1.5mL70％酒精清洗DNA沉淀2次，1mL 100％酒精清洗1次，通风橱中室温挥发酒精；
7、加入200uL经55℃预热的无菌水溶解DNA；
8、0.8％琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量。
(2)基于桢楠叶绿体基因组序列设计SSR引物，并进行PCR扩增
1、SSR-PCR扩增程序
PCR反应体系共25uL:上下游引物各1uL，DNA模板1uL，PCR mix 12.5uL，9.5uL的无酶无菌水。
PCR反应程序:94℃预变性4min；35个循环(94℃变性30s，56-60℃复性30s，72℃延伸1min)；最后72℃延伸5min。
二、基于桢楠叶绿体基因组序列设计的SSR引物的筛选
1、我们利用SSRhunter软件对桢楠叶绿体基因组序列进行全扫描，共设计21对叶绿体SSR引物(表2)，将全部引物在6份种质(SCD7，HuNB02，HB10，SCZ17，HuNB13，CQX01)中进行PCR扩增，0.8％琼脂糖凝胶电泳检测，初步筛选出能扩增出有效条带的引物。结果发现，有11对引物无法在5份桢楠种质中扩增出有效条带，予以去除，剩余10对引物均能扩增出有效条带(图1)。
表2初步设计的SSR引物特征
Figure BDA0003680060600000071
2、进一步的，将10对能够有效扩增的引物在10份桢楠种质(SCD7，HuNB02，HB10，SCZ17，HuNB13，CQX01，SCZ06，SCZ18，HuNB10，SCZ06)中进行多态性鉴定，去除低多态性PIC值的引物，最终的到可用于桢楠种质鉴定的5对高多态性SSR引物(表3)。
表311对设计的SSR引物的PIC测试
引物名称 He PIC
PZkf01 0.000 0.000
PZmf10 0.532 0.417
PZmf04 0.000 0.000
PZmf05 0.429 0.305
PZmf06 0.485 0.346
PZmf07 0.356 0.269
PZmf08 0.000 0.000
PZmf02 0.000 0.000
PZmf11 0.000 0.000
PZmk03 0.833 0.555
He：期望杂合度，PIC：平均多态信息量
3、5对SSR引物的多态位点分析
将筛选得到的5对引物PZmk03、PZmf07、PZmf05、PZmf06和PZmf10引物进行5’荧光信号标记，在92份桢楠种质(表1)中进行SSR-PCR扩增，扩增产物经Fragment Analyzer全自动毛细管电泳分析仪进行检测。计算等位基因数(Na)、有效等位基因数(Ne)、Shannon’s信息多样性指数(I)、观测杂合度(Ho)与期望杂合度(He)、固定指数(F)。同时，计算个体间遗传距离，NTSYS pc 2.1软件绘制基于UPGMA法的树状聚类图。
结果显示，在92份桢楠种质中，PZmk03、PZmf07、PZmf05、PZmf06和PZmf10扩增的有效条带数量分别为4、2、2、3和2个等位基因，引物PZmk03的4个等位基因频率分别为0.414(179bp)、0.575(180bp)、0.005(186bp)、0.005(190bp)，引物PZmf07的2个等位基因频率分别为0.062(267bp)、0.938(268bp)，引物PZmf05的2个等位基因频率分别为0.707(238bp)、0.293(239bp)，引物PZmf06的3个等位基因频率分别为0.010(203bp)、0.743(204bp)和0.248(205bp)，引物PZmf10的2个等位基因频率分别为0.990(222bp)和0.010(223bp)(图2)。
每对引物的等位基因数(Na)含量在2到4之间，有效等位基因数(Ne)为1.021-1.991，5对引物的Shannon’s信息指数(I)范围在0.232-0.739之间，观测杂合度(Ho)范围是0.000-0.022，期望杂合度(He)为0.117-502，多态信息含量(PIC)范围在0.109-0.384之间，具有较高的多态性(表4)。
表4 5对引物对92份楠木种质资源的多样性统计
Figure BDA0003680060600000081
Figure BDA0003680060600000091
注:Na：等位基因数、Ne：有效等位基因数、I：Shannon’s信息指数、Ho：观测杂合度、He：期望杂合度、uHe：无偏期望杂合度、F：固定指数、PIC：多态信息含量
聚类分析结果表明，5对SSR引物能够将92份种质完全划分开，种质个体间遗传距离在0.14-0.73之间，将所有种质分为3组，表明在桢楠种内进行种质个体的鉴定具有较高的效率，如用于鉴定种间的鉴定，效率则更高，比如用于与桢楠表型特征十分相似的闽楠之间的鉴定，则可简单的通过条带的有无进行精准鉴定(图3)。
实施例1桢楠SSR指纹图谱的建立
(1)以前述的改良的CTAB法提取桢楠总DNA；
