CN106318936B

CN106318936B - 小麦稳定粒重主效qtl的分子标记及其应用

Info

Publication number: CN106318936B
Application number: CN201510336665.4A
Authority: CN
Inventors: 孙其信; 倪中福; 程雪姣; 柴岭岭; 彭惠茹; 姚颖垠; 胡兆荣; 辛明明; 李会敏
Original assignee: China Agricultural University
Current assignee: China Agricultural University
Priority date: 2015-06-17
Filing date: 2015-06-17
Publication date: 2018-12-21
Anticipated expiration: 2035-06-17
Also published as: CN106318936A

Abstract

本发明公开了小麦稳定粒重主效QTL的分子标记及其应用。本发明在小麦5DL染色体上定位到一个环境稳定且与小麦耐热性相关的粒重主效QTL，名称为QTgw.cau‑5D，并开发获得其紧密连锁的SSR标记Xcau1087，可解释的表型变异为3.18％‑13.55％，其加性效应为‑2.87g至‑0.59g，增效位点来自父本辐4185。另外，利用该紧密连锁的SSR标记Xcau1087可快速有效地筛选出具有辐4185基因型的高千粒重小麦，从而应用于小麦的分子标记辅助育种，为小麦粒重性状的改良及高产育种提供有的技术支持，加速小麦高产育种的进程。本发明SSR标记Xcau1087在小麦粒重性状的分子标记辅助育种及粒重性状改良中具有重要应用。

Description

小麦稳定粒重主效QTL的分子标记及其应用

技术领域

本发明涉及作物选种培育技术领域中小麦稳定粒重主效QTL的分子标记及其应用。

背景技术

小麦是我国第三大粮食作物，在农业生产上具有重要地位。据测算，我国要保障2020年14.5亿人口的粮食安全，小麦产量需在现有基础上增加28％(何中虎等，2011)。因此，超高产品种的选育仍是小麦育种最基本、最重要的目标。

小麦产量由亩穗数、穗粒数和平均粒重组成，过去的育种实践表明，粒重的遗传改良是提高小麦产量潜力的有效途径之一。李月华等(1993)对我国上个世纪80年代以前的1400多个小麦育成品种的千粒重进行了分析，结果表明小麦千粒重从50年代以前的31g增加到了80年代的42g，平均增加了33.8％，其中小麦千粒重在45g以上的品种占到了总数的42％。赵倩等(2013)运用相关和通径分析方法，对2006年-2012年山东省审定的38个高产小麦品种的产量及其构成三因素进行的统计分析显示，产量构成因素中以千粒重与产量的相关系数最大且呈显著正相关。高产小麦品种的单位面积穗数相对较高，千粒重是产量的主要制约因素，因此针对目前的单产水平，应主要通过增加千粒重获得小麦的高产。

在产量构成因素中，千粒重的直接贡献最大且它的增加是相对独立的，主要受加性效应的控制，其广义遗传力高达59％-80％(庄巧生，2003)，比较适合进行遗传分析和研究，也是目前的研究热点。在粒重QTL(quantitative trait locus，数量性状位点)定位上，前人已进行了大量的研究。Giura and Saulescu(1996)利用单体在4A、6D染色体上发现存在增加粒重的位点，5B、5D染色体上存在降低粒重的位点。Campbell等(1999)利用软麦和硬麦杂交构建的重组自交系，在4个环境下检测到5个控制千粒重的QTL，分别位于1A、1B、3B、3DL和7A染色体上，每个QTL所解释的表型变异为5.8％-12.2％。Varshney等(2000)利用高粒重材料Rye Selection111和低粒重的中国春杂交衍生的100个重组自交系，在1A、1D、2B、4B、5B、6B、7A和7D共8条染色体上均检测到控制粒重的QTL，其中1A、2B和7A染色体上的QTL能显著提高粒重。Groos等(2003)研究了以Rena和Récital为亲本构建的群体，在6个环境下共检测到9个控制粒重的QTL，其中位于2B、5B和7A染色体上的3个QTL在6个环境中稳定存在且2B染色体上的QTL效应最强，可解释20％的表型变异。Kumar等(2006)同样利用高粒重材料Rye Selection111和低粒重中国春为亲本构建重组自交系群体，在6个环境下检测控制粒重的QTL，在1AS、2BS和7AS染色体上检测到多环境下稳定存在且显著提高粒重的QTL，每个QTL所解释的表型变异为9.06％-19.85％；其中，7AS染色体上的QTL同时控制抽穗期，说明该QTL是具有多效性的正向位点。张坤普等(2009)以小麦品种花培3号和豫麦57杂交获得的DH群体，将控制千粒重的3个加性QTL定位于3B、4B和6A染色体上，它们可分别解释的表型变异为3.36％、4.39％和14.64％；其中，位于6A染色体上的QTgw-6Ab对千粒重的遗传贡献率最大且在3个环境中稳定表达，可用于分子标记辅助选择。Maria等(2014)利用构建的小麦高密度SNP遗传连锁图谱，在3B、4B染色体上也检测到千粒重QTL。

