CN117512191B - 一种鉴别芦笋品种的ssr分子标记组合及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种鉴别芦笋品种的SSR分子标记组合及其应用，涉及植物品种鉴别领域。该SSR分子标记组合包括SSR分子标记AoSSR01、AoSSR02、AoSSR03、AoSSR04、AoSSR05、AoSSR06、AoSSR07、AoSSR08、AoSSR09和AoSSR10。本发明公开了用于鉴别芦笋的分子标记组合，仅利用10对芦笋引物对即能扩增出上述的分子标记组合，进而能够将芦笋品种进行有效鉴别。本发明公开的分子标记组合在进一步鉴别大量芦笋种质资源方面具有很大潜力，与现有常规形态鉴定相比，具有效果更佳，且节约时间和成本等优点，本发明可为芦笋品种DNA分子基因型鉴定提供有力的技术支持。
Description
技术领域
本发明涉及植物品种鉴别领域，特别是涉及一种鉴别芦笋品种的SSR分子标记组合及其应用。
背景技术
芦笋(Asparagus officinalis)，又名石刁柏，为天门冬科天门冬属(芦笋属)多年生草本植物，嫩苗可供蔬食，具有一减二抗三降等多种保健功能，号称“蔬菜之王”，是深受消费者喜爱的营养保健型高档蔬菜。我国的芦笋种质资源丰富，截至2008年，国家种质库保存量近1000份，由于不同地区之间品种交流频繁，从而导致了其种类和品种繁多，来源较为复杂，存在大量“同名异种”和“一品多名”种质。芦笋品种混乱，真假难辨，许多生产者不能区分出当地种植的品种，芦笋品质无法得到保障，从而造成严重损失。多年来，品种鉴定是以形态学标记为依据的。这种方法虽然简单经济，但周期长，花费大，受季节限制，而且很多性状的表现受栽培措施及环境因子影响，从而制约了鉴定的准确性。DNA分子标记技术则具有高效、准确、不受环境条件影响、实验操作简单等优点，已广泛应用于植物品种真实性鉴定及纯度检测研究。SSR标记是近年来发展起来的建立在PCR基础上的第二代分子标记。由于SSR分子标记具有数量丰富、多态性高、遗传共显性、谱带扩增稳定、精度高、检测时间短、技术成熟等特点，已广泛应用于作物遗传学研究。本发明拟针对芦笋品种开发SSR分子标记，以实现对芦笋品种的准确鉴别。
发明内容
本发明的目的是提供一种鉴别芦笋品种的SSR分子标记组合及其应用，以解决上述现有技术存在的问题，利用该SSR分子标记组合可以构建得到芦笋的DNA特征指纹图谱，从而为芦笋的鉴定和品种权保护提供技术支撑。
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
本发明提供一种用于鉴别芦笋品种的SSR分子标记组合，包括SSR分子标记AoSSR01、AoSSR02、AoSSR03、AoSSR04、AoSSR05、AoSSR06、AoSSR07、AoSSR08、AoSSR09和AoSSR10；
所述AoSSR01通过核苷酸序列如SEQ ID NO.1-2所示的引物对扩增得到；
所述AoSSR02通过核苷酸序列如SEQ ID NO.3-4所示的引物对扩增得到；
所述AoSSR03通过核苷酸序列如SEQ ID NO.5-6所示的引物对扩增得到；
所述AoSSR04通过核苷酸序列如SEQ ID NO.7-8所示的引物对扩增得到；
所述AoSSR05通过核苷酸序列如SEQ ID NO.9-10所示的引物对扩增得到；
所述AoSSR06通过核苷酸序列如SEQ ID NO.11-12所示的引物对扩增得到；
所述AoSSR07通过核苷酸序列如SEQ ID NO.13-14所示的引物对扩增得到；
所述AoSSR08通过核苷酸序列如SEQ ID NO.15-16所示的引物对扩增得到；
所述AoSSR09通过核苷酸序列如SEQ ID NO.17-18所示的引物对扩增得到；
所述AoSSR10通过核苷酸序列如SEQ ID NO.19-20所示的引物对扩增得到。
本发明还提供一种用于鉴别芦笋品种的引物组合，包括核苷酸序列如SEQ IDNO.1-20所示的引物。
本发明还提供一种上述的引物组合在制备鉴别芦笋品种的试剂盒中的应用。
本发明还提供一种鉴别芦笋品种的试剂盒，包括上述的引物组合。
本发明还提供一种上述的SSR分子标记组合、引物组合或试剂盒在构建芦笋DNA特征指纹图谱中的应用。
本发明还提供一种芦笋DNA特征指纹图谱的构建方法，包括以下步骤：
提取得到不同品种芦笋的基因组DNA，利用上述的引物组合对不同品种芦笋的基因组DNA进行PCR扩增，再对扩增产物进行电泳检测，根据标准DNA分子量和引物的迁移率记录电泳结果，每对引物迁移率最大的条带记为1，迁移率次之的记为2，依次类推，无条带记为0，建立SSR基因型信息数据，按照引物顺序进行编码，得到所述芦笋DNA特征指纹图谱。
