CN109355422A - 一种鉴定紫苏种质的ssr标记引物及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明是利用SSR分子标记技术对紫苏种质资源亲缘关系进行鉴定，利用SSR核心引物对不同紫苏种质资源DNA进行PCR扩增，使用PAGE胶电泳分离扩增产物，利用统计软件进行聚类分析，进而明确不同种质材料的亲缘关系，本方法操作简单，鉴定快速，费用低，准确度高，可以有效鉴定紫苏种质的亲缘关系，对研究紫苏进化和杂交育种的亲本选配具有重要作用。
Description
技术领域
本发明涉及分子标记领域，具体而言，涉及一种用于检测紫苏SSR分子标记的引物对组、试剂盒、方法及应用。
背景技术
紫苏(Perilla frutescens L.Britt)，又称荏，属唇形科(Labiatae)，一年生草本自花授粉植物，具特异芳香，是我国传统的药食、油料作物，是卫生部第一批规定的既是药品又是食品的60种作物之一，在医药食品领域有着重要的开发价值，近年来受到国内外的广泛关注。紫苏原产亚洲东部，有野生型和栽培型，广泛分布于我国各省区，以及不丹、印度中南半岛、印度尼西亚、爪哇、日本、朝鲜等地。在我国已有2000多年的栽培历史，北方以供油用为主，兼作药用，有西北、东北2个传统油用产区；南方主要以药用为主，兼作香料和食用。作为一种多用途的经济植物，紫苏的研究与应用越来越引起人们的关注。目前国内外相关研究主要集中于紫苏的开发利用、种质资源重要农艺性状及多样性研究、种植栽培技术、含油量分析和功能物质等化学成分的提取、离体再生培养和转基因研究、以及重要物质的合成及基因分析等方面。
分子标记是一种高效的遗传标记，能有效、快速鉴定种质资源，是重要的资源鉴定分析手段。已有前人利用RAPD、SRAP、ISSR和ITS等标记技术分析紫苏的遗传多样性及不同地域材料的亲缘关系。但紫苏属植物的分子标记类型仍较为狭窄，并且标记数量较少，能够应用于紫苏种质鉴定、遗传图谱构建、功能基因定位等研究，具有简便、高效、稳定和种属特异性的分子标记体系较少。
简单重复序列(Simple Sequence Repeats，SSR)标记是近年发展的一种广泛采用且较理想的遗传标记，具有数量丰富、分布广泛、多态性强、共显性遗传和易于分析等特点。但需要针对物种进行引物开发及多态性检验的SSR标记特异性，成为限制其使用的主要原因。目前，SSR标记开发数据主要来自于基因组、转录组及公共数据库的EST序列。EST-SSR标记无需构建基因组文库、杂交、测序，节约人力、物力和时间，同时EST-SSR多态性可能与基因功能直接相关，在相近植物间具有良好通用性，且转化率较高，能充分利用现有测序数据，大幅度降低开发成本。已在人参、杜仲、透骨草和丹参等植物中成功开发了EST-SSR，但在紫苏中尚未应用。
现有技术中已经有利用已报道的或新开发的SSR标记对来自韩国和日本的100多份紫苏种质资源进行了遗传多样性分析(Lee J K et al，G enetic Resource and CropEvolution，2003，50：65-74；Park Y J et al，Genetic Resource and Crop Evolution，2008，55∶523-535；Kwon S J et al，Molecular Ecology Notes，2005，5∶455-457)。上述的研究结果显示，紫苏的SSR标记多态性较为丰富，且具有一些种质特异性的位点，这为SSR分子标记应用于紫苏遗传关系和指纹图谱构建等研究提供了切实可行的方法。
但是，目前我国利用SSR分子标记进行紫苏新品种鉴定的研究较少，为此，本发明开发设计了新的SSR分子标记及其扩增引物，用于我国紫苏的种质资源鉴定。
发明内容
本发明的第一个发明目的是提供本发明的第一目的在于提供一种用于检测紫苏的SSR分子标记的引物对组，所述引物对组能够用于准确、快速地检测紫苏的SSR分子标记，通过检测上述SSR分子标记从而鉴定紫苏的品种，在品种的选育方面具有广泛的应用前景。
本发明的第二个目的是提供一种SSR分子标记引物组在鉴定鉴别紫苏种质资源中的应用。
本发明的第三个目的是提供一种于检测紫苏SSR分子标记的试剂盒，所述试剂包括前述引物对组。
本发明的第四个目的是提供一种含有SSR标记物检测引物组的试剂盒在鉴定鉴别紫苏种质资源中的应用。
本发明的第五目的在于提供一种利用SSR分子标记技术鉴别紫苏种质资源亲缘关系的方法，本发明所述方法能够准确、快速地检测SSR分子标记，并利用所述的标记评价鉴定紫苏种质资源，在紫苏品种的选育方面具有广泛的应用前景。
本发明的第六个目的在于提供一种分离的SSR标志物。
本发明的第七个目的在于提供上述的引物对组、试剂盒或标志物在紫苏育种中的应用。
为了实现本发明的上述目的，采用以下技术方案：
一种用于检测紫苏SSR分子标记的引物对组，所述引物对组包括7对引物对中任一一对或其组合，具体如下表所示：
