CN104774951B - 大白菜est‑ssr标记及其引物与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明专利涉及大白菜EST‑SSR标记及其引物与应用。本发明公开了大白菜EST‑SSR标记BR‑es10及其引物、大白菜EST‑SSR标记BR‑es13及其引物和大白菜EST‑SSR标记BR‑es15及其引物，通过对24个大白菜品种的DNA进行扩增，并利用6％变性聚丙烯酰氨凝胶和/或12％非变性聚丙烯酰氨凝胶电进行检测，发现上述3组EST‑SSR引物的扩增产物带型明显，且在品种间具有很好的多态性，能够很好的区分不同的品种，可用于大白菜品种的鉴定及品种指纹图谱的构建。

Description

大白菜EST-SSR标记及其引物与应用
技术领域
本发明专利涉及大白菜EST-SSR标记及其引物与应用，特别涉及三组大白菜EST-SSR标记及其引物和在品种指纹图谱构建中的应用，属于分子生物学技术领域。
背景技术
分子标记的出现使得育种工作中的选择由传统的表型选择转变为基因型选择，大大提高了选择的准确性和效率，因此分子标记自一出现即成为育种工作及遗传学研究重要的不可缺少的工具。特别是基于PCR的分子标记如RAPD(Williams et al.，1990)、SSR(Akkaya et al.，1992)、AFLP(Vos et al.，1995)等的出现，因其简便、快速和高效等特点，使分子标记的开发与利用已遍及各种作物。SR(Simple sequence repeat)，又称微卫星DNA，是由1-6个核苷酸组成的基序串联重复序列。同一物种的不同材料SSR基序重复次数不同，用重复区两侧相对保守的单拷贝序列设计引物，对基因组总DNA进行扩增，扩增片断的长度多态性可作为不同材料的特异分子标记。SSR标记具有多态性高、共显性、可靠性高、技术难度低等优点，已被广泛应用于各种作物遗传图谱的构建、分子标记辅助选择、功能基因定位以及各种作物种质资源遗传多样性的评价等研究中(Plieske and Struss,2001；方宣钧等，2001)。
近年来植物结构基因组学和功能基因组学迅猛发展，人们获得了许多植物大量的基因组序列、EST序列以及全基因序列。这种时代背景下，在评价种质资源多样性时，人们更希望能了解资源材料中功能基因的多样性(Varshney et al.,2005a)。这就促使人们从功能基因序列中寻找可遗传变异。经过分析，人们在EST序列中(包括基因的编码区、5`-UTR区及3`-UTR区)发现了大量的可变异的SSR位点，即EST-SSR。此外，人们在功能基因区还开发了SNP(Single Nucleotide Polymorphism)、COS(Conserved Orthologous Sets ofmarkers)等标记技术，这些标记均可用来对功能基因的多样性进行评价(Varshney etal.,2005a)。但由于具有多态性高、可靠性高、技术难度低、共显性等优点，EST-SSR成为目前植物功能基因多样性研究的主要工具。现已在小麦、水稻、玉米、棉花等许多作物中开发出大量的EST-SSR引物，用于这些作物的遗传多样性评价以及其它工作中(Varshney etal.,2005b)。
大白菜(Brassica rapa ssp.pekinensis，AA基因组，2n＝20)为十字花科芸薹属植物，原产于我国，现广泛栽培于我国、韩国、朝鲜及日本。因其营养丰富且富含膳食纤维，人们普遍喜欢食用，在我国以及世界许多国家的蔬菜生产和消费中占有非常重要的地位。目前根据大白菜基因组测序结果以及数据库中的EST序列，已经开发了大量EST-SSR标记(Li and Zheng,2009；Li et al.,2009b；Xin et al.,2006；Paida et al.2010；Ge etal.,2011；Ramchiary et al.,2011；Shi et al.2014)。但是有关大白菜EST-SSR引物的开发仍未达到饱和。开发新的EST-SSR引物，对于构建高密度遗传图谱和品种指纹图谱具有重要意义，对于大白菜的分子育种工作将有现实的指导以及实践意义。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供大白菜EST-SSR标记及其引物与应用。本发明提供了3组EST-SSR标记BR-es10、BR-es13和BR-es15的引物，并将它们应用于品种指纹图谱的构建中。
本发明技术方案如下：
大白菜EST-SSR标记BR-es10，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
大白菜EST-SSR标记BR-es10的引物，该检测引物为一对，上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
大白菜EST-SSR标记BR-es13，核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