目前，粒重QTL的定位涉及几乎小麦全部的21条染色体。许多研究发现，部分控制粒宽、粒长和粒重的QTL重叠在一起(Ramya et al.,2010；Sun et al.,2009；王瑞霞等，2009)。对于以上产量相关性状QTL集中的染色体部分，研究推测其可能是因为单个基因控制多个性状抑或是与不同性状相关的多个基因连锁在一起，也可能受复杂的遗传性状影响所引起，但这些推测仍需要深入的研究去证实。另外，通过对以上多个产量相关性状QTL重叠的染色体区域的进一步研究，特别是在多个环境都被检测到的QTL，还可以帮助人们更有效地利用分子标记，通过标记辅助育种途径，将控制多个重要性状的基因聚合起来，从而获得高产品种。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供与小麦粒重相关的引物对、小麦粒重相关的数量性状位点及它们在辅助选育高粒重小麦中的应用。

为解决上述技术问题，本发明首先提供了鉴定或辅助鉴定小麦粒重性状的引物对Xcau1087。

本发明所提供的鉴定或辅助鉴定小麦粒重性状的引物对Xcau1087，由SEQ IDNo.1和SEQ ID No.2所示的两条单链DNA组成。

为解决上述技术问题，本发明还提供了制备所述鉴定或辅助鉴定小麦粒重性状的引物对Xcau1087的方法。

本发明所提供的制备所述鉴定或辅助鉴定小麦粒重性状的引物对Xcau1087的方法，包括将所述的两条单链DNA分别单独包装的步骤。

为解决上述技术问题，本发明还提供了鉴定或辅助鉴定小麦粒重性状的产品。

本发明所提供的鉴定或辅助鉴定小麦粒重性状的产品，含有所述鉴定或辅助鉴定小麦粒重性状的引物对Xcau1087。

上述产品可为试剂或试剂盒，还可为由试剂或试剂盒与仪器组成的系统，如由上述鉴定或辅助鉴定小麦粒重性状的引物对Xcau1087和下述至少一种试剂和/或仪器组成的系统：进行PCR扩增所需的其它试剂、进行凝胶电泳所需的试剂、PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统和照相机。

为解决上述技术问题，本发明还提供了鉴定或辅助鉴定小麦粒重性状的方法。

本发明所提供的鉴定或辅助鉴定小麦粒重性状的方法，包括如下步骤：

1)分别以待测小麦、小麦A和小麦B的基因组DNA为模板，用所述引物对Xcau1087分别进行PCR扩增，得到所述待测小麦PCR产物、所述小麦A PCR产物和所述小麦B PCR产物；所述待测小麦是所述小麦A与所述小麦B进行杂交得到的杂交后代；所述小麦B的粒重高于所述小麦A的粒重；

