CN117660679A - 一种茶树抗寒性相关基因erf1的snp位点、caps分子标记及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种茶树抗寒性相关基因ERF1的SNP位点、CAPS分子标记及其应用。所述SNP位点位于茶树7号染色体第221281848位碱基，碱基多态性为C/T,所述SNP位点为Chr07:221281848_C/T；经SNP位点转化的CAPS分子标记的引物序列为正向引物5'‑TTAGAATCCAAGCTCCTCCTAGACT‑3'；反向引物5'‑AGTACACCAATGAGTGTGGTGAAG‑3'。以茶树基因组DNA为模板进行PCR扩增，扩增产物经限制性内切酶TaqI酶切，通过琼脂糖凝胶电泳、酶切片段分析等过程，对不同茶树品种进行了纯合、杂合和野生型酶切分型，1条带纯合TT型抗寒性弱，3条带杂合CT型抗寒性中等，2条带野生CC型抗寒性强。本发明提供的CAPS分子标记带型稳定、准确率高且成本低，能很好地将低温敏感型茶树与低温耐受型茶树分开，可以为今后茶树品种的早期基因型鉴定与育种选择工作提供新途径。
Description
技术领域
本发明属于分子标记技术领域，一种茶树抗寒性相关基因ERF1的SNP位点、CAPS分子标记及其应用。
背景技术
茶树 (Camellia sinensis) 是一种多年生常绿木本植物，主要生长在热带和亚热带地区，最适生长温度为20～25 ℃左右。近年来随着早生茶树品种的广泛种植和气候变化的不断加剧, 春季“倒春寒”天气也成为制约着茶产业可持续发展的不利因素。因此提高茶树抗寒性以及培育抗寒性强的茶树品种是本领域研究的重要目标。
随着分子生物学的发展，植物抗寒性分子机制研究取得很大进展，在不同植物品种中已筛选出一系列与抗寒相关的基因，并开发了与抗寒性相关基因紧密连锁的分子标记。CAPS分子标记是酶切扩增多态性序列标记方法，是将特异性扩增与限制性酶切相结合用以检测多态性的一种技术，具有共显性、位点特异性、成本低和操作简易等优点。该标记原理为，基因组片段上碱基的突变会引起限制性内切酶识别位点的改变，利用特异性引物扩增含突变位点的基因组片段，再用相应限制性内切酶消化扩增产物，结果会出现部分基因型扩增片段可被完全酶切呈2条带，部分基因型扩增片段不被酶切或酶切不完全呈1条或3条带的情况，从而产生多态性，其结果可通过琼脂糖凝胶电泳直观地表现出来。目前CAPS分子标记已广泛应用于黄麻(Corchorus CAPSularis L.)、水稻(Oryza sativa L.)、玉米(Zea mays L.)、小麦(Triticum aes－tivum L.)和甜瓜(Cucumis melon L.)等作物的基因鉴定分型、分子标记辅助选择育种等方面。但未见有与茶树抗寒性状紧密连锁的CAPS分子标记开发的研究报道，应用CAPS分子标记对抗寒相关基因非同义突变位点进行鉴定，可以为今后茶树品种的早期基因型鉴定工作提供新途径，为更好地开展茶树育种研究中子代材料的选择，加快茶树新品种选育进程提供参考。
发明内容
针对现有技术中的不足，本发明提供了一种茶树抗寒性相关基因ERF1的SNP位点、CAPS分子标记及其应用，以解决现有技术中筛选茶树抗寒新品种周期长及现有分子标记存在带型不稳定，特异性不强的问题，达到为茶树抗寒性品种分子辅助育种提供标记的目的。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明的目的之一在于提供一种茶树抗寒性相关基因ERF1的SNP位点，所述SNP位点位于茶树7号染色体第221281848位碱基，碱基多态性为C/T，所述SNP位点为Chr07:221281848_C/T。
发明人以‘铁观音’基因组为参考基因组，通过SNP calling获得ERF1基因的分子变异数据，利用R软件将分子变异数据与茶树品种的抗寒表型数据相关联，在 ERF1基因编码区获得了1个与茶树抗寒性状显著关联的非同义突变位点（Chr07:221281848_C/T）。
