CN103103184A - 与大白菜橙色叶球基因Br-or连锁的SSR及InDel分子标记引物及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了与大白菜橙色叶球基因Br-or紧密连锁的SSR及InDel分子标记引物及应用。该标记引物的获得是以橙色大白菜和普通白色大白菜及其F2S4分离群体的基因组DNA为模板，通过480对SSR及InDel引物对F2S4中橙色叶球和白色叶球单株DNA混合池进行多态性引物筛选，然后通过对F2S4群体的单株进行分析，筛选与大白菜橙色叶球基因Br-or连锁的分子标记，成功获得了与Br-or基因连锁的15个Br-SSR及3个Br-InDel标记引物，在第9连锁群上（A09）构建了大白菜橙色叶球基因Br-or的分子遗传图谱。连锁分析发现Br-or基因两侧连锁最紧密两标记的遗传距离分别为0.11cM和0.79cM，具有检测方便，扩增稳定，重复性和准确率高等优点。为大白菜橙色叶球性状的分子辅助选择育种提供依据，加快育种进程。
Description
技术领域
本发明属于蔬菜育种及分子遗传学领域，具体涉及与大白菜橙色叶球基因Br-or连锁的SSR及InDel分子标记引物的开发及应用。
背景技术
大白菜(Brassica campestris L.ssp.pekinensis)属十字花科芸薹属芸薹种白菜亚种，是起源于我国的主要蔬菜作物之一，与人们的日常生活密切相关，近年来，随着人们生活水平的提高，人们对大白菜品质的要求日益高涨。因此，大白菜品质育种受到越来越多国内外学者，育种家的重视。
申请人从1993年开始进行橙色大白菜育种，其配置的大白菜一代杂种“金冠1号”和“金冠2号”橙色大白菜，于2004通过陕西省审定，受到国内外的广泛关注，同时也获得了大白菜生产者和消费者的青睐。但是，橙色大白菜的颜色直到其结球末期才能表现出，而且得采用田间逐个剖球观察，操作起来费时费力，极大的延缓了育种进程。因此为了加快橙色大白菜的育种速度，利用现代的分子生物技术，进行分子标记辅助育种十分必要。
随着分子生物学技术的快速发展，多种基于DNA多态性的分子技术应运而生，并广泛应用于遗传育种研究的各个领域。简单序列重复（simplesequence repeats，SSR），又称为微卫星DNA（microsatellite，DNA），是一类由1-6个核苷酸串联重复组成的DNA序列如（CA）n，（ATG）n，（TAGG）n等重复，其长度一般较短，广泛分布于基因组的不同位置，由于重复次数的不同和重复程度的不完全造成了每个位点的多态性，包括SSR标记和EST-SSR标记两种类型。其中，SSR标记具有共显性、重复性好、多态性丰富、易于检测等优点，已广泛应用于植物遗传多样性分析、遗传图谱构建、基因定位和分子标记辅助育种等研究领域（Tautz and
1994；Powell et al.，1996）。
插入/缺失多态性（Insertion/Deletion，InDel）标记是由于同一位点处的DNA序列在不同个体间发生了核苷酸片段的插入/缺失，根据目标位点两侧的序列设计特异引物进行PCR扩增，扩增片段的长度多态性即是InDel标记。InDel标记是根据同源序列之间的插入缺失差异来开发的，这对于基因组序列未知的作物而言开发具有一定的难度。InDel标记为一共显性标记，具有较好的稳定性及多态性丰富等优点，已被广泛应用于品种的多态性分析（Katherine et al.，2008）、基因的精细定位及图位克隆（Pan et al.，2008）等。
因此，基于以上SSR及InDel标记的优点，申请人利用大白菜的测序结果，开发并成功筛选出与大白菜橙色叶球基因Br-or紧密连锁的分子标记，并构建了Br-or基因的分子遗传图谱，为克隆该基因及利用该分子标记进行橙色大白菜分子辅助育种，加快育种进程奠定了基础。
发明内容
本发明的目的在于，提供一种与大白菜橙色叶球基因Br-or紧密连锁的SSR及InDel分子标记引物，应用该SSR及InDel分子标记引物，在苗期即可鉴定区分橙色叶球和白色叶球大白菜，从而淘汰非目标植株，大大提高选择的效率。
为了实现上述任务，本发明采用如下的技术解决方案：
与大白菜橙色叶球基因Br-or紧密连锁的SSR及InDel分子标记引物，其特征在于，包括以下15个Br-SSR引物对和3个Br-InDel引物对中的至少一对，即可将橙色与白色大白菜区分开；同时使用这多个标记能提高选择的准确性。其中：
引物对Br-InDel（1）的脱氧核糖核苷酸引物序列为：