进一步地，所述芦笋的品种包括资源库号为AO001的WB-234、资源库号为AO002的WB-260、资源库号为AO003的WB-231、资源库号为AO004的WB-230、资源库号为AO005的WB-209、资源库号为AO006的WB-212、资源库号为AO007的华农78-4、资源库号为AO008的华农78-12、资源库号为AO009的翡翠明珠、资源库号为AO010的华农115、资源库号为AO011的浙丰806F1、资源库号为AO012的Hi-4、资源库号为AO013的浙丰315F1、资源库号为AO014的Mileinnium、资源库号为AO015的Hi-2、资源库号为AO016的Welcome、资源库号为AO017的特利龙、资源库号为AO018的JVS-31-003、资源库号为AO019的086、资源库号为AO020的井冈701、资源库号为AO021的京绿芦3号、资源库号为AO022的CXZ、资源库号为AO023的京绿1250、资源库号为AO024的YUAN、资源库号为AO025的C912、资源库号为AO026的冠军、资源库号为AO027的Focus、资源库号为AO028的绿龙、资源库号为AO029的蛟河野生种、资源库号为AO030的井冈红、资源库号为AO031的京绿1248、资源库号为AO032的TC2010、资源库号为AO033的通化野生种、资源库号为AO034的Vittorio、资源库号为AO035的FO 05030115和资源库号为AO036的Jersey Supreme；
所述资源库均为吉林农业科学院经济植物研究所种质资源库。
进一步地，所述PCR扩增的反应体系为：DNA模板0.8μL、l0pmo1/L上游引物0.2μL、10pmo1/L下游引物0.2μL、10×PCRbuffer 2μL、25mmol/LMg2+1.2μL、10mmol/L dNTP 0.5μL、5U/μLTaq酶0.2μL和ddH2O 14.4μL；所述10×PCRbuffer不含Mg2+。
进一步地，所述PCR扩增的反应程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸30s，共30个循环；72℃延伸5min。
本发明还提供一种上述的SSR分子标记组合、引物组合或试剂盒在鉴别芦笋品种中的应用。
本发明公开了以下技术效果：
本发明公开了用于鉴别芦笋的分子标记组合，仅利用10对芦笋引物对即能扩增出上述的分子标记组合，进而能够将芦笋品种进行有效鉴别，鉴别准确率高达100％。本发明公开的分子标记组合在进一步鉴别大量芦笋种质资源方面具有很大潜力，与现有常规形态鉴定相比，具有效果更佳，且节约时间、成本等优点，本发明可为芦笋品种DNA分子基因型鉴定提供有力的技术支持。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为AoSSR-01凝胶电泳图；其中，M为Marker；01-23为1-23号芦笋材料。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值，以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
实施例1芦笋指纹图谱的构建方法
1、实验材料
以36份芦笋品种作为样本材料，根据其开发的SSR分子标记构建芦笋品种的指纹图谱，以达到芦笋品种鉴定的目的。
36个芦笋品种均来自于吉林农业科学院经济植物研究所种质资源库，具体信息如表1所示。
表1 36个芦笋品种的信息
2、不同品种芦笋标准DNA指纹图谱库的构建
2.1各品种芦笋总DNA的提取
将芦笋苗种植于土壤中，室温培养，长出10d天后取芦笋幼叶在液氮冷冻后于-80℃保存备用。取各品种芦笋幼嫩的叶片0.2g于1.5m离心管中，加入液氮研磨成粉末。采用试剂盒法提取DNA，操作实验步骤按照试剂盒说明书进行。用琼脂糖凝胶电泳和分光光度计检测总DNA的质量，然后将总DNA稀释成100ng/μL，储存于-20℃备用。
2.2引物的筛选
a.SSR标记合成：由生物公司合成SSR分子标记的扩增引物，引物合成的纯度要求为PAGE纯化，并分装成10D/管，把上、下游引物的浓度均稀释成10pmol/L。
b.SSR分子标记引物组合的筛选方法
筛选引物：筛选出在不同芦笋品种间具有多态性、带型清晰且能够稳定重复的SSR初筛引物。
通过筛选获得以下引物，其标记、引物名称、位置如表2所示。
表2引物标记名称
c.SSR标记扩增引物组合的筛选
以芦笋品种为材料，利用SSR分子标记的扩增引物(如表3所示)分别对各芦笋品种的DNA进行PCR扩增，PCR反应试验中采用的PCR反应体系为20μL体系：DNA模板0.8μL，上游引物(10pmol/L)0.2μL，下游引物(10pmol/L)0.2μL，10×PCRbuffer(不含Mg2+)2μL，Mg2+(25mmo1/L)1.2μL，dNTP(10mmol/L)0.5μL，Taq酶(5U/μL)0.2μL，ddH2O 14.4μL，总计20.0μL。