2)将所述待测小麦PCR产物、所述小麦A PCR产物和所述小麦B PCR产物进行电泳，根据电泳结果确定所述待测小麦的粒重性状：如果电泳结果显示为所述待测小麦PCR产物含有与所述小麦B PCR产物大小相同的条带，所述待测小麦为高粒重小麦或候选为高粒重小麦；如果电泳结果显示为所述待测小麦PCR产物不含有与所述小麦B PCR产物大小相同的条带，所述待测小麦为非高粒重小麦或候选为非高粒重小麦。

2)将所述待测小麦PCR产物、所述小麦A PCR产物和所述小麦B PCR产物进行电泳，根据电泳结果确定所述待测小麦的粒重性状：电泳结果显示为PCR产物含有与所述小麦BPCR产物大小相同条带的待测小麦的粒重高于或候选高于PCR产物不含有与所述小麦B PCR产物大小相同条带的待测小麦的粒重。

上文中，所述小麦A具体可为小麦石4185，所述小麦B具体可为小麦辐4185。

上文中，所述待测小麦具体可为以所述小麦A为母本，以所述小麦B为父本进行杂交得到的杂交后代，具体可为以小麦石4185为母本，以小麦辐4185为父本进行杂交得到的F₂代或其衍生的后代，如F₂代分离群体或F_2:3家系。

上文中，所述PCR扩增采用的引物退火条件为58℃退火30s。

上文中，所述PCR扩增中，用所述引物对Xcau1087进行PCR扩增采用的PCR反应温度程序如下：94℃预变性5min，然后进行如下36个循环：94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s；最后72℃延伸10min，12℃保存。

上文中，所述电泳具体可为聚丙烯酰胺凝胶电泳，所述聚丙烯酰胺凝胶电泳中，所述聚丙烯酰胺凝胶的浓度为8％(质量百分含量)。

所述鉴定或辅助鉴定小麦粒重性状的引物对Xcau1087中或所述鉴定或辅助鉴定小麦粒重性状的产品中，所述小麦可为上述小麦A、上述小麦B，或上述小麦A与上述小麦B进行杂交得到的杂交后代；所述小麦A具体可为小麦石4185，所述小麦B具体可为小麦辐4185；所述小麦A与所述小麦B进行杂交得到的杂交后代可为以所述小麦A为母本，以所述小麦B为父本进行杂交得到的杂交后代，具体可为以小麦石4185为母本，以小麦辐4185为父本进行杂交得到的F₂代或其衍生的后代，如F₂代分离群体或F_2:3家系。

为解决上述技术问题，本发明还提供了下述1)-4)中任一种的应用：

1)所述鉴定或辅助鉴定小麦粒重性状的引物对Xcau1087在鉴定或辅助鉴定小麦粒重性状中的应用；

2)所述鉴定或辅助鉴定小麦粒重性状的引物对Xcau1087在小麦育种中的应用；

3)所述鉴定或辅助鉴定小麦粒重性状的引物对Xcau1087在获取小麦粒重相关的DNA分子中的应用；

4)所述鉴定或辅助鉴定小麦粒重性状的引物对Xcau1087在获取小麦粒重相关分子标记中的应用。

1)所述鉴定或辅助鉴定小麦粒重性状的产品在鉴定或辅助鉴定小麦粒重性状中的应用；

2)所述鉴定或辅助鉴定小麦粒重性状的产品在小麦育种中的应用；

3)所述鉴定或辅助鉴定小麦粒重性状的产品在获取小麦粒重相关的DNA分子中的应用；

4)所述鉴定或辅助鉴定小麦粒重性状的产品在获取小麦粒重相关分子标记中的应用。

本发明所提供的所述鉴定或辅助鉴定小麦粒重性状的方法在小麦育种中的应用也属于本发明保护的范围。

上文中，所述粒重具体可为千粒重。

实验证明，本发明在小麦5DL染色体上定位到一个环境稳定且与小麦耐热性相关的粒重主效QTL，名称为QTgw.cau-5D，并开发获得其紧密连锁的SSR标记Xcau1087，可解释的表型变异为3.18％-13.55％，其加性效应为-2.87g至-0.59g，增效位点来自父本辐4185。另外，利用该紧密连锁的SSR标记Xcau1087可快速有效地筛选出具有辐4185基因型的高千粒重小麦，从而应用于小麦的分子标记辅助育种，为小麦粒重性状的改良及高产育种提供有力的技术支持，加速小麦高产育种的进程。本发明SSR标记Xcau1087在小麦粒重性状的分子标记辅助育种及粒重性状改良中具有重要应用。