上游引物（F）：5＇－TGAAATGACCCGTCTGTTGA－3＇
下游引物（R）：5＇－TTGTCTTGCGAAGAGGATGT－3＇
引物对Br-InDel（2）的脱氧核糖核苷酸引物序列为：
上游引物（F）：5＇－TCAGATGAAGAGCGTAGGAG－3＇
下游引物（R）：5＇－AAAAGAGGGAGACAAGATGC－3＇
引物对Br-InDel（3）的脱氧核糖核苷酸引物序列为：
上游引物（F）：5＇－TTCTTCTTCCTCACGCACTC－3＇
下游引物（R）：5＇－GCTCGCCTTCTAAACTGAAT－3＇
引物对Br-SSR（1）的脱氧核糖核苷酸引物序列为：
上游引物（F）：5＇－CCATCAACAAACTCAACCCTG－3＇
下游引物（R）：5＇－CTCTGTTCATAAATACGCCTC－3＇
引物对Br-SSR（2）的脱氧核糖核苷酸引物序列为：
上游引物（F）：5＇－GGTCCGCACAACATATCCTT－3＇
下游引物（R）：5＇－TTGTAGCGGTGTCTAAGCAG－3＇
引物对Br-SSR（3）的脱氧核糖核苷酸引物序列为：
上游引物（F）：5＇－ACGCTCACCGTGCTTCCTTG－3＇
下游引物（R）：5＇－TTCACTTTGCCTTTGTTTCT－3＇
其中所述引物对Br-SSR4的脱氧核糖核苷酸引物序列为：
上游引物（F）：5＇－CCACTCCCTGTATTCCTTATC－3＇
下游引物（R）：5＇－ATCACGTCTACTGGTGCTATG－3＇
引物对Br-SSR（5）的脱氧核糖核苷酸引物序列为：
上游引物（F）：5＇－GTTTGGTCTGTTTCGGCACT－3＇
下游引物（R）：5＇－GCCAAAACAAATCTGCTTGA－3＇
所述引物对Br-SSR（6）的脱氧核糖核苷酸引物序列为：
上游引物（F）：5＇-GTGGGATTTCTGGAGCTTTCA-3＇
下游引物（R）：5＇－AATCTAAACCTGGACCGCAAC－3＇
引物对Br-SSR（7）的脱氧核糖核苷酸引物序列为：
上游引物（F）：5＇－AAGACACCGTGAGTATCTTCT－3＇
下游引物（R）：5＇－TTTCGTCTATTCTTGCTGGAT－3＇
引物对Br-SSR（8）的脱氧核糖核苷酸引物序列为：
上游引物（F）：5＇－TGTGAATGTGCGAATTTTGA－3＇
下游引物（R）：5＇－TCCTCCTACGCTCTTCATCT－3＇
引物对Br-SSR（9）的脱氧核糖核苷酸引物序列为：
上游引物（F）：5＇－TTACGCTCAAGTTCCTGAAT－3＇
下游引物（R）：5＇－GCGATGTACGCTAACGAGAT－3＇
引物对Br-SSR（10）的脱氧核糖核苷酸引物序列为：
上游引物（F）：5＇－TTGGTTTCACTGATGTTTCT－3＇
下游引物（R）：5＇－CCATATTTGGTTGATTGTTC－3＇
引物对Br-SSR（11）的脱氧核糖核苷酸引物序列为：
上游引物（F）：5＇－AGCTCCTGTATGGAACTCAA－3＇
下游引物（R）：5＇－TTCCTTTCTTCTGACAAATC－3＇
引物对Br-SSR（12）的脱氧核糖核苷酸引物序列为：
上游引物（F）：5＇－AATCAACGAAAACGAGGAAT－3＇
下游引物（R）：5＇－GCTCAGATAGAGAAAGGGGG－3＇
引物对Br-SSR（13）的脱氧核糖核苷酸引物序列为：
上游引物（F）：5＇－TGTAACTTAAAGAAAACCAAAA－3＇
下游引物（R）：5＇－CATCACArACTAATCAACCAGA－3＇
引物对Br-SSR（14）的脱氧核糖核苷酸引物序列为：
上游引物（F）：5＇－GTAATGGAGAGTGATGATGA－3＇
下游引物（R）：5＇-TTTGGAACTAAATTGTTTGT-3＇
引物对Br-SSR（15）的脱氧核糖核苷酸引物序列为：
上游引物（F）：5＇－ATTTGGATCGTTGATTGAAT－3＇
下游引物（R）：5＇－ACTTTTTGCTTGTTTGTTTT－3＇
采用上述与大白菜橙色叶球基因Br-or紧密连锁的SSR及InDel分子标记引物，在苗期即可鉴定区分橙色叶球和白色叶球大白菜，从而淘汰非目标植株，大大提高选择的效率。同时大白菜橙色叶球基因Br-or分子遗传图谱的构建可加快克隆该基因。