(2)以步骤(1)的总DNA为模板，以上述所述的5对SSR分子标记引物进行PCR扩增；PCR反应体系共25uL:上下游引物各1uL，DNA模板1uL，PCR mix 12.5uL，9.5uL的无酶无菌水；PCR反应程序:94℃预变性4min；94℃变性30s，56-60℃复性30s，72℃延伸1min，35个循环；最后72℃延伸5min。
(3)毛细管电泳检测步骤(2)的扩增产物，收集数据；
(4)对步骤(3)的数据进行处理，构建出桢楠的SSR指纹图谱。
下表为利用5对引物建立60份桢楠优良种质的指纹图谱，相当于是种质的分子身份证，可用于种质的精准鉴定和识别，这些种质为92份中筛选出来的最为重要的核心种质60份。具体操作方法为根据条带迁移率将扩增产物大小按A、B、C…进行排序，没有条带的记为0。
表5 60份桢楠种质的指纹图谱
Figure BDA0003680060600000092
Figure BDA0003680060600000101
序列表
<110> 四川农业大学 四川省林业科学研究院
<120> 用于桢楠种质鉴定的SSR分子标记引物组合及应用
<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ggttttcaag accggggcta 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
catggagtcc ggggaaatcc 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
cggatcagat agagtcggcg 20
<210> 4
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tcatccaaca ggaatagttg ttct 24
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
cgacccgcga aaagatatac tc 22
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
agctcgccat tccataagct 20
<210> 7
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
taatataata gagccaaaga ggaggt 26
<210> 8
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
aacaataatc ctctatccgg atct 24
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
acgtatgcac aattccccaa 20
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
ggaacggatg gatcggatcg 20

Claims (5)

1.用于桢楠种质鉴定的SSR分子标记引物组合，其特征在于，所述SSR分子标记引物有5对，分别为PZmk03、PZmf07、PZmf05、PZmf06和PZmf10，其中：
PZmk03的前向引物序列如SEQ ID No.1所示，后向引物序列如SEQ ID No.2所示；
PZmf07的前向引物序列如SEQ ID No.3所示，后向引物序列如SEQ ID No.4所示；
PZmf05的前向引物序列如SEQ ID No.5所示，后向引物序列如SEQ ID No.6所示；
PZmf06的前向引物序列如SEQ ID No.7所示，后向引物序列如SEQ ID No.8所示；
PZmf10的前向引物序列如SEQ ID No.9所示，后向引物序列如SEQ ID No.10所示。
2.一种用于桢楠种质鉴定的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含权利要求1所述的SSR分子标记引物组合。
3.权利要求1所述的SSR分子标记引物组合或权利要求2所述的试剂盒在桢楠种质鉴定或指纹图谱构建中的应用。
4.一种桢楠SSR指纹图谱的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)提取桢楠植株的总DNA；
(2)以步骤(1)的总DNA为模板，以权利要求1所述的5对SSR分子标记引物进行PCR扩增；
(3)毛细管电泳检测步骤(2)的扩增产物，收集数据；
(4)对步骤(3)的数据进行处理，构建出桢楠的SSR指纹图谱。
5.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，PCR扩增中：
PCR反应体系共25uL:上下游引物各1uL，DNA模板1uL，PCR mix 12.5uL，9.5uL的无酶无菌水；
PCR反应程序:94℃预变性4min；94℃变性30s，56-60℃复性30s，72℃延伸1min，35个循环；最后72℃延伸5min。
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