CN100497656C

CN100497656C - 一种共显性标记方法及其在植物育种中的应用

Info

Publication number: CN100497656C
Application number: CNB2005100864442A
Authority: CN
Inventors: 杜永臣; 国艳梅; 王孝宣; 高建昌; 朱德蔚; 戴善书
Original assignee: Institute of Vegetables and Flowers Chinese Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Beijing Zhong Zhong fine breed Co., Ltd.
Priority date: 2005-09-20
Filing date: 2005-09-20
Publication date: 2009-06-10
Anticipated expiration: 2025-09-20
Also published as: CN1769493A

Abstract

本发明公开了一种共显性标记(Codominant-SCAR)方法。其步骤包括对作物已有的RFLP、AFLP、CAPS、RAPD、COS等标记的父本、母本的DNA序列，进行同源性比较后，利用Primer5或其它软件设计引物，分别获得与父、母本材料基因型一致的显性SCAR引物。在此基础上，同时将父、母本的特异引物加入到同一PCR反应体系中，得到了能同时鉴定父本、母本及其杂合体基因型的特异谱带。该标记在应用上具有重复性好、迅速、简便和成本低的特点，非常适合于样品的大量分析。

Description

一种共显性标记方法及其在植物育种中的应用

技术领域

本发明涉及一种植物共显性标记(Codominant-SCAR)方法。具体地说，是将SCAR标记原理与多引物PCR技术结合来建立的一种方法。进一步地，本发明利用该方法对12份番茄近等基因系进行了遗传鉴定。

背景技术

1992年Tanksley等发表了以RFLP标记为主的高密度番茄连锁图谱，平均每1.2cM(厘米)就有一个标记(Tanksley等，1992)。此后，番茄图谱不断被各种标记饱和(Http://www.sgn.cornell.edu/maps/tomato_arabidopsis)。拟南芥基因组测序的完成加速了番茄图谱上分子标记的饱和，例如利用番茄已有的EST序列与拟南芥基因组序列信息开发的COS(Conserved OrthologSet)标记技术使番茄图谱的COS标记增加到300个。RFLP技术是基于物种的基因组DNA在限制性内切酶作用下，产生不同大小的DNA片段，用放射性同位素标记的DNA作探针，把与被标记DNA相关的片段检测出来，从而构建出多态性图谱。高密度的分子图谱和分子标记为番茄的分子育种奠定了基础。但是RFLP、COS等标记存在费用高，步骤复杂，周期长，要求高质量DNA等缺点，在辅助育种中很难推广，并且RFLP标记要使用放射性同位素。

因此，在分子育种中一些RFLP、COS等标记常被转化成简单方便的SCAR(特征性片段扩增区域，sequence characterized amplifiedregion)、CAPS(酶切扩增多态性序列，cleaved amplified polymorphismsequences)等标记。SCAR标记一般是由RFLP、RAPD、AFLP等标记转换而来，其基本原理是根据已获得的标记片段的序列信息，设计一对特异引物，然后通过PCR来揭示多态性。

本发明利用SCAR标记的原理和多引物PCR技术，建立了一种共显性标记技术(Codominant-SCAR)，即在获得与父本、母本基因型一致的显性SCAR标记的基础上，同时将父母本的特异引物加入到同一PCR反应体系中，得到了能同时鉴定父本、母本及其杂合体的基因型的特异谱带。这样本发明结合了SCAR标记和多引物PCR技术原理建立了能同时检测父本、母本及其杂合体的基因型的共显性标记方法。该标记是一种十分稳定的分子标记，在应用上具有重复性好、迅速、简便、低成本的特点，非常适合于样品的大量分析。对于作物分子育种和构建遗传图谱而言更具优越性。由于共显性标记提供的信息量多，对于鉴定杂交种子的纯度，以及为农作物新品种审定、保护品种的知识产权等方面也提供了方法和技术借鉴。对于番茄、水稻、玉米、拟南芥等序列信息丰富的植物，RFLP、RAPD、AFLP、COS等标记和已克隆的基因都可能根据其双亲的序列信息设计特异引物，将其转换成共显性的SCAR标记。