本发明的目的之二在于提供一种茶树抗寒性相关基因ERF1的CAPS分子标记，所述CAPS分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，上述SNP位点位于所述核苷酸序列的第155位。
经实验验证比对，该非同义SNP位点存在C碱基时，扩增片段只能被TaqI酶切，当该SNP突变为T碱基则不能被酶切，选择位于TaqI的酶切位点的SNP位点前、后大约500bp碱基序列转化为CAPS标记，CAPS标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明的目的之三在于提供扩增上述CAPS分子标记的引物，所述引物的序列如下：
正向引物序列：5 '- TTAGAATCCAAGCTCCTCCTAGACT -3 '（SEQ ID NO.2）；
反向引物序列：5 '- AGTACACCAATGAGTGTGGTGAAG-3 '（SEQ ID NO.3）。
本发明的目的之四在于提供一种使用上述CAPS分子标记和引物的检测方法，包括以下步骤：
（1）提取待测茶树样本DNA；
（2）以待测茶树样本DNA为模板，利用上述引物进行PCR扩增，得到扩增产物；
（3）利用限制性内切酶TaqI对扩增产物酶切后电泳，得待测茶树样本电泳带型；
（4）带型比对与鉴定：若电泳带型为2条带，则待测茶树样本为SNP位点为C，基因型为CC，鉴定待测茶树样本为抗寒性强的低温耐受品种； 若电泳带型为3条带，则待测茶树样本为SNP位点为杂合突变，基因型为CT，鉴定待测茶树样本为抗寒性中等的其他品种；若电泳带型为1条带，则待测茶树样本为SNP位点为T，基因型为TT，鉴定待测茶树为样本抗寒性弱的低温敏感品种。
进一步地，每份步骤（2）中所述PCR扩增的反应体系包括：正向引物1μL，反向引物1μL，模板DNA 1μL， 2×Rapid Taq Master Mix 10μL， ddH2O 7μL。
进一步地，步骤（2）中所述PCR扩增的反应条件为：94℃预变性5min，94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸40s，共35个循环；72℃延伸5min；4 ℃保存。
进一步地，每份步骤（3）中酶切体系包括扩增产物3μL，TaqI 0.5μL，10×FastDigest Green Buffer 1μL，ddH2O 5.5μL；酶切条件为65℃孵育35min。
进一步地，步骤（4）中电泳带型为2条带时，条带片段大小分别为383bp、156bp；电泳带型为3条带时，条带片段大小分别为539bp、383bp、156bp；电泳带型为1条带时，条带片段大小为539bp。
本发明的目的之五在于提供并要求保护上述SNP位点、CAPS分子标记、引物在茶树抗寒性鉴定分型以及辅助选择育种中的应用。
本发明的目的之六在于提供并要求保护上述检测方法在茶树抗寒性鉴定分型以及辅助选择育种中的应用。
本发明涉及一种茶树抗寒性相关基因ERF1的SNP位点、CAPS分子标记及其应用，属于分子标记技术领域。为了加速耐寒茶树种质创制与品种培育，本发明利用茶树群体重测序数据和基于SNP的CAPS分子标记，分析突变位点的限制性酶切位点，筛选到特异性的内切酶TaqI，通过酶切 PCR产物、琼脂糖凝胶电泳、酶切片段分析等过程，对不同茶树品种进行了纯合（TT）、杂合（CT）和野生型（CC）酶切分型。相比现有技术，本发明的有益效果在于：
1. 本发明在ERF1基因编码区获得了1个与茶树抗寒性状显著关联的非同义突变位点（Chr07:221281848_C/T），开发出与抗寒性状紧密连锁的SNP-CAPS分子标记，对鉴定茶树抗寒性具有较高的准确性。
2 利用本发明的 CAPS分子标记分别对6份不同抗寒性茶树品种进行验证，对96份不同抗寒性的茶树种质资源做进一步验证，结果表明，该分子标记与茶树抗寒性有显著或者极显著关联。这说明，利用本发明的CAPS分子标记进行茶树抗寒性鉴定具有简单快速，准确率高的优点。
3. 利用本发明的 CAPS分子标记对6份不同茶树幼苗进行抗寒基因型鉴定，并培育验证其成长后的抗寒性状，结果表明与幼苗期的基因型完全一致，说明利用本发明的CAPS分子标记可以为茶树育种材料的早期鉴定与选择提供新途径。