本发明还涉及一种用于检测紫苏SSR分子标记的试剂盒，所述试剂盒包括前述引物对组。在一些具体的实施方式中，所述试剂盒中还包括水、PCR缓冲液、dNTPs、DNA聚合酶、上样缓冲液和分子量标记物中的一种或多种。在一些具体的实施方式中，所述DNA聚合酶选自所述DNA聚合酶选自Taq、Bst、Vent、Phi29、Pfu、Tru、Tth、Tl1、Tac、Tne、Tma、Tih、Tf1、Pwo、Kod、Sac、Sso、Poc、Pab、Mth、Pho、ES4DNA聚合酶、Klenow片段；更优选地，所述DNA聚合酶为Taq DNA聚合酶；特别优选地，所述Taq DNA聚合酶为热启动Taq DNA聚合酶。本发明所述一种利用SSR分子标记技术鉴别紫苏种质资源亲缘关系的方法，其特征在于：包括如下步骤：
紫苏不同种质资源基因组DNA的提取；
SSR引物设计和筛选；
利用SSR引物对紫苏不同种质资源DNA进行PCR扩增；
对PCR产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳检测；
读取谱带，进行聚类分析得出紫苏种质资源亲缘关系。
在一个具体的实施例中，DNA提取的方法为(1)紫苏不同种质资源基因组DNA的提取；将紫苏不同种质资源在温室或田间播种，待植株生长至3-5片叶时，取充分展开的幼叶，用液氮充分研磨后采用CTAB法提取植物总DNA，提取缓冲液组成为3％CTAB，100mmol/LTris-HCl，20mmol/L EDTA pH8.0，1.4mmol/L NaCl，2％β-巯基乙醇，添加5％P VP防治氧化反应发生。经1.0％琼脂糖凝胶电泳和NanoDrop ND-1000紫外可见分光光度计检测，DNA没有拖尾，OD260/OD280在1.8～2.0之间，说明DNA纯度高，完整性好，将DNA稀释至50ng/μL，-20℃保存备用。
在另外一个具体的实施例中，SSR引物的设计和筛选的方法为：根据NCBI公布的紫苏EST序列，参考丹参、薄荷等唇形科植物的测序结果，利用primer5.0设计22对引物，经预扩增最终选取7对条带清晰、稳定性好、多态性丰富的SSR引物。引物长度为19-24bp，产物长度为150-400bp。
在另外一个具体的实施例中，所述的利用SSR引物对紫苏不同种质资源DNA进行PCR扩增方法为：PCR扩增为10μl体系，其中DNA模板(50ng/μl)1μl，Taqase(2.5U/μl)0.2μl，10×PCR Buffer 1.8μl，dNTP(2.5mmol/l)0.8μl，上游引物0.8μl，下游引物0.8μl，ddH2O4.6μl。反应程序如下：94℃预变性5min，94℃变性45s，退火温度为55℃进行45s，72℃复性1min，共35个循环，72℃延伸10min，4℃保存。
在另外一个具体的实施例中，所述的对PCR产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳检测方法为：扩增产物用12％聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，80W恒定功率预电泳30min，80W恒功率电泳2个小时左右，弱碱法银染检测，将凝胶在成像仪中拍照保存。
在另外一个具体的实施例中，所述的读取谱带方法为，进行聚类分析得出紫苏种质资源亲缘关系。统计扩增情况，在相同的位置上，有清晰条带计为1，没有条带计为0，得到一个“0，1”矩阵。多态性条带定义为在所有供试品种中，对某一扩增条带有的品种有，有的品种没有。引物的多态性带百分率PPB(Percentage of Polymorphic Bands)定义为多态性条带数占扩增总条带数的百分比。用NTSYS2.1软件按照计算遗传距离，利用非加权配对算术平均法UPGMA进行聚类分析，构建分子进化系统树。
本发明的有益效果是利用SSR核心引物对不同紫苏种质资源DNA进行PCR扩增，使用PAGE胶电泳分离扩增产物，利用统计软件进行聚类分析，进而明确不同种质材料的亲缘关系。本方法操作简单，鉴定快速，费用低，准确度高，可以有效鉴定紫苏种质的亲缘关系，对研究紫苏进化和杂交育种的亲本选配具有重要作用。
附图说明
图1本申请引物对对24个紫苏品种的PCR扩增产物的聚丙烯酰胺凝胶电泳图。
图2根据聚类分析获得的紫苏进化树。
具体实施方式
下面的实施例用来对本发明进行说明，而不是限制本发明。
材料：24个紫苏品种(系)包括全国各地收集24份紫苏种质，样品编号和名称见表1。
表1紫苏样品编号及名称
试剂：SSR引物合成由上海生工生物工程技术服务有限公司完成、酶、dNTPs、Buffer、DNA marker、DNA Taq聚合酶等购自大连宝生物试剂公司；CTAB、聚丙烯酰胺凝胶制剂等均为国产分析纯。
实施例1 DNA提取
将紫苏不同种质资源在温室或田间播种，待植株有3-5片叶时，取充分展开的幼叶，用液氮研磨后采用CTAB法提取DNA，经1.0％琼脂糖凝胶电泳检测DNA纯度，用NanoDropND-1000紫外可见分光光度计检测DNA纯度和浓度。将DNA浓度稀释至50ng/μL，-20℃保存备用。