附图说明

图1为利用引物对Xbarc239经克隆、测序后获得的石4185和辐4185的部分序列及其与小麦5AL、5BL和5DL染色体的序列比对结果。

图2为利用小麦缺体四体系将Xbarc239定位在5DL染色体上。

图3为初定位的粒重主效QTgw.cau-5D附近的遗传连锁图谱及其与水稻、短柄草的共线性比对结果。其中，左侧数字表示各SSR标记在5DL染色体上的相对位置(单位为cM)；右侧为各分子标记的名称。

图4为利用SSR标记Xcau1087对北京春播的石4185×辐4185的F₂群体中部分单株的基因型检测结果。其中，带型与母本石4185相同的记为A，与父本辐4185相同的记为B，杂合带型记为H。

图5为2014年北京春播的石4185×辐4185的F₂群体千粒重分布图。

图6为2014年山西春播的石4185×辐4185的F₂群体千粒重分布图。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的辐4185为河北省石家庄市农业科学研究所的产品。

实施例1：小麦粒重主效QTgw.cau-5D的定位

一、石4185与辐4185间的差异分析

1、材料与种植

石4185为节水高产型冬小麦品种；辐4185为石4185经伽玛射线辐射后自交8代获得的一个纯合诱变系。石4185和辐4185的种植环境见表1，每个种植环境均设3个重复，行长1.5m，行距0.3m，株距7.5cm。

表1、小麦粒重主效QTL各定位群体的种植环境

2、千粒重的测定

小麦自然成熟后，石4185和辐4185混合收获并脱粒后考查其千粒重；千粒重的考查均借助于杭州万深检测科技有限公司的SC-G自动种子考种分析及千粒重仪。

石4185和辐4185除千粒重外，在多个产量相关性状如株高、穗长、穗粒数等均无显著差异。石4185和辐4185的千粒重测定结果列于表2，结果表明，与石4185相比，辐4185在北京、河北、山西三个不同环境下的千粒重增加的比例为10.83％-22.44％。

表2、石4185和辐4185的千粒重测定结果

注：*和**分别表示5％和1％的显著水平。

3、石4185与辐4185间多态性差异分析

采用改良的CTAB法(Stewart et al.，1993)分别提取石4185和辐4185幼嫩叶片的基因组DNA并以其为模板，以2019个SSR(simple sequence repeat，简单重复序列)标记引物分别进行PCR扩增；同时，利用Infinium 90K基因芯片中的SNP(Single Nucleotide Polymorphism，单核苷酸多态性)标记，分析石4185和辐4185在全基因组水平上的遗传差异。结果如表3所示，石4185与辐4185间只有5.4％的SSR标记和2.0％的SNP标记存在多态性，远低于普通小麦品种间20％-30％的多态性，这说明辐4185为石4185的辐射诱变系。

表3、石4185与辐4185间多态性标记统计结果

二、小麦粒重主效QTgw.cau-5D的检测

石4185×辐4185的F₂群体及母本石4185和父本辐4185均于2011年10月在北京种植，石4185×辐4185的F_2:3家系及母本石4185和父本辐4185于2012年10月分别在河北、山西种植，石4185×辐4185的F₂群体及母本石4185和父本辐4185于2014年3月和2月分别在北京、山西种植。其中，F_2:3家系的种植采用随机区组设计，每个种植环境均设3个重复，行长1.5m，行距0.3m，株距7.5cm。

1、采用改良的CTAB法(Stewart et al.，1993)分别提取2011年北京种植的石4185×辐4185的F₂群体中各单株及母本石4185和父本辐4185的幼嫩叶片的基因组DNA。分别以母本石4185的基因组DNA、父本辐4185的基因组DNA和石4185×辐4185的F₂群体的部分单株的基因组DNA为模板，以表3中在母本石4185和父本辐4185间具有多态性的110对SSR标记为引物，进行PCR扩增，经8％聚丙烯酰胺凝胶电泳后，筛选统计出能够明显区分石4185×辐4185的F₂群体中的三种基因型的多态性SSR标记，共58对。