大白菜EST-SSR标记BR-es13的引物，该检测引物为一对，上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
大白菜EST-SSR标记BR-es15，核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。
大白菜EST-SSR标记BR-es15的引物，该检测引物为一对，上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示，下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示。
上述大白菜EST-SSR标记BR-es10的引物、大白菜EST-SSR标记BR-es13的引物和/或大白菜EST-SSR标记BR-es15的引物在大白菜品种鉴定及品种指纹图谱构建中的应用。
有益效果
本发明首次公开了大白菜EST-SSR标记BR-es10及其引物、大白菜EST-SSR标记BR-es13及其引物和大白菜EST-SSR标记BR-es15及其引物，通过对24个大白菜品种的DNA进行扩增，并利用6％变性聚丙烯酰氨凝胶和/或12％非变性聚丙烯酰氨凝胶电进行检测，发现上述3组EST-SSR引物的扩增产物带型明显，且在品种间具有很好的多态性，能够很好的区分不同的品种，可用于大白菜品种的鉴定及品种指纹图谱的构建。
附图说明
图1是大白菜EST-SSR标记BR-es10的引物在24个大白菜材料中的PCR扩增电泳图；
图2是大白菜EST-SSR标记BR-es13的引物在24个大白菜材料中的PCR扩增电泳图；
图3是大白菜EST-SSR标记BR-es15的引物在24个大白菜材料中的PCR扩增电泳图；
图中：泳道1、682；泳道2、广东早；泳道3、早皇白；泳道4、Z61-8；泳道5、福山包头；泳道6、Li-3；泳道7、212-7；泳道8、天津青麻叶；泳道9、快菜6号；泳道10、黄金小白菜J；泳道11、四季小白菜；泳道12、四季黄秧小白菜；泳道13、品早1号；泳道14、韩育特选黄心；泳道15、全能四季快菜；泳道16、京优小白菜快菜；泳道17、高丽金娃娃；泳道18、可义夏娃娃；泳道19、金诺春秋娃娃菜；泳道20、四季绿杆小苦菜；泳道21、油绿157；泳道22、束腰油菜；泳道23、德高油亮青梗菜；泳道24、青秀F1青梗菜。
具体实施方式
下面结合实施例及说明书附图对本发明的技术方案做进一步阐述，但本发明所保护范围不限于此。
生物材料来源
682、广东早、早皇白、Z61-8、福山包头、Li-3、212-7、快菜6号、品早1号均购自山东登海种业股份有限公司西由种子分公司；
天津青麻叶购自北京澳硕丰农业科技有限公司；
黄金小白菜购自安徽仁信种子有限公司；
四季小白菜购自天津英良种业；
四季黄秧小白菜购自江西省丰城市航城种业有限公司；
韩育特选黄心购自青县纯丰蔬菜良种繁育场；
全能四季快菜购自青岛市黄岛区黄海泽农种苗研究所；
京优小白菜快菜购自北京澳硕丰农业科技有限公司；
高丽金娃娃购自北京市特种蔬菜种苗公司；
可义夏娃娃购自北京卓生农业科技有限公司；
金诺春秋娃娃菜购自北京金诺阳光种子有限责任公司；
四季绿杆小苦菜购自云鸿蔬菜花卉种苗研究所；
油绿157购自北京澳硕丰农业科技有限公司；
束腰油菜购自北京澳硕丰农业科技有限公司；
德高油亮青梗菜购自山东德州市德高蔬菜种苗研究所德州市蔬菜工程技术研究中心；
青秀F1青梗菜购自青岛国际种苗有限公司。
实施例1.EST-SSR引物的开发
开发EST-SSR引物所用的EST序列来自于本课题组对大白菜(B.rapassp.pekinensis)莲座叶和球叶的高通量转录组测序(Wang et al.，2012)。通过转录组测序，共获得5,347万条高质量EST序列。对这些EST序列利用Trinity软件(http:// trinityrnaseq.sourceforge.net/)进行组装，得到相应的contig和unigene，然后利用TGICL软件包(TIGR Gene Indices Clustering)去冗余，共获得5.2万个Unigene。本研究利用MISA软件(http://www.pgrc.ipk-gatersleben.de/misa)对这5.2万个Unigene进行了EST-SSR的分析和鉴定(标准参见Zhang et al.，2004)，共获得1.04万个EST-SSR。通过与大白菜SSR数据库(http://oilcrops.info/SSRdb)中已知的SSR进行比对，共发现2701个新的EST-SSR。选取其中的3对引物用于品种鉴定分析(见表1)。
表1.本研究开发的3对EST-SSR引物
实施例2.EST-SSR标记的引物的应用
2.1植物材料与模板DNA的提取