4. 本发明提供的检测方法将筛选到的与茶树抗寒相关SNP位点转化为CAPS标记，仅通过简单 PCR、限制性内切酶酶切和琼脂糖电泳即可完成，处理方便、操作简单、重复性好，经济可靠。该方法能快速有效地进行茶树资源抗寒性评价，和辅助选择具有抗寒性的茶树新品种，缩短育种进程。
说明书附图
图1为ERF1基因突变位点与茶树抗寒性状关联图。
图2为12份茶树资源经室温下和低温处理后相对电导率大小对比图。
图3为12份茶树资源经室温下和低温处理后可溶性糖含量对比图。
图4为6份不同抗寒性茶树叶片基因组DNA凝胶电泳图。
图5为6份不同抗寒性茶树叶片基因组DNA特异性扩增凝胶电泳图。
图6为6份不同抗寒性茶树品种基因组DNA扩增产物经限制性内切酶TaqI酶切的凝胶电泳图，其中3、4泳道为低温耐受品种，5、6泳道为低温敏感品种，1、2泳道为其他品种。
图7为DREB基因突变位点与茶树抗寒性状关联图。
图8为6份不同抗寒性茶树品种基因组DNA扩增产物经限制性内切酶NheI酶切的凝胶电泳图，其中4、5泳道为低温耐受品种，3、6泳道为低温敏感品种，1、2泳道为其他品种。
图9为96份茶树种质资源基因组DNA扩增产物经限制性内切酶TaqI酶切的凝胶电泳图。
图10为6份茶树幼苗基因组DNA扩增产物经限制性内切酶TaqI酶切的凝胶电泳图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所使用的材料或试剂均可通过商业途径或已知公开的方法得到。
实施例1茶树抗寒性相关基因ERF1的SNP位点的筛选鉴定
茶树抗寒性相关基因ERF1被定位于7号染色体上， 本实施例以‘铁观音’基因组为参考基因组，通过SNP calling获得ERF1基因的分子变异数据，借助R软件将ERF1基因的分子变异数据与茶树品种的抗寒表型数据进行关联分析，在基因的编码区筛选到1个与茶树抗寒性状显著关联的非同义突变位点（Chr07:221281848_C/T）（如图1所示），通过DNAMAN7软件对野生型、突变型核苷酸序列进行比对，对SNP位进行验证，最终发现该非同义SNP位点存在C碱基时，扩增片段只能被TaqI酶切，当该SNP突变为T碱基则不能被酶切。
实施例2 ERF1基因SNP位点转化CAPS分子标记及相关引物
选择内切酶TaqI酶，选取位于TaqI的酶切位点的SNP位点前、后大约500bp碱基序列为CAPS分子标记，CAPS分子标记的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，利用Snapgene软件设计CAPS分子标记的引物序列对；定位过程中所用标记及其引物信息见表1。
表1 ERF1基因相关CAPS分子标记、引物序列信息
所述CAPS分子标记序列（（SEQ ID No.1））中划线处为TaqI酶的酶切位点，加粗碱基处为突变位点。
所述引物序列送至生工生物工程（上海）股份有限公司合成。
实施例3 利用ERF1基因相关CAPS分子标记检测验证茶树抗寒性
1、供试茶树材料
某年1月湖南最低气温达到-3℃，随着气温回暖，在田间观测时发现不同茶树受害后的抗寒性表现出差异。同年2月选择湖南省某茶叶基地（113°E，28°N）的102份茶树品种进行田间受害情况调查和统计，每个品种以株为单位随机调查30 株，受害情况采用 5 级评分法进行调查，最高的等级i为4，最低的等级i为0，具体分级情况见表2。
表2茶树寒害情况分级表
| 等级（i） | 受害叶片占比（%） |
| 0 | 受害叶片 ≤ 5 |
| 1 | 5＜受害叶片 ≤15 |
| 2 | 15 ＜受害叶片 ≤ 25 |
| 3 | 25 ＜受害叶片 ≤50 |
| 4 | 受害叶片＞50 |
冻害指数（Freezing Sensitivity Index，H） 的计算公式如下：
H (%) = [Σ(ni × x i)/(N × 4)]× 100
H——冻害指数
ni——表示各个等级茶树的株数
xi——表示相应的等级对应的评分i
N——表示调查的茶树总株数（每个品种）。