2、分别以石4185×辐4185的F₂群体中各单株的基因组DNA、母本石4185的基因组DNA和父本辐4185的基因组DNA为模板，利用步骤1得到的58对SSR标记为引物，进行PCR扩增，经8％聚丙烯酰胺凝胶电泳后，鉴定统计石4185×辐4185的F₂群体中各单株的基因型。

3、待小麦材料自然成熟后，按照千粒重的测定方法，借助于千粒重仪分别考察并统计石4185×辐4185的F₂群体及F_2:3家系的千粒重表型。F₂群体单株收获并脱粒后考查其千粒重；对于F_2:3家系，从每个株系中选取中间10株混合脱粒后考查其千粒重。千粒重的考查均借助于杭州万深检测科技有限公司的SC-G自动种子考种分析及千粒重仪。表4为不同环境下石4185×辐4185的F₂群体及F_2:3家系的千粒重数据的统计结果，在石4185×辐4185的F₂群体及F_2:3家系中，其千粒重性状表现出一定的分离，其变异率分别为9.77％-11.82％和3.91％-4.72％。与表2中相应环境下的两个亲本的千粒重相比发现，千粒重在石4185×辐4185的F₂群体及F_2:3家系中表现出一定的超亲分离，表明控制千粒重的QTL基因主要分布在高千粒重父本辐4185中。另外，在各群体中，千粒重均呈正态分布，表明了千粒重性状的数量遗传特征。

表4、不同环境下石4185×辐4185的F₂群体及F_2:3家系的千粒重统计结果

4、根据步骤2得到的石4185×辐4185的F₂群体中各单株的基因型，结合步骤3中2011年北京种植的石4185×辐4185的F₂群体及2012年河北、山西种植的F_2:3家系的千粒重的考查数据，通过单标记方差分析法，对千粒重进行单标记分析。其结果如表5所示，利用单标记方差分析法在2011年北京石4185×辐4185的F₂群体及2012年河北、山西F_2:3家系共两个世代三个环境下均检测到粒重QTL，且与已公布的SSR标记Xbarc239紧密连锁，达到0.01％的极显著水平。

表5、利用单标记法对千粒重的分析结果

注：***和****分别表示0.1％和0.01％的显著水平。

5、分别以石4185的基因组DNA和辐4185的基因组DNA为模板，以引物对Xbarc239(http://wheat.pw.usda.gov/GG2/index.shtmL)为引物，进行PCR扩增并经克隆、测序后，借助国际小麦基因组测序协会的BLAST工具(https://urgi.versailles.inra.fr/blast/ blast.php)，将获得的石4185和辐4185的序列信息与小麦全基因组序列信息进行比对分析。结果见图1，经克隆测序后将SSR标记Xbarc239定位到小麦5DL染色体上，其具体位置为chr5DL_ab_k71_contigs_4520158，同源性达98.6％，这与图2中Yang等(2005)利用小麦缺体四体系将Xbarc239定位在5DL染色体上的结果是一致的。因此，将该粒重主效QTL命名为QTgw.cau-5D。

实施例2：小麦粒重主效QTL紧密连锁标记Xcau1087的获得

具体方法如下：

1、下载国际小麦基因组测序协会(http://www.wheatgenome.org/)发布的5DL染色体上的所有contig序列，利用BatchPrimer3v1.0(http://probes.pw.usda.gov/batchprimer3/)搜索两个碱基重复次数大于30，三个碱基重复大于21次所在的序列并设计引物，经亲本间PCR扩增和8％的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测及小群体验证，最终开发出5DL染色体上多态性明显且带型清晰的多对SSR标记。