所述的大白菜橙色球叶基因克隆的方法是：PCR扩增大白菜基因组DNA的多态性片段大小约为150bp、208bp、182bp、122bp、189bp、203bp、193bp、114bp、261bp、168bp、123bp、200bp、175bp、234bp、212bp，分别为与大白菜橙色叶球基因Br-or连锁的分子标记Br-SSR（1－15）的PCR扩增产物；扩增大白菜基因组DNA的多态性片段大小约为280bp、152bp、120bp，即为与大白菜橙色叶球基因Br-or连锁的分子标记Br-InDel（1－3）的PCR扩增产物。其中11个标记（Br-SSR（8－15）及Br-InDel（1－3））位于Br-or的一侧，与Br-or的遗传距离分别为0.38cM、0.38cM、0.44cM、0.43cM、1.43cM、1.98cM、2.33cM、2.96cM、0.11cM、0.38cM、1.05cM；7个标记（Br-SSR（1－7））位于Br-or的另一侧，与Br-or的遗传距离分别为5.01cM、3.11cM、2.57cM、1.17cM、1.17cM、0.79cM、0.79cM，离Br-or最近的两侧标记分别为Br-InDel（1）和Br-SSR（6）。
本发明首次获得了与大白菜橙色叶球基因Br-or最为紧密连锁的分子标记引物，具有检测方便，扩增稳定，重复性和准确率高等优点。其具体有益效果表现在：
（1）获得了在第9连锁群（A09）上构建了大白菜橙色叶球基因Br-or的分子遗传图谱，且在国际上首次获得与Br-or基因最紧密连锁的分子标记Br-InDel（1）和Br-SSR（6），可在橙色叶球大白菜分子标记辅助育种及Br-or基因克隆中发挥重要的作用。
（2）获得了与Br-or紧密连锁的分子标记，并构建了其高密度遗传图谱。其中Br-InDel1与Br-or连锁最为紧密，其遗传距离为0.11cM，能够帮助该基因向推广品种中转移以及与其他抗病、抗逆基因的聚合。
（3）鉴定方便。这18个标记均为共显性标记，具有扩增稳定、检测方便、快速等优点。用这18个分子标记检测Br-or基因，可以确定Br-or的存在与否及存在的状态，进而快速筛选携有Br-or基因的植株，并用于高类胡萝卜素大白菜品种的选育。同时利用分子标记进行检测时还可以避免环境对品种的影响，提高选择的准确性。
（4）提高橙色叶球大白菜的选择效率。在传统的橙色大白菜鉴定过程中，必须等到大白菜结球末期进行剖球才能对橙色性状进行观察统计，因此橙色大白菜的选育不仅费时，而且难度大，成本高。用本发明的分子标记引物，通过检查与大白菜橙色叶球基因Br-or紧密连锁的分子标记，可将表型鉴定的工作大大减少，在苗期即可区分橙色和白色叶球大白菜，从而淘汰非目标植株，因此，利用本发明的与Br-or基因紧密连锁的分子标记，不仅节约成本，而且大大的提高了育种效率，加快了育种进程。
（4）可用于克隆大白菜橙色叶球基因的研究。图位克隆大白菜橙色叶球基因Br-or的前提在于获得与Br-or紧密连锁的分子标记。Br-InDel（1）和Br-SSR（6）在所有已知的分子标记中与Br-or连锁最为紧密，为克隆该基因提供基础。
附图说明
图1是大白菜橙色叶球基因Br-or的遗传连锁图，右侧为遗传连锁图的标记，左侧数据为标记间的遗传距离（cM）。
图2是Br-InDel（1）在橙色和白色混合池及F2S4代单株中的扩增结果。泳道信息：（从左到右）M，50bp DNA ladder；BO是纯合橙色单株池；BW是纯合白色单株池，8个纯合白色单株；8个纯合橙色单株；8个杂合白色单株。
图3是Br-SSR（6）在橙色和白色混合池及F2S4代单株中的扩增结果。泳道信息：（从左到右）8个纯合白色单株；8个纯合橙色单株；8个杂合白色单株；BO是纯合橙色单株池；BW是纯合白色单株池；M，50bp DNAladder。
以下结合附图和实施例对本发明作进一步的详细说明。
具体实施方式
以下实施例中的实验方法均为常规方法，所涉及的实验试剂均为常规生化试剂。
本发明的与大白菜橙色叶球基因Br-or紧密连锁的SSR及InDel分子标记引物是通过以下步骤获得的：
（1）群体材料准备
以橙色叶球大白菜“11S39-2”为母本（原名01S1024，为金冠2号大白菜的亲本，公开于《西北农业学报》2007，01期、205页，张鲁刚，惠麦侠，张明科.彩色大白菜新品种“金冠2号”的选育[J]：204-206），白菜叶球大白菜“11J15”为父本（原名92S24，公开于《中国蔬菜》，2010，14期、35页第16行，牛娜，郑晨光，张鲁刚，胥宇建，张立志，付文婷.大白菜裂球性状的遗传与RAPD标记[J].44-48）杂交产生的F1群体，然后通过单粒传获得其F2S4群体。