PCR反应程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸30s，共30个循环；72℃延伸5min，4℃保存。
d.凝胶电泳及Gel-red显色
扩增产物采用10％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，电泳在Sequi-Gen GT核酸电泳系统(Bio-Rad，USA)中进行。
显色：利用Gelred固定30min，放入凝胶成像(Bio-red)中照相记录，根据标准DNA分子量和引物的迁移率记录电泳结果，每对引物迁移率最大的条带记为1，迁移率次之的记为2，依次类推，无条带记为0，建立SSR基因型信息数据，按照引物顺序进行编码，得到的指纹代码即为该品种的特征指纹图谱；记录方式如图1所示。
2.3芦笋DNA特征指纹图谱的构建
对36份芦笋材料构建的DNA特征指纹图谱见表3，由表3可以看出，任意两个品种的DNA分子标记指纹图谱都不相同，可判断出36份供试芦笋品种是不同的品种，且所对应的DNA分子指纹代码是该品种所特有的指纹。
结果表明，10对引物组合可用于植物基因型的鉴定之中，从而能够应用于鉴定芦笋品种的遗传特征，保护这些品种权免受侵犯。
表336份芦笋材料分子标记指纹图谱
综上所述，本发明利用上述技术体系和筛选出的10对芦笋SSR多态性引物，构建了36个芦笋材料的DNA特征指纹图谱，可把36个芦笋品种区分开，从而为芦笋的鉴定和品种权保护提供了技术支撑。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
Claims (9)
1.一种用于鉴别芦笋品种的SSR分子标记组合，其特征在于，包括SSR分子标记AoSSR01、AoSSR02、AoSSR03、AoSSR04、AoSSR05、AoSSR06、AoSSR07、AoSSR08、AoSSR09和AoSSR10；
所述AoSSR01通过核苷酸序列如SEQ ID NO.1-2所示的引物对扩增得到；
所述AoSSR02通过核苷酸序列如SEQ ID NO.3-4所示的引物对扩增得到；
所述AoSSR03通过核苷酸序列如SEQ ID NO.5-6所示的引物对扩增得到；
所述AoSSR04通过核苷酸序列如SEQ ID NO.7-8所示的引物对扩增得到；
所述AoSSR05通过核苷酸序列如SEQ ID NO.9-10所示的引物对扩增得到；
所述AoSSR06通过核苷酸序列如SEQ ID NO.11-12所示的引物对扩增得到；
所述AoSSR07通过核苷酸序列如SEQ ID NO.13-14所示的引物对扩增得到；
所述AoSSR08通过核苷酸序列如SEQ ID NO.15-16所示的引物对扩增得到；
所述AoSSR09通过核苷酸序列如SEQ ID NO.17-18所示的引物对扩增得到；
所述AoSSR10通过核苷酸序列如SEQ ID NO.19-20所示的引物对扩增得到。
2.一种用于鉴别芦笋品种的引物组合，其特征在于，包括核苷酸序列如SEQ ID NO.1-20所示的引物。
3.一种如权利要求2所述的引物组合在制备鉴别芦笋品种的试剂盒中的应用。
4.一种鉴别芦笋品种的试剂盒，其特征在于，包括权利要求2所述的引物组合。
5.一种如权利要求1所述的SSR分子标记组合、权利要求2所述的引物组合或权利要求4所述的试剂盒在构建芦笋DNA特征指纹图谱中的应用，其特征在于，所述芦笋的品种包括资源库号为AO001的WB-234、资源库号为AO002的WB-260、资源库号为AO003的WB-231、资源库号为AO004的WB-230、资源库号为AO005的WB-209、资源库号为AO006的WB-212、资源库号为AO007的华农78-4、资源库号为AO008的华农78-12、资源库号为AO009的翡翠明珠、资源库号为AO010的华农115、资源库号为AO011的浙丰806F1、资源库号为AO012的Hi-4、资源库号为AO013的浙丰315F1、资源库号为AO014的Mileinnium、资源库号为AO015的Hi-2、资源库号为AO016的Welcome、资源库号为AO017的特利龙、资源库号为AO018的JVS-31-003、资源库号为AO019的086、资源库号为AO020的井冈701、资源库号为AO021的京绿芦3号、资源库号为AO022的CXZ、资源库号为AO023的京绿1250、资源库号为AO024的YUAN、资源库号为AO025的C912、资源库号为AO026的冠军、资源库号为AO027的Focus、资源库号为AO028的绿龙、资源库号为AO029的蛟河野生种、资源库号为AO030的井冈红、资源库号为AO031的京绿1248、资源库号为AO032的TC2010、资源库号为AO033的通化野生种、资源库号为AO034的Vittorio、资源库号为AO035的FO 05030115和资源库号为AO036的Jersey Supreme；