2、根据国际小麦基因组测序协会(http://www.wheatgenome.org/)发布的genomezipper及PNAS发表的文章“A 4-gigabase physical map unlocks the structure andevolution of the complex genome of Aegilops tauschi i,the wheat D-genomeprogenitor”里的genome zipper，进行千粒重主效QTL附近小麦与粗山羊草、水稻和短柄草的染色体共线性关系比对。根据同源性关系比对结果，利用该区间内所包含的粗山羊草探针延伸序列、水稻基因序列和短柄草基因序列，从小麦基因组测序协会数据库中提取获得小麦粒重主效QTL附近的基因组序列。在此基础上，利用步骤1中同样的方法，借助BatchPrimer3v1.0进行粒重主效QTL附近特异SSR标记的开发。

3、以实施例1中步骤二的2011年北京种植的石4185×辐4185的F₂群体中各单株的基因组DNA、母本石4185的基因组DNA及父本辐4185的基因组DNA为模板，以步骤1和步骤2中得到的SSR标记为引物，进行PCR扩增，经8％聚丙烯酰胺凝胶电泳后，鉴定统计出石4185×辐4185的F₂群体中各单株的基因型。其中，带型与母本石4185相同的记为A，与父本辐4185相同的记为B，杂合带型记为H，缺失记为“-”，应用JoinMap 4.0软件进行粒重主效QTL，名称为QTgw.cau-5D区间的遗传连锁图谱构建，所得结果见图3。结果表明，共有5对新开发的SSR标记Xcau1022、Xcau1053、Xcau1087、Xcau1118和Xcau1132被加密到Xbarc239附近，且Xcau1087距离Xbarc239最近。

4、根据步骤3得到的石4185×辐4185的F₂群体中各单株的基因型，结合实施例1中步骤二的2011年北京种植的石4185×辐4185的F₂群体及实施例1中步骤二的2012年河北、山西种植的F_2:3家系的千粒重的考查数据，参照Ajay Kumar(2013)的方法，使用QTLCartographer V2.5软件(Wang S.2012)，通过复合区间作图法(Composite IntervalMapping，CIM)对小麦粒重主效QTL进行定位，其结果如表6所示。由表6可知，通过复合区间作图法(CIM)在实施例1中步骤二的2011年北京石4185×辐4185的F₂群体及实施例1中步骤二的2012年河北、山西F_2:3家系共两个世代三个环境下均能在SSR标记Xcau1087附近检测到控制粒重的主效QTL，其加性效应分别为-2.87g、-0.59g和-0.81g，可解释的表型变异为3.18％-13.55％，且其增效位点均来源于父本辐4185。

表6、利用石4185×辐4185的F₂群体及F_2:3群体检测到的粒重QTL

注：标记区间是QTL所在位置(峰值)两侧的标记所在的区间；位置是指QTL所在位置(峰值)距离标记区间的第一个标记的距离；加性效应中，正值表明增效基因来源于母本石4185，负值表明增效基因来源于父本辐4185。

实施例3：紧密连锁标记Xcau1087在小麦粒重选择上的应用

2014年2月、3月，分别在北京、山西两点通过春播的方式种植母本石4185、父本辐4185和石4185×辐4185的F₂群体。苗期对母本石4185、父本辐4185和石4185×辐4185的F₂群体单株挂牌取样，分别提取两个春播环境下母本石4185(小麦A)、父本辐4185(小麦B)和石4185×辐4185的F₂群体中各单株(待测小麦)的基因组DNA并以其为模板，利用SSR标记Xcau1087为引物，进行PCR扩增，得到母本石4185PCR产物、父本辐4185PCR产物和待测小麦PCR产物；进行8％(质量百分含量)的聚丙烯酰胺凝胶电泳，根据电泳结果确定所述待测小麦的粒重性状：如果电泳结果显示为待测小麦PCR产物含有与父本辐4185PCR产物大小相同的条带，待测小麦为高粒重小麦或候选为高粒重小麦；如果待测小麦PCR产物的电泳中显示为不含有与父本辐4185PCR产物大小相同的条带，待测小麦为非高粒重小麦或候选为非高粒重小麦。