（2）大白菜单株基因组总DNA的提取
A、取0.2g去掉主脉的新鲜嫩叶片，塞入1.5mL的离心管中，放入液氮中速冻，用质量分数为75%的酒精清洗过的干净塑料研棒迅速研磨至粉末；
B、向离心管中加700μl经65℃预热的CTAB提取液（CTAB：2％，Tris-HCl（pH=8.0）：100mmol/L，EDTA：20mmol/L，NaCl：1.4mol/L），再加入8μL的β-巯基乙醇，迅速混匀；
C、随后将离心管放入65℃水浴中，中间每间隔5min分钟摇一次，水浴30min；
D、取出离心管，加入等体积的酚、氯仿和异戊醇的混合物（酚：氯仿：异戊醇=25：24:1），摇匀15min后，常温下12000r/min离心10min；
E、将上层液相（约700μl）转移到另一离心管中，加入等体积的氯仿和异戊醇混合溶液（氯仿：异戊醇＝24：1），轻轻摇匀10min，常温下12000r/min离心10min；
F、取上清（约500μl），加入2倍体积经预冷的无水乙醇，轻轻混匀使DNA抱团，-20℃条件下沉淀30min，4℃条件下12000r/min离心10min；
G、弃上清，加入500μl质量百分数为75%的乙醇洗涤沉淀2次后，沉淀物室温晾干；
H、加入500μl的TE缓冲液溶解DNA，加入0.3μl的RNaseA（10μg/μl），混匀后稍离心，37℃保温30min；
I、加入3mol/L的NaAc溶液50μL和2倍体积经预冷的无水乙醇，轻轻混匀使DNA抱团，-20℃条件下沉淀30min；
J、在4℃条件下，12000r/min离心10min，弃上清，加入质量百分数为75％的乙醇清洗沉淀1～2次后，沉淀物室温晾干，加入400μl～500μl的灭菌ddH2O溶解使用，或加入质量百分数为75％的乙醇-20℃保存备用；
（3）DNA池的构建
从“11S39-2”与“11J15”的F2S4分离群体中，根据叶球颜色调查结果，随机取典型的10个纯合橙色叶球单株和10个纯合白色球色单株株的DNA样品，等量混合组成橙色单株DNA池（BO）和白色单株DNA池（BW）。
（4）SSR及InDel序列的获得
从白菜基因组网站（http://brassicadb.org/brad/）下载白菜A09连锁群从349189811到37123981的DNA序列。利用SSRHunter软件对该序列内的SSR位点进行检索，检索标准为：含二、三、四、五和六核苷酸类型的SSR基序（motif）的最小重复数分别为5，4，3，3和3次。将检索得到的含SSR位点的序列在芸薹属基因组网站（http://www.brassica.bbsrc.ac.uk/）进行同源性比对，SSR序列选取条件为比对相似性85%以上，同时有3条以上的同源序列与该序列存在SSR位点差异。在Blast过程中发现，虽然有些序列与该SSR引物序列不存在SSR差异，但是在其侧翼序列存在InDel差异，将该InDel差异在同源序列中出现3次以上的序列作为目标InDel引物序列。
（5）SSR及InDel分子标记引物设计
根据SSR、InDel差异位点两端的序列，采用Primer5软件对符合条件的目标序列设计引物。设计引物参数原则：退火温度为50℃~60℃，最佳温度为55℃；引物长度18bp~24bp；产物大小为100bp~300bp；引物（G+C）含量为40%~60%，引物不出现二级结构、发夹结构和二聚体。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。
（6）多态性引物筛选和SSR及InDel分子标记分析
用橙色大白菜单株DNA池（BO）和白色大白菜单株DNA池（BW）作模板，按照下述PCR扩增条件和程序进行分析。
所述的PCR扩增包括：20μl PCR反应体系为：模板DNA50ng，Taq酶1U，10μmol的上、下游引物各0.8μl，10mM dNTPs0.32μl，10×PCRbuffer2.0μl，25mM MgCl21.2μl，用无菌蒸馏水补充反应体系至20μl；PCR反应程序为：先94℃，变性5min；然后94℃，变性30s，56℃，复性1min，72℃，延伸1min，共30个循环；最后72℃，延伸10min，4℃保存。