发明内容：

(一)、要解决的技术问题

本发明的目的在于提供一种植物分子育种方法。

本发明的另一个目的在于提供一种植物共显性标记(Codominant-SCAR)的方法在农作物育种中的应用。

本发明的再一个目的在于提供一种植物共显性标记(Codominant-SCAR)的方法在植物近等基因系遗传鉴定中的应用。

(二)、技术方案

本发明的植物分子育种方法包括：

(a)对作物已有的RFLP、AFLP、CAPS、RAPD、COS等标记的父本、母本的DNA序列，进行同源比较；

(b)进行引物设计分别获得与父、母本材料基因型一致的显性SCAR引物；

(c)同时将父母本的特异引物加入到同一PCR反应体系中，得到能同时鉴定父本、母本及其杂合体的基因型的特异谱带。

按照本发明，上游引物分别处于其特异的DNA序列内，每个引物只能与相应的同源序列配对，而下游引物则是同一个引物。

按照本发明，父、母本一致的显性SCAR上游引物分别为SCAR-A和SCAR-B，下游为T0974R。

SCAR-A序列为：5’-GTTCTCTCCGCCGTCGTTCG-3’；

SCAR-B序列为：5’-TCAGACCCATATGAAGTTGTCA-3’；

T0974R序列：5’-ACTTGCAAAATCAAGGGTCG-3’。

PCR体系如下：

10mmol/L SCAR-A 0.5μL

10mmol/L SCAR-B 1.0μL

10mmol/L T0974R 0.5μL

模板 50ng

10×PCR缓冲液 2.5μL

25mmol/L Mg²⁺ 1.0μL

TaqDNA聚合酶 1.25U

10mmol/L dNTPs 2.5μL

去离子水加至25μL

PCR扩增的程序：

92℃ 3分钟；然后40个扩增循环，分别是92℃ 1分钟、64℃ 1分钟、72℃ 2分钟；最后72℃ 8分钟，保存温度4℃。

(三)、有益效果

本发明将SCAR标记和多引物PCR技术的优点综合在一起，同时将父、母本的特异SCAR引物加入到同一PCR反应体系中，得到同时鉴定父本、母本及其杂合体基因型的特异谱带，从而建立了共显性SCAR(Codominant-SCAR)标记方法。该标记是一种十分稳定的分子标记，在应用上具有重复性好、迅速、简便、低成本、信息量大等特点，非常适合于样品的大量分析。对于分子育种、构建遗传图谱、鉴定杂交种子的纯度、农作物新品种审定、保护品种的知识产权等方面均具有较大的应用价值。

附图说明：

图1分别为利用CAPS引物、引物SCAR-A和SCAR-B对TA1527与E6203的PCR扩增结果，以及利用引物SCAR-A+SCAR-B对其F₁的扩增结果。所标示的M为标准分子量，2为番茄TA1527，3为番茄E6203；

图2是利用共显性标记技术Codominant-SCAR对TA517的12个近等基因系遗传鉴定的电泳图，所标示的M为100bp标准分子量，1A为番茄E6203，67为番茄TA517，75为TA1527，68～79分别为TA517的12个近等基因系。

具体实施方式：

实施例1：共显性标记技术Codominant-SCAR的建立

番茄材料TA1527，E6203播种于温室，待幼苗长到6～8片真叶时，提取细嫩叶片中的DNA进行分析。DNA提取按照常规CTAB(Williamson V M.等，1994)小量提取方法进行，DNA贮存于-20℃的冰箱中备用。

以COS标记T0974为研究对象，先将其转化成为CAPS标记，并得到了亲本材料TA1527、E6203的CAPS标记的PCR产物(王孝宣.中国农业科学院学位论文，2004)。将PCR产物测序(三博远志公司测序)，获得测序结果分别命名为T0974-2F、T0974-3R。

对T0974-2F和T0974-3R序列用DNAMAN进行同源比较，再用Primer Pmemier5.0对T0974-2F、T0974-3R序列进行设计，分别获得与TA1527和E6203基因型一致的显性SCAR引物，并命名为SCAR-A和SCAR-B。引物设计的最显著特点是SCAR-A和SCAR-B的上游引物分别处于其特异的DNA序列内，每个引物只能与相应的同源序列配对，而下游引物则是同一个引物。SCAR-A和SCAR-B分别与下游引物配对扩增得到分子量不同的PCR产物。

SCAR-A、SCAR-B及同时加入SCAR-A+SCAR-B的优化的PCR反应体系和PCR扩增程序分别为：

SCAR-A和SCAR-B的体系相同，均为：50ng模板、2.5μL 10×PCR缓冲液、1.0μL Mg²⁺(25mmol/L)、1.25U TaqDNA聚合酶、0.5μL SCAR-A(10mmol/L)或SCAR-B(10mmol/L)、0.5μLT0974R(10mmol/L)、2.5μL dNTPs(10mmol/L)，加去离子水至25μL。