按照冻害指数将茶树抗寒性能分为4个等级：抗寒性强（H≤10）、抗寒性较强（10.0<H≤20.0）、抗寒性中等（20<H≤50.0）、抗寒性弱（H＞50）。
根据抗寒性能的等级将茶树品种分为3种类型：低温耐受品种（抗寒性强（H≤10）），用符号R表示；低温敏感品种（抗寒性弱（H＞50）），用符号S表示；其它品种（抗寒性较强（10.0<H≤20.0）或者抗寒性中等（20<H≤50.0）），用符号N表示。
田间抗寒性状记录后，选取12份茶树资源（乌牛早、舒茶早、碧香早、龙井43、安茗早、寒绿、铁观音、桃源大叶、玉笋、尖波黄、晚来春、紫鹃）带回实验室进一步处理，测定其在室温下和低温处理后相对电导率大小、可溶性糖含量后，测定结果见图2（相对电导率）、图3（可溶性糖含量），从中筛选出6份抗寒性差异较大的品种，基于需要包括抗寒性强、抗寒性弱和抗寒性介于两者之间的品种的原则，6个品种最终筛选如下：低温耐受品种2种（舒茶早、乌牛早）；其他品种2种（桃源大叶、铁观音）；低温敏感品种2种（紫鹃、尖波黄）。
2、检测方法
（1）提取待测茶树样本DNA；
将上述6份茶树材料剪取其一芽二叶并立即用液氮处理，后续采用 FastPure®Plant DNA Isolation Mini Kit（南京诺唯赞生物科技股份有限公司）的试剂盒提取基因组DNA，提取的DNA产物在1. 0％的琼脂糖凝胶上进行电泳验证DNA质量，验证结果如图4所示， 1、2泳道为其他品种，3、4泳道为低温耐受品种，5、6泳道为低温敏感品种，各样本DNA电泳条带清晰。
（2）以提取所得各茶树基因组DNA为模板，利用实施例2提供的CAPS分子标记引物进行特异性PCR扩增，得到扩增产物；
20μL PCR扩增反应体系包括：正向引物1μL，反向引物1μL，模板DNA 1μL， 2×Rapid Taq Master Mix 10μL， ddH2O 7μL。
PCR扩增的反应条件为：94℃预变性5min，94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸40s，共35个循环；72℃延伸5min；。
取3μL PCR扩增产物，在1％琼脂糖凝胶上电泳检测扩增结果，确认扩增结果准确后，保存于4 ℃备用。各泳道对应茶树品种与步骤（1）一致，验证结果如图5所示，以各茶树基因组DNA为模板得到的扩增产物条带片段大小一致。
（3）利用限制性内切酶TaqI对不同茶树品种基因组DNA的扩增产物酶切，将所得酶切产物分别在1. 0％的琼脂糖凝胶上进行电泳，然后在凝胶成像仪上观察电泳带型、保存实验结果；
10μL酶切体系包括扩增产物3μL，TaqI 0.5μL，10× FastDigest Green Buffer 1μL，ddH2O 5.5μL；酶切条件为65℃孵育35min。
3、结果分析
图6为上述6份不同抗寒性品种经CAPS分子标记检测得到的酶切片段电泳图，其中其他品种置于1、2泳道，酶切产物包含3条条带，条带长度分别为539bp、383bp和156bp；低温耐受品种置于3、4泳道，酶切产物包含2条条带，条带长度分别为383bp和156bp；低温敏感品种置于5、6泳道，酶切产物包含1条条带，条带长度为539bp，与酶切前的条带长度一致。可见，利用此CAPS分子标记方法可以有效鉴定不同抗寒类型的茶树品种。
对比例1茶树抗寒性相关基因DREB的SNP位点、CAPS标记的筛选与检测
1、茶树抗寒性相关基因DREB的SNP位点的筛选
本对比例同样以‘铁观音’基因组为参考基因组，通过SNP calling获得DREB基因的分子变异数据，借助R软件将DREB基因的分子变异数据与茶树品种的抗寒表型数据进行关联分析，结果如图7所示，随后在基因的编码区选取1个非同义突变位点（Chr04:227495945_C/T），通过DNAMAN7 软件对野生型、突变型核苷酸序列进行比对，对SNP位进行验证，最终发现该非同义SNP位点存在C碱基时，扩增片段只能被NheI酶切，当该SNP突变为T碱基则不能被酶切。
2、茶树抗寒性相关基因DREB的SNP位点转化CAPS标记及相关引物