选用所设计的480对引物，将橙色单株池与白色单株池间表现出相同多态性的引物重复分析3次，然后在建池的30株极端个体间进行多态性验证，如果扩增结果与在两池间扩增结果一致，则将确实存在多态性的引物用于F2S4代单株的SSR及InDel分析。最后根据连锁交换规律，结合单株基因型资料与田间对球色调查统计的结果，利用JoinMap3.0软件构建了大白菜橙色叶球基因Br-or的分子遗传连锁图，获得了与Br-or紧密连锁的15个SSR标记；3个InDel标记。
以下是发明人给出的具体实施例。
实施例1：Br-InDel（1）引物的应用
（一）采用CTAB法提取白菜基因组DNA，提取步骤如下所示：
A.取0.2g去掉主脉的新鲜嫩叶片，塞入1.5ml的离心管中，放入液氮中速冻，用质量分数75%的酒精清洗过的干净塑料研棒迅速研磨至粉末；
B.向离心管中加700μl经65℃预热的CTAB提取液（CTAB：2％，Tris-HCl（pH8.0）：100mmol/L，EDTA：20mmol/L，NaCl：1.4mol/L），再加入8μl的β-巯基乙醇，迅速混匀；
C.随后将离心管放入65℃水浴中，中间每间隔5min分钟摇一次，水浴30min；
D.取出离心管，加入等体积的酚、氯仿和异戊醇的混合物（酚：氯仿：异戊醇=25：24：1），摇匀15min后，常温下12000r/min离心10min；
E.将上层液相（约700μl）转移到另一离心管中，加入等体积的氯仿和异戊醇的混合物（氯仿：异戊醇=24：1），轻轻摇匀10min，常温下12000r/min离心10min；
F.取上清（约500μl），加入2倍体积预冷的无水乙醇，轻轻混匀使DNA抱团，-20℃条件下沉淀30min，4℃条件下12000r/min离心10min；
G.弃上清，加入500μl质量分数为75%的乙醇洗涤沉淀2次后，沉淀物室温晾干；
H.加入500μl的TE缓冲液溶解DNA，加入0.3μl的RNaseA（10μg/μL），混匀后离心，37℃保温30min；
I.加入3mol/L NaAc溶液50μL和2倍体积经预冷的无水乙醇，轻轻混匀使DNA抱团，-20℃条件下沉淀30min；
J.在4℃条件下，12000r/min离心10min，弃上清，加入质量分数为75％的乙醇清洗沉淀1～2次后，沉淀物室温晾干，加入400μl-500μl灭菌的ddH2O溶解使用，或加入质量百分数为75％乙醇-20℃保存备用；
（二）PCR扩增
用橙色单株DNA池（BO）和白色单株DNA池（BW）作模板，按照下述PCR扩增条件和程序进行分析，
①PCR扩增条件：20μl的PCR反应体系为：模板DNA50ng，Taq酶1U，10umol的上、下游引物各0.8μl，10mM dNTPs0.32μl，10×PCRbuffer2.0μl，25mM MgCl21.2μl，用无菌蒸馏水补充反应体系至20μl。
②PCR反应程序为：先94℃，5min；然后94℃，30s，56℃，1min，72℃，1min，共30个循环；最后72℃，10min，4℃保存。PCR反应在Bio-RadS100096型PCR仪中进行。
（三）6%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳
（1）6%变性聚丙烯酰胺凝胶的制备方法如下：
①玻璃板的清洗：用清水将玻璃板冲洗干净，再用无水乙醇冲洗并空置晾干，洗板时应将长板和短板分开，避免相互污染。
②涂板：Repel（剥离硅烷）溶液（3ml氯仿+300μl Repel）均匀地涂在短板上，Binding（亲和硅烷）溶液（3ml无水乙醇+10μl冰醋酸+10μlBinding）均匀地涂在长板上，室温放置20min。在涂板过程中，注意避免两种溶液相互污染。Repel、Binding溶液的作用：便于丙烯酰胺凝胶固定在长板上，卸胶板时易于与短板分离。
③灌胶：装上长板和短板，调至水平，预检查梳子插入的最佳位置。取50ml，6％的变性PAGE凝胶溶液，加300μl浓度为10％的过硫酸氨（APS）和40μl的TEMED，轻轻混匀，灌完后，将梳子插入适当位置，再将板调至水平，用夹子夹紧（以防点样时漏样），室温下胶板凝固1h。
（2）电泳：
①预电泳：从胶板中将梳子小心拔出，将插梳子的胶板上端清洗干净，用纸擦干玻璃板（以防电泳时短路）。将胶板装到电泳槽中，加入适量1×TBE电泳缓冲液，再将梳子轻轻插入，其深度为刚进入胶面1mm处。接通电源，恒功率70W预电泳30min，用移液器将点样孔中的气泡逐个赶出。
②电泳检测：冲洗加样孔析出的尿素，取变性后的PCR扩增产物3μl，恒功率70W电泳至溴酚兰距胶板底部5cm-10cm时停止电泳（约45min）。
（3）银染步骤：