实施例2 SSR引物设计和筛选
根据NCBI公布的紫苏EST序列，参考丹参、薄荷等唇形科植物的测序结果，利用primer5.0设计22对引物，经预扩增最终选取7对条带清晰、稳定、多态性丰富的SSR引物。引物长度为19-24bp，产物长度为150-400bp。
所述的引物序列具体为：
实施例3利用SSR引物对紫苏不同种质资源DNA进行PCR扩增
PCR扩增为10μl体系，其中DNA模板(50ng/μl)1μl，Taqase(2.5U/μl)0.2μl，10×PCR Buffer 1.8μl，dNTP(2.5mmol/l)0.8μl，上游引物0.8μl，下游引物0.8μl，ddH2O 4.6μl。
反应程序如下：94℃预变性5min，94℃变性45s，退火温度为55℃进行45s，72℃复性1min，共35个循环，72℃延伸10min，4℃保存。
实施例4对PCR产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳检测及结果判读
扩增产物用12％聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，银染显色检测，将凝胶在成像仪中拍照保存，结果见图1。
读取谱带，进行聚类分析得出紫苏种质资源亲缘关系
统计扩增情况，在相同的位置上，有清晰条带计为1，没有条带计为0，得到一个“0，1”矩阵。用NTSYS2.1软件按照UPGMA进行聚类分析，构建分子进化系统树。结果见图2.
表2 24个紫苏品种的SSR扩增的多态性
表3 24个紫苏品种的遗传距离和遗传相似性系数
表3 24个紫苏样品的遗传距离和相似系数
以上描述了本发明优选实施方式，然其并非用以限定本发明。本领域技术人员对在此公开的实施方案可进行并不偏离本发明范畴和精神的改进和变化。
序列表
<110> 河北省农林科学院经济作物研究所
<120> 一种鉴定紫苏种质的SSR标记引物及其应用
<160> 14
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
agggtgaatc ttggggtgtt 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
aatattcatg gctcggcttg 20
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 3
tgaattggct gagaagagtg ag 22
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 4
aacgaatggc ataggtcact g 21
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<212> DNA
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cttggaatgg atggtacgaa 20
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ggattgggat ggagggaata 20
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atcgatatgc gtgaggaagg 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 14
gctgaacaga cgaaggaagc 20
Claims (9)
1.一种用于检测紫苏的SSR分子标记的引物对组，所述引物对组选自SEQ ID NO：1-14中的一组或多组。
2.根据权利要求1所述的引物组，其中所述的引物组具体为
3.权利要求1或2所述的SSR分子标记引物组在鉴定鉴别紫苏种质资源中的应用。
4.一种于检测紫苏SSR分子标记的试剂盒，所述试剂包括权利要求1或2所述的引物对组。
5.权利要求4所述的一种含有SSR标记物检测引物组的试剂盒在鉴定鉴别紫苏种质资源中的应用。
6.一种利用SSR分子标记技术鉴别紫苏种质资源亲缘关系的方法，其特征在于：
1)紫苏不同种质资源基因组DNA的提取；
2)SSR引物设计和筛选；
3)利用SSR引物对紫苏不同种质资源DNA进行PCR扩增；
4)对PCR产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳检测；
5)读取谱带，进行聚类分析得出紫苏种质资源亲缘关系。
7.一种分离的SSR标志物，所述的标志物是由权利要求1或2所述的引物扩增获得。
8.权利要求7所述的标志物在紫苏育种中的应用。
9.权利要求1或2所述的引物，权利要求4所述的试剂盒在紫苏育种中的应用。
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