电泳结果中，将母本石4185PCR产物的电泳带型的记为A，父本辐4185PCR产物的电泳带型的记为B，待测小麦PCR产物的电泳带型与母本石4185相同的记为A，与父本辐4185相同的记为B，杂合带型(由母本石4185PCR产物的电泳带型和父本辐4185PCR产物的电泳带型组成)记为H，缺失记为“-”。检测并统计两个春播环境下石4185×辐4185的F₂群体中各单株的基因型(PCR产物的电泳带型)，Xcau1087的正向引物序列如SEQ ID No.1所示，Xcau1087的反向引物序列如SEQ ID No.2所示。

PCR反应体系(10μL体系)如下：

PCR反应程序(10μL体系)如下：

电泳：在扩增的PCR产物中加入2.0μL的6×Loading Buffer(100mL中含有浓度为0.5M，pH8.0的EDTA溶液2mL，去离子甲酰胺98mL，溴酚兰0.05g，二甲苯氰0.05g)，离心后，每孔分别点样4μL,其中一孔点4μL的100bp DNA Ladder。常温下，在GT核酸电泳系统(Bio-Rad,USA)中200V预电泳2min，然后在120V恒压下电泳5h左右；

银染：

1)染色：将胶板卸下，剥胶放入0.1％(质量百分比)染色液(将0.50g的AgNO₃加入到500mL去离子水中，混匀)中，然后在摇床上轻轻摇动，染色15min；

2)显色：待染色15min后，小心倒掉染色液并用去离子水快速漂洗30s，每盆加入显色液(NaOH 10.00g，无水Na₂CO₃0.20g-0.30g，去离子水500mL，甲醛750μL)500mL，继续放在摇床上，轻轻摇动10min左右；

3)拍照：待凝胶变成浅黄色，DNA条带完全显现时，倒掉显色液，用清水冲洗，并用照相机记录每板胶的条带情况，以便读取带型。

图4为利用SSR标记Xcau1087对北京石4185×辐4185的F₂群体中部分单株的基因型检测结果。同时，待小麦成熟后，考查并统计北京、山西两点石4185×辐4185的F₂群体中各单株的千粒重数据。

首先，结合2014年两个春播环境下的石4185×辐4185的F₂群体的基因型及千粒重数据，同样参照利用QTL Cartographer V2.5软件，通过复合区间作图法对小麦粒重主效QTL进行定位(表7)，发现再次在SSR标记Xcau1087附近检测到控制粒重的主效QTL，其加性效应分别为-1.70g、-1.54g，平均可解释12.23％的表型变异，且其增效位点也均来源于父本辐4185。

表7、利用2014年春播的石4185×辐4185的F₂群体检测到的粒重QTL

最后，对两个春播环境下母本石4185、父本辐4185和石4185×辐4185的F₂群体中各单株的基因型及千粒重数据进行统计分析(表8)发现，利用SSR标记Xcau1087，在北京春播环境下的石4185×辐4185的F₂群体(231株)中共筛选出163株含有父本辐4185的带型(B和H)，其中千粒重超过该F₂群体的平均千粒重(37.56g)的有100株，占61.35％(图5)；千粒重超过表2中母本石4185的平均千粒重(33.76g)的共有147株，占90.18％。在山西春播环境下的石4185×辐4185的F₂群体，由于自然灾害对结实率的影响，仅考查获得131个单株的千粒重，其中有100株含有父本辐4185的带型(B和H)，千粒重超过该F₂群体平均千粒重(34.64g)的有58株，占58.00％(图6)；千粒重超过表2中相应环境下母本石4185的平均千粒重(29.90g)的共有94株，占94.00％。由此可以看出，利用新开发的SSR标记Xcau1087，可以在苗期有效筛选出高千粒重的小麦，节约实验成本，提高选择效率，从而快速筛选出高千粒重的株系，用于小麦的高产育种。