①固定：将玻璃板从电泳槽取出，拔出梳子，轻轻将长板取下，放入2L浓度为10％的醋酸溶液中，轻轻摇动20min。
②漂洗：取出长板，用蒸馏水漂洗2次，每次3min。
③染色：在2L蒸馏水中加入2g硝酸银，避光染色约10min。
④显影：在蒸馏水中迅速漂洗后，转入预冷的1L含甲醛的氢氧化钠溶液中（15g氢氧化钠固体溶于1L蒸馏水+4ml甲醛），显影至条带清晰为止。
⑤终止：将板取出放入醋酸溶液中，终止2min。
⑥漂洗：将板放入蒸馏水中漂洗10min，自然风干，照相。
（四）多态性引物筛选及InDel标记分析
选用所设计的480对引物，将橙色单株池与白色单株池间表现出相同多态性的引物重复分析3次，然后在建池的30株极端个体间进行多态性验证，如果扩增结果与在两池间扩增结果一致，则将确实存在多态性的引物用于F4代单株的InDel分析。最后根据连锁交换规律，结合单株基因型资料与田间对球色调查统计的结果，利用JoinMap3.0软件构建大白菜橙色叶球基因Br-or的分子遗传图谱，获得了与Br-or最为紧密连锁的InDel标记，即Br-InDel（1）。
实施例2：Br-SSR6引物的应用
（一）采用CTAB法提取白菜基因组DNA,提取步骤如下所示：
A、取0.2g去掉主脉的新鲜嫩叶片，塞入1.5mL的离心管中，放入液氮中速冻，用75%酒精清洗过的干净塑料研棒迅速研磨至粉末；
B、向离心管中加700μL经65℃预热的CTAB提取液（CTAB：2％，Tris-HCl（PH8.0）：100mmol/L，EDTA：20mmol/L，NaCl：1.4mol/L），再加入8μLβ-巯基乙醇，迅速混匀；
C、随后将离心管放入65℃水浴中，中间每间隔5min分钟摇一次，水浴30min；
D、取出离心管，加入等体积的酚：氯仿：异戊醇（25:24:1）的混合物，摇匀15min后，常温下12000r/min离心10min；
E、将上层液相（约700μL）转移到另一离心管中，加入等体积的氯仿：异戊醇（24:1），轻轻摇匀10min，常温下12000r/min离心10min；
F、取上清（约500μL），加入2倍体积预冷的无水乙醇，轻轻混匀使DNA抱团，-20℃条件下沉淀30min，4℃条件下12000r/min离心10min；
G、弃上清，加入500μl75%乙醇洗涤沉淀2次后，沉淀物室温晾干；
H、加入500μL TE缓冲液溶解DNA，加入0.3μL RNaseA(10μg/μL)，混匀后稍离心，37℃保温30min；
I、加入3mol/L NaAc溶液50μL和2倍体积预冷的无水乙醇，轻轻混匀使DNA抱团，-20℃条件下沉淀30min；
J、在4℃条件下，12000r/min离心10min，弃上清，加入质量分数为75％的乙醇清洗沉淀1～2次后，沉淀物室温晾干，加入400μl-500μl灭菌的ddH2O溶解使用，或加入质量分数为75％的乙醇-20℃保存备用；
（二）PCR扩增
用橙色单株DNA池(BO)和白色单株DNA池(BW)作模板，按照下述PCR扩增条件和程序进行分析，
①PCR扩增条件：20μlPCR反应体系为：模板DNA50ng，Taq酶1U，10μmol的上、下游引物各0.8μl，10mM dNTPs0.32μl，10×PCR buffer2.0μl，25mM MgCl21.2μl，用无菌蒸馏水补充反应体系至2μl。
②PCR反应程序为：先94℃，变性5min；然后94℃，变性30s，56℃，复性1min，72℃，延伸1min，共30个循环；最后72℃，延伸10min，4℃保存。PCR反应在Bio-Rad S100096型PCR仪中进行。
（三）6%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳
（1）6%变性聚丙烯酰胺凝胶的制备方法如下：
①玻璃板的清洗：用清水将玻璃板冲洗干净，再用无水乙醇冲洗并空置晾干，洗板时应将长板和短板分开，避免相互污染。
②涂板：Repel（剥离硅烷）溶液（3ml的氯仿+300μl的Repel）均匀地涂在短板上，Binding（亲和硅烷）溶液（3ml无水乙醇+10μl冰醋酸+10μlBinding）均匀地涂在长板上，室温放置20min。在涂板过程中，注意避免两种溶液相互污染。Repel、Binding溶液的作用：便于丙烯酰胺凝胶固定在长板上，卸胶板时易于与短板分离。
③灌胶：装上长板和短板，调至水平，预检查梳子插入的最佳位置。取50ml，6％的变性PAGE凝胶溶液，加300μl浓度为10％的过硫酸氨（APS）和40μl的TEMED，轻轻混匀，灌完后，将梳子插入适当位置，再将板调至水平，用夹子夹紧（以防点样时漏样），室温下胶板凝固1h。