所述资源库均为吉林农业科学院经济植物研究所种质资源库。
6.一种芦笋DNA特征指纹图谱的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
提取得到不同品种芦笋的基因组DNA，利用权利要求2所述的引物组合对不同品种芦笋的基因组DNA进行PCR扩增，再对扩增产物进行电泳检测，根据标准DNA分子量和引物的迁移率记录电泳结果，每对引物迁移率最大的条带记为1，迁移率次之的记为2，依次类推，无条带记为0，建立SSR基因型信息数据，按照引物顺序进行编码，得到所述芦笋DNA特征指纹图谱；
所述芦笋的品种包括资源库号为AO001的WB-234、资源库号为AO002的WB-260、资源库号为AO003的WB-231、资源库号为AO004的WB-230、资源库号为AO005的WB-209、资源库号为AO006的WB-212、资源库号为AO007的华农78-4、资源库号为AO008的华农78-12、资源库号为AO009的翡翠明珠、资源库号为AO010的华农115、资源库号为AO011的浙丰806F1、资源库号为AO012的Hi-4、资源库号为AO013的浙丰315F1、资源库号为AO014的Mileinnium、资源库号为AO015的Hi-2、资源库号为AO016的Welcome、资源库号为AO017的特利龙、资源库号为AO018的JVS-31-003、资源库号为AO019的086、资源库号为AO020的井冈701、资源库号为AO021的京绿芦3号、资源库号为AO022的CXZ、资源库号为AO023的京绿1250、资源库号为AO024的YUAN、资源库号为AO025的C912、资源库号为AO026的冠军、资源库号为AO027的Focus、资源库号为AO028的绿龙、资源库号为AO029的蛟河野生种、资源库号为AO030的井冈红、资源库号为AO031的京绿1248、资源库号为AO032的TC2010、资源库号为AO033的通化野生种、资源库号为AO034的Vittorio、资源库号为AO035的FO 05030115和资源库号为AO036的Jersey Supreme；
所述资源库均为吉林农业科学院经济植物研究所种质资源库。
7.根据权利要求6所述的构建方法，其特征在于，所述PCR扩增的反应体系为：DNA模板0.8μL、l0pmo1/L上游引物0.2μL、10pmo1/L下游引物0.2μL、10×PCRbuffer 2μL、25mmol/LMg2+1.2μL、10mmol/L dNTP 0.5μL、5U/μL Taq酶0.2μL和ddH2O 14.4μL；所述10×PCRbuffer不含Mg2+。
8.根据权利要求6所述的构建方法，其特征在于，所述PCR扩增的反应程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸30s，共30个循环；72℃延伸5min。
9.一种如权利要求1所述的SSR分子标记组合、权利要求2所述的引物组合或权利要求4所述的试剂盒在鉴别芦笋品种中的应用，其特征在于，所述芦笋的品种包括资源库号为AO001的WB-234、资源库号为AO002的WB-260、资源库号为AO003的WB-231、资源库号为AO004的WB-230、资源库号为AO005的WB-209、资源库号为AO006的WB-212、资源库号为AO007的华农78-4、资源库号为AO008的华农78-12、资源库号为AO009的翡翠明珠、资源库号为AO010的华农115、资源库号为AO011的浙丰806F1、资源库号为AO012的Hi-4、资源库号为AO013的浙丰315F1、资源库号为AO014的Mileinnium、资源库号为AO015的Hi-2、资源库号为AO016的Welcome、资源库号为AO017的特利龙、资源库号为AO018的JVS-31-003、资源库号为AO019的086、资源库号为AO020的井冈701、资源库号为AO021的京绿芦3号、资源库号为AO022的CXZ、资源库号为AO023的京绿1250、资源库号为AO024的YUAN、资源库号为AO025的C912、资源库号为AO026的冠军、资源库号为AO027的Focus、资源库号为AO028的绿龙、资源库号为AO029的蛟河野生种、资源库号为AO030的井冈红、资源库号为AO031的京绿1248、资源库号为AO032的TC2010、资源库号为AO033的通化野生种、资源库号为AO034的Vittorio、资源库号为AO035的FO 05030115和资源库号为AO036的Jersey Supreme；
所述资源库均为吉林农业科学院经济植物研究所种质资源库。
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