选择内切酶NheI酶，选取位于NheI的酶切位点的SNP位点前、后大约500bp碱基序列为CAPS分子标记，CAPS分子标记的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示，利用Snapgene软件设计CAPS分子标记的引物序列对；定位过程中所用标记及其引物信息见表2。
表2 DREB基因相关CAPS分子标记、引物序列信息
所述CAPS分子标记序列（SEQ ID No.4）中划线处为NheI酶的酶切位点，加粗碱基处为突变位点。
所述引物序列送至生工生物工程（上海）股份有限公司合成。
3、利用DREB基因相关CAPS分子标记检测验证茶树抗寒性
选取与实施例3一致的6份抗寒性差异较大的品种：低温耐受品种2种（舒茶早、乌牛早）；其他品种2种（桃源大叶、铁观音）；低温敏感品种2种（紫鹃、尖波黄）。
按照上述实施例3中记载的检测方法步骤对选取的6个品种依次进行扩增、酶切、电泳实验，其中利用表2中的引物（SEQ ID No.5、SEQ ID No.6）进行PCR扩增，利用NheI酶进行酶切，其他条件保持一致。
6份不同抗寒性品种经DREB基因相关CAPS分子标记检测得到的酶切片段电泳结果见图8，其中其他品种置于1、2泳道；低温耐受品种置于4、5泳道；低温敏感品种置于3、6泳道，根据6个品种酶切带型与对应标记的抗寒类型比对分析之后发现，虽然酶切产物具有一定的多态性，但田间抗寒性的吻合率较低。
实施例4茶树种质资源酶切带型与抗寒性关联情况的进一步验证
本实施例利用实施例2提供的CAPS分子标记与引物，通过实施例3提供的检测方法进一步验证96份茶树种质资源酶切带型与抗寒性关联情况，并通过分析不同遗传模型下该突变位点与茶树抗寒性的关系验证检测结果的可靠性。
1、供试茶树材料
从湖南省某茶叶基地（113°E，28°N）分别采摘 96个茶树品种的一芽二叶，经液氮固样后保存于-80 ℃冰箱。同时，对该96个茶树品种进行田间观测，记录茶树群体的抗寒性状，观测方法与实施例3一致。
2、检测方法
步骤与实施例3中检测方法一致。
3、结果分析
图9（A-D）为本实施例中96份茶树种质资源经CAPS分子标记检测得到的酶切片段电泳图，其中有31份材料酶切带型为2条，57份材料酶切带型为3条，8份材料酶切带型为1条。将上述记录的96个茶树品种抗寒性状对应标记在电泳图中，分为三种类型：低温耐受品种（R）、其它品种（N）、低温敏感品种（S）。
利用R软件将酶切带型与茶树群体的抗寒性状进行关联分析，发现CPAS分子标记与茶树抗寒性有显著或者极显著关联。如表3所示，在共显性模型下，Chr07:221281848_C/T位点的C/C基因型与茶树抗寒性有极显著关联（P<0.01）；在显性模型下Chr07:221281848_C/T位点的C/C基因型与茶树抗寒性有极显著关联（P<0.01）；在隐性模型下Chr07:221281848_C/T位点的 C/C和 C/T 基因型与茶树抗寒性有极显著关联（ P<0.01）。在超显性模型下，Chr07:221281848_C/T位点的C/C和 T/T基因型与茶树抗寒性有极显著关联（P<0.01）
表3 不同遗传模型下突变位点与茶树品种抗寒性的关系
实施例5茶树幼苗抗寒性鉴定与验证
随机挑选6份茶树成熟种子进行萌发，取萌发一周的茶树幼苗为材料，每份材料取一片嫩叶（约湿重0.2g），采用实施例2提供的CAPS分子标记与引物、实施例3提供的检测方法进行茶树幼苗的抗寒性鉴定，6份茶树幼苗经CAPS分子标记检测得到的酶切片段电泳图见图10，电泳带型分别为3条带、3条带、1条带、2条带、2条带和1条带，因此基因型分别为杂合突变型（CT）、杂合突变型（CT）、纯合突变型（TT）、野生型（CC）、野生型（CC）和纯合突变型（TT）。
继续培育待6份茶苗进入3龄期（3年苗龄），进行抗寒实验，观测抗寒性状，方法如实施例3中所述，结果表明6份材料寒害系数H分别为27.3、40.6、62.4、5.6、7.5、68.2，分别可鉴定为其他品种（N）、其他品种（N）、低温敏感品种（S）、低温耐受品种（R）、低温耐受品种（R）低温敏感品种（S），与幼苗期的基因型完全一致（如图10所示）。由此可见，本发明的分子标记可以在幼苗期准确预测茶树的抗寒性能，大幅度缩短了抗寒茶树品种选育的周期，可以在生产中大规模应用。