（2）电泳：
①预电泳：从胶板中将梳子小心拔出，并将插梳子的胶板上端清洗干净，用纸擦干玻璃板（以防电泳时短路）。将胶板装到电泳槽中，加入适量1×TBE电泳缓冲液，再将梳子轻轻插入，其深度为刚进入胶面1mm处。接通电源，恒功率70W预电泳30min，用移液器将点样孔中的气泡逐个赶出。
②电泳检测：冲洗加样孔析出的尿素，取变性后的PCR扩增产物3μl，恒功率70W电泳至溴酚兰距胶板底部5cm-10cm时停止电泳（约45min）。
（3）银染步骤：
①固定：将玻璃板从电泳槽取出，拔出梳子，轻轻将长板取下，放入2L浓度为10％的醋酸溶液中，轻轻摇动20min。
②漂洗：取出长板，用蒸馏水漂洗2次，每次3min。
③染色：在2L蒸馏水中加入2g硝酸银，避光染色约10min。
④显影：在蒸馏水中迅速漂洗后，转入预冷的1L含甲醛的氢氧化钠溶液（15g氢氧化钠固体溶于1L蒸馏水+4ml甲醛）中，显影至条带清晰为止。
⑤终止：将板取出放入醋酸溶液中，终止2min。
⑥漂洗：将板放入蒸馏水中漂洗10min，自然风干，照相。
（四）多态性引物筛选及SSR标记分析
选用所设计的480对引物，将橙色单株DNA池与白色单株DNA池间表现出相同多态性的引物重复分析3次，然后在建池的30株极端个体间进行多态性验证，如果扩增结果与在两池间扩增结果一致，则将确实存在多态性的引物用于F2S4代单株的SSR分析。最后根据连锁交换规律，结合单株基因型资料与田间对球色调查统计的结果，利用JoinMap3.0软件构建大白菜橙色叶球基因Br-or的分子遗传连锁图，获得了与Br-or较为紧密连锁的SSR标记，即Br-SSR（6）。
Claims (5)
1.与大白菜橙色叶球基因Br-or紧密连锁的SSR及InDel分子标记引物，其特征在于，包括以下15个Br-SSR引物对和3个Br-InDel引物对中的至少一对，即可将橙色叶球与白色叶球大白菜区分开；其中：
引物对Br-InDel（1），其脱氧核糖核苷酸引物序列为：
上游引物（F）：5＇－TGAAATGACCCGTCTGTTGA－3＇；
下游引物（R）：5＇－TTGTCTTGCGAAGAGGATGT－3＇；
引物对Br-InDel（2），其脱氧核糖核苷酸引物序列为：
上游引物（F）：5＇－TCAGATGAAGAGCGTAGGAG－3＇；
下游引物（R）：5＇－AAAAGAGGGAGACAAGATGC－3＇；
引物对Br-InDel（3）的脱氧核糖核苷酸引物序列为：
上游引物（F）：5＇－TTCTTCTTCCTCACGCACTC－3＇；
下游引物（R）：5＇－GCTCGCCTTCTAAACTGAAT－3＇；
引物对Br-SSR（1），其脱氧核糖核苷酸引物序列为：
上游引物（F）：5＇－CCATCAACAAACTCAACCCTG－3＇
下游引物（R）：5＇－CTCTGTTCATAAATACGCCTC－3＇；
引物对Br-SSR（2），其脱氧核糖核苷酸引物序列为：
上游引物（F）：5＇－GGTCCGCACAACATATCCTT－3＇
下游引物（R）：5＇－TTGTAGCGGTGTCTAAGCAG－3＇；
引物对Br-SSR（3），其脱氧核糖核苷酸引物序列为：
上游引物（F）：5＇－ACGCTCACCGTGCTTCCTTG－3＇；
下游引物（R）：5＇-TTCACTTTGCCTTTGTTTCT-3＇；
引物对Br-SSR（4），其脱氧核糖核苷酸引物序列为：
上游引物（F）：5＇－CCACTCCCTGTATTCCTTATC－3＇；
下游引物（R）：5＇-ATCACGTCTACTGGTGCTATG-3＇；
引物对Br-SSR（5），其脱氧核糖核苷酸引物序列为：
上游引物（F）：5＇－GTTTGGTCTGTTTCGGCACT－3＇；
下游引物（R）：5＇－GCCAAAACAAATCTGCTTGA－3＇；
引物对Br-SSR（6），其脱氧核糖核苷酸引物序列为：
上游引物（F）：5＇－GTGGGATTTCTGGAGCTTTCA－3＇；
下游引物（R）：5＇－AATCTAAACCTGGACCGCAAC－3＇；
引物对Br-SSR（7），其脱氧核糖核苷酸引物序列为：
上游引物（F）：5＇－AAGACACCGTGAGTATCTTCT－3＇；
下游引物（R）：5＇－TTTCGTCTATTCTTGCTGGAT－3＇；
引物对Br-SSR（8），其脱氧核糖核苷酸引物序列为：