SCAR-A+SCAR-B的优化体系如下：引物比例分别为SCAR-A(10mmol/L)的上游引物0.5μL、SCAR-B(10mmol/L)的上游引物1.0μL及其共有的下游引物(10mmol/L)0.5μL，其余成分相同。

SCAR-A、SCAR-B及SCAR-A+SCAR-B的PCR扩增的程序相同：92℃ 3分钟；然后40个扩增循环，分别是92℃ 1分钟、64℃ 1分钟、72℃ 2分钟；最后72℃ 8分钟，保存温度4℃。

表1 引物名称及序列

结果表明(图1)：CAPS引物扩增的PCR产物相同，约为370bp，E6203与TA1527都有此谱带；根据E6203的序列设计的特异引物SCAR-B经扩增后仅在E6203中获得270bp的PCR产物，而TA1527没有该特异谱带，表明该谱带为与E6203基因型一致的显性SCAR标记；根据TA1527的序列设计的特异引物SCAR-A经扩增后仅在TA1527中获得200bp的PCR产物，而E6203没有该特异谱带，表明该谱带为与TA1527基因型一致的显性SCAR标记；同时加入SCAR-A和SCAR-B对F₁的PCR扩增结果分别获得了一个与E6203和TA1527基因型一致的谱带，两谱带的多态性正是两个引物多态性的叠加，分子量为270bp和200bp，表明获得了可同时区分亲本TA1527、E6203及其杂交一代的共显性SCAR标记。

实施例2：对TA517的12个近等基因系的遗传鉴定

应用了番茄材料TA517，TA1527，E6203，以及TA517的12个近等基因系：02P68、02P69、02P70、02P71、02P72、02P73、02P74、02P75、02P76、02P77、02P78、02P79。所有试材播种于温室，待幼苗长到6～8片真叶时，提取细嫩叶片中的DNA进行分析。DNA提取、引物设计以及PCR条件按照实施例1进行。

结果表明(附图2)：67、75、68、69、71及72的多态性表现一致，得到一条270bp的谱带，1A、70、73、74、76、78及79多态性表现一致，得到一条200bp的谱带，与预期结果一致(王孝宣.中国农业科学院学位论文，2004，26-30)。

序列表

<110>中国农业科学院蔬菜花卉研究所

<120>一种共显性标记方法及其在植物育种中的应用

<130>

<140>200510086444.2

<141>2005-09-20

<160>4

<170>PatentIn version 3.5

<210>1

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1

<210>2

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>2

<210>3

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<400>3

<210>4

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>4

Claims

1.一种植物共显性标记的方法，其特征在于包括以下步骤：

(a)对作物已有的RFLP、AFLP、CAPS、RAPD、COS标记的父本、母本的DNA序列进行同源比较；

(b)引物设计分别获得与父、母本材料基因型一致的显性SCAR引物，上游引物分别处于其特异的DNA序列内，每个引物只能与相应的同源序列配对，而下游引物则是同一个引物，使得PCR产物呈长度多态性；

(c)同时将父母本的特异引物加入到同一PCR反应体系中进行扩增，PCR产物经凝胶电泳检测鉴定父本、母本及其杂合体的基因型，

其中，所述作物为番茄TA1527和E6203及其杂交后代，与父、母本一致的显性SCAR上游引物分别为SCAR-A和SCAR-B，下游引物为T0974R，其中：

SCAR-A序列为：5’-GTTCTCTCCGCCGTCGTTCG-3’；

SCAR-B序列为：5’-TCAGACCCATATGAAGTTGTCA-3’；

T0974R序列为：5’-ACTTGCAAAATCAAGGGTCG-3’。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于PCR体系如下：

10mmol/L SCAR-A 0.5μL

10mmol/L SCAR-B 1.0μL

10mmol/L T0974R 0.5μL

模板 50ng

10×PCR缓冲液 2.5μL

25mmol/L Mg²⁺ 1.0μL

TaqDNA聚合酶 1.25U

10mmol/L dNTPs 2.5μL

去离子水加至25μL。

3.如权利要求2所述的方法，其中PCR扩增的程序均为：92℃ 3分钟；然后进行40个扩增循环，分别是92℃ 1分钟、64℃ 1分钟、72℃ 2分钟；最后72℃ 8分钟，保存温度4℃。

4.权利要求1～3任一所述的方法在番茄育种中的应用。