通过上述实施例结果与分析可知，本发明的SNP位点、CAPS分子标记（包括引物、限制性内切酶）能够有效鉴定不同茶树资源的抗寒性，将其分为低温耐受品种、其他品种和低温敏感品种三个类群。不仅快速有效，而且在苗期就可以进行鉴定，为茶树品种的育种选择工作提供帮助。
上述实施例阐明的内容应当理解为这些实施例仅用于更清楚地说明本发明，而不用于限制本发明的范围，在阅读了本发明之后，本领域技术人员对本发明的各种等价形式的修改均落入本申请所附权利要求所限定的范围。
Claims (10)
1.一种茶树抗寒性相关基因ERF1的SNP位点，其特征在于，所述SNP位点位于茶树7号染色体第221281848位碱基，碱基多态性为C/T，所述SNP位点为Chr07:221281848_C/T。
2.一种茶树抗寒性相关基因ERF1的CAPS分子标记，其特征在于，所述CAPS分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述核苷酸序列包含权利要求1所述的SNP位点。
3.扩增权利要求2所述的CAPS分子标记的引物，其特征在于，所述引物的序列如下：
正向引物序列：5 '- TTAGAATCCAAGCTCCTCCTAGACT -3 '（SEQ ID NO.2）；
反向引物序列：5 '- AGTACACCAATGAGTGTGGTGAAG -3 '（SEQ ID NO.3）。
4.一种使用权利要求2所述CAPS分子标记的鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）提取待测茶树样本DNA；
（2）以待测茶树样本DNA为模板，利用权利要求3所述的引物进行PCR扩增，得到扩增产物；
（3）利用限制性内切酶TaqI对扩增产物酶切后电泳，得待测茶树样本电泳带型；
（4）带型比对与鉴定：若电泳带型为2条带，则待测茶树样本为SNP位点为C，基因型为CC，鉴定待测茶树样本为抗寒性强的低温耐受品种； 若电泳带型为3条带，则待测茶树样本为SNP位点为杂合突变，基因型为CT，鉴定待测茶树样本为抗寒性中等的其他品种；若电泳带型为1条带，则待测茶树样本为SNP位点为T，基因型为TT，鉴定待测茶树为样本抗寒性弱的低温敏感品种。
5.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，每份步骤（2）中所述PCR扩增的反应体系包括：正向引物1μL，反向引物1μL，模板DNA 1μL， 2×Rapid Taq Master Mix 10μL，ddH2O 7μL。
6.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，步骤（2）中所述PCR扩增的反应条件为：94℃预变性5min，94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸40s，共35个循环；72℃延伸5min；4 ℃保存。
7.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，每份步骤（3）中酶切体系包括扩增产物3μL，TaqI 0.5μL，10× FastDigest Green Buffer 1μL，ddH2O 5.5μL；酶切条件为65℃孵育35min。
8.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，步骤（4）中电泳带型为2条带时，条带片段大小分别为383bp、156bp；电泳带型为3条带时，条带片段大小分别为539bp、383bp、156bp；电泳带型为1条带时，条带片段大小为539bp。
9.权利要求1所述的SNP位点或权利要求2所述的CAPS分子标记或权利要求3所述的引物在茶树抗寒性鉴定分型以及辅助选择育种中的应用。
10.权利要求4-8任一项所述的检测方法在茶树抗寒性鉴定分型以及辅助选择育种中的应用。
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