上游引物（F）：5＇－TGTGAATGTGCGAATTTTGA－3＇；
下游引物（R）：5＇－TCCTCCTACGCTCTTCATCT－3＇；
引物对Br-SSR（9），其脱氧核糖核苷酸引物序列为：
上游引物（F）：5＇－TTACGCTCAAGTTCCTGAAT－3＇；
下游引物（R）：5＇－GCGATGTACGCTAACGAGAT－3＇；
引物对Br-SSR（10），其脱氧核糖核苷酸引物序列为：
上游引物（F）：5＇－TTGGTTTCACTGATGTTTCT－3＇；
下游引物（R）：5＇－CCATATTTGGTTGATTGTTC－3＇；
引物对Br-SSR（11），其脱氧核糖核苷酸引物序列为：
上游引物（F）：5＇－AGCTCCTGTATGGAACTCAA－3＇；
下游引物（R）：5＇－TTCCTTTCTTCTGACAAATC－3＇；
引物对Br-SSR（12），其脱氧核糖核苷酸引物序列为：
上游引物（F）：5＇－AATCAACGAAAACGAGGAAT－3＇；
下游引物（R）：5＇－GCTCAGATAGAGAAAGGGGG－3＇；
引物对Br-SSR（13），其脱氧核糖核苷酸引物序列为：
上游引物（F）：5＇－TGTAACTTAAAGAAAACCAAAA－3＇；
下游引物（R）：5＇－CATCACATACTAATCAACCAGA－3＇；
其中所述引物对Br-SSR（14）的脱氧核糖核苷酸引物序列为：
上游引物（F）：5＇－GTAATGGAGAGTGATGATGA－3＇；
下游引物（R）：5＇－TTTGGAACTAAATTGTTTGT－3＇；
引物对Br-SSR（15），其脱氧核糖核苷酸引物序列为：
上游引物（F）：5＇－ATTTGGATCGTTGATTGAAT－3＇；
下游引物（R）：5＇－ACTTTTTGCTTGTTTGTTTT－3＇。
2.权利要求1所述的与大白菜橙色叶球基因Br-or紧密连锁的SSR及InDel分子标记引物用于大白菜橙色球叶基因克隆及大白菜橙色叶球性状辅助育种中的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的大白菜橙色球叶基因克隆的方法是：
PCR扩增大白菜基因组DNA的多态性片段大小为150bp、208bp、182bp、122bp、189bp、203bp、193bp、114bp、261bp、168bp、123bp、200bp、175bp、234bp、212bp，分别为与大白菜橙色叶球基因Br-or连锁的分子标记引物Br-SSR（1－15）的PCR扩增产物；扩增大白菜基因组DNA的多态性片段大小为280bp、152bp、120bp,即为与大白菜橙色叶球基因Br-or连锁的分子标记Br-InDel（1－3）的PCR扩增产物；其中，Br-SSR（8－15）及Br-InDel（1－3）11个标记位于Br-or的一侧，与Br-or的遗传距离分别为0.38cM、0.38cM、0.44cM、0.43cM、1.43cM、1.98cM、2.33cM、2.96cM、0.11cM、0.38cM、1.05cM；而Br-SSR（1－7）7个标记位于Br-or的另一侧，与Br-or的遗传距离分别为5.01cM、3.11cM、2.57cM、1.17cM、1.17cM、0.79cM、0.79cM，离Br-or最近的两侧标记分别为Br-InDel（1）和Br-SSR（6）。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的PCR扩增包括：
20μl PCR反应体系为：模板DNA50ng，Taq酶1U，10μmol的上、下游引物各0.8μl，0.32μlof10mM dNTPs，2.0μlof10×PCR buffer,1.2μlof25mMMgCl2，用无菌蒸馏水补充反应体系至20μl；
PCR反应程序为：先94℃，变性5min；然后94℃，变性30s，56℃，复性1min，72℃，延伸1min，共30个循环；最后72℃延伸10min，4℃保存。
5.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的PCR扩增产物的检测方法是，将PCR扩增产物在6%的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，然后银染显色。
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