表8、北京、山西两点石4185×辐4185的F₂群体的千粒重统计结果

另外，小麦为喜凉作物，籽粒灌浆期时若遇到高温环境则易导致产量减少和品质降低(Asseng et al.,2011；Kumar and Rai,2014)。随着全球气候变暖，耐热小麦品种的选育对于实现小麦高产稳产具有重要的理论和实践意义。以上春播环境将小麦的成熟期推迟(表9)，实现了石4185×辐4185的F₂群体在灌浆期的高温处理，说明该粒重主效QTL还可能与小麦的耐热性相关。

表9、不同播种方式下小麦成熟期的比较结果

综合以上结果，本发明在小麦5DL染色体上定位到一个环境稳定且与小麦耐热性相关的粒重主效QTL，名称为QTgw.cau-5D，并开发获得其紧密连锁的SSR标记Xcau1087，可解释的表型变异为3.18％-13.55％，其加性效应为-2.87g至-0.59g，增效位点来自父本辐4185。另外，利用该紧密连锁的SSR标记Xcau1087可快速有效地筛选出具有辐4185基因型的高千粒重小麦，从而应用于小麦的分子标记辅助育种，为小麦粒重性状的改良及高产育种提供有力的技术支持，加速小麦高产育种的进程。

Claims

1.鉴定或辅助鉴定小麦粒重性状的引物对Xcau1087，由SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的两条单链DNA组成。

2.制备权利要求1所述的引物对Xcau1087的方法，包括将权利要求1所述的两条单链DNA分别单独包装的步骤。

3.鉴定或辅助鉴定小麦粒重性状的产品，其特征在于：所述产品含有权利要求1所述的引物对Xcau1087。

4.鉴定或辅助鉴定小麦粒重性状的方法，包括如下步骤：

1)分别以待测小麦、小麦A和小麦B的基因组DNA为模板，用权利要求1所述的引物对Xcau1087分别进行PCR扩增，得到所述待测小麦PCR产物、所述小麦A PCR产物和所述小麦BPCR产物；所述待测小麦是所述小麦A与所述小麦B进行杂交得到的杂交后代；所述小麦B的粒重高于所述小麦A的粒重；

2)将所述待测小麦PCR产物、所述小麦APCR产物和所述小麦B PCR产物进行电泳，根据电泳结果确定所述待测小麦的粒重性状：如果电泳结果显示为所述待测小麦PCR产物含有与所述小麦B PCR产物大小相同的条带，所述待测小麦为高粒重小麦或候选为高粒重小麦；如果电泳结果显示为所述待测小麦PCR产物不含有与所述小麦B PCR产物大小相同的条带，所述待测小麦为非高粒重小麦或候选为非高粒重小麦；

所述小麦A为小麦石4185，所述小麦B为小麦辐4185。

5.鉴定或辅助鉴定小麦粒重性状的方法，包括如下步骤：

2)将所述待测小麦PCR产物、所述小麦A PCR产物和所述小麦B PCR产物进行电泳，根据电泳结果确定所述待测小麦的粒重性状：电泳结果显示为PCR产物含有与所述小麦BPCR产物大小相同条带的待测小麦的粒重高于或候选高于PCR产物不含有与所述小麦B PCR产物大小相同条带的待测小麦的粒重；

所述小麦A为小麦石4185，所述小麦B为小麦辐4185。

6.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于：所述PCR扩增采用的引物退火条件为58℃退火30s。

7.根据权利要求1所述的引物对Xcau1087或权利要求3所述的产品，其特征在于：所述小麦为小麦石4185、小麦辐4185或小麦石4185与小麦辐4185进行杂交得到的杂交后代。

8.下述1)或2)中的应用：

1)权利要求1所述的引物对Xcau1087在鉴定或辅助鉴定小麦粒重性状中的应用；

2)权利要求1所述的引物对Xcau1087在获取小麦粒重相关分子标记中的应用。

9.下述1)或2)中的应用：

1)权利要求3所述的产品在鉴定或辅助鉴定小麦粒重性状中的应用；

2)权利要求3所述的产品在获取小麦粒重相关分子标记中的应用。

10.权利要求4-6中任一所述方法在小麦粒重性状改良及高产育种中的应用。