选取24个大白菜品种(系)：682，广东早，早皇白，Z61-8，福山包头，Li-3，212-7，天津青麻叶，快菜6号，黄金小白菜J，四季小白菜，四季黄秧小白菜，品早1号,韩育特选黄心，全能四季快菜，京优小白菜快菜，高丽金娃娃，可义夏娃娃，金诺春秋娃娃菜，四季绿杆小苦菜，油绿157，束腰油菜，德高油亮青梗菜，青秀F1青梗菜。分别标记为1-24组。
以改良的CTAB法提取总DNA，具体步骤如下：
1.取1-10g新鲜大白菜叶片，在液氮中快速研成粉；
2.将冻粉转入预冷的离心管中，加入等体积2×CTAB提取缓冲液，65℃保温20分钟；
3.加入等体积的氯仿/异戊醇(氯仿与异戊醇的体积比为24:1)，颠倒离心管混匀，12000r/min室温离心10分钟；
4.将上清液转入另一离心管中,加入等体积的氯仿/异戊醇(氯仿与异戊醇的体积比为24:1)，颠倒离心管混匀，12000r/min室温离心10分钟；
5.将上层水相转入新的离心管中，加入等体积的异丙醇，轻轻颠倒混匀，室温下放置30分钟；
6.12000r/min室温离心5-10分钟，去上清液；
7.70％乙醇漂洗，12000r/min室温离心5-10分钟，去上清液；
8.重复步骤7一次；
9.沉淀风干，加入100ul的TE缓冲液或超纯水溶解DNA，-20℃保存备用；
10.取2μl溶液利用1％琼脂糖凝胶电泳检测。
2.2PCR扩增
根据SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.6的核苷酸序列，在上海生工合成大白菜EST-SSR标记BR-es10的引物、大白菜EST-SSR标记BR-es13的引物和大白菜EST-SSR标记BR-es15的引物，溶解后稀释至2μM备用。
以上述提取的1-24组总DNA为模板，分别以大白菜EST-SSR标记的引物进行PCR扩增，制得PCR产物。
PCR反应体系(20μL)：
20ng/μL模板DNA 2μL，10×PCR buffer(含20mM的MgCl2)2μL，dNTPs(2.5mM)0.5μL，上游引物(2μM)2.5μL，下游引物(2μM)2.5μL，1U TaqDNA聚合酶0.2μL，加ddH2O至20μL。
扩增程序为：
95℃预变性5min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，共计36个循环；72℃延伸10min。
2.3聚丙烯胺凝胶电泳分离与多态性检测
PCR产物经6wt％变性聚丙烯酰氨凝胶和/或12wt％非变性聚丙烯酰氨凝胶电泳后，利用银染法显影检测。
PCR产物与上样缓冲液混匀后(6wt％变性聚丙烯酰氨凝胶电泳之前，对PCR产物进行95℃预变性10min)，取4μl点样，在 GT核酸电泳系统(Bio-Rad，USA)中进行电泳分离，电极缓冲液为1×TBE，在25℃、55W恒功率下电泳1h，通过银染法显影、拍照并记录结果。
图1是采用大白菜EST-SSR标记BR-es10的引物对24个大白菜材料中的PCR扩增产物进行6wt％变性聚丙烯酰氨凝胶电泳后的结果图；
图2是采用大白菜EST-SSR标记BR-es13的引物对24个大白菜材料中的PCR扩增产物进行12wt％非变性聚丙烯酰氨凝胶电泳后的结果图；
图3是采用大白菜EST-SSR标记BR-es15的引物对24个大白菜材料中的PCR扩增产物进行6％wt变性聚丙烯酰氨凝胶电泳后的结果图；
由图1-图3可以看出，大白菜EST-SSR标记BR-es10的引物、大白菜EST-SSR标记BR-es13的引物和大白菜EST-SSR标记BR-es15的引物可对不同大白菜材料和品种的DNA进行有效扩增，带型清晰，且在不同大白菜材料和品种中具有良好的多态性，能够很好的区分不同材料和品种，可用于大白菜品种指纹图谱的构建。
其中大白菜EST-SSR标记BR-es10的引物在24份材料中发现有3种基因型(0bp，128bp，146bp，如图1所示)，大白菜EST-SSR标记BR-es13的引物有3种基因型(101bp，104bp，105bp，如图2所示)，大白菜EST-SSR标记BR-es15的引物有4种基因型(134bp，146bp，152bp，158bp，如图3所示)。
在图1-3中，1-7泳道为自交系，8-24泳道是商业杂交种；由此可以看出3个EST-SSR在7个自交系中都为纯合基因型，杂合基因型都出现在商业杂交种中，说明上述3对大白菜EST-SSR标记的引物均具有良好的特异性。

Claims (7)

1.大白菜EST-SSR标记BR-es10，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.大白菜EST-SSR标记BR-es10的引物，该检测引物为一对，上游引物核苷酸序列如SEQID NO.2所示，下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
3.大白菜EST-SSR标记BR-es13，核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
4.大白菜EST-SSR标记BR-es13的引物，该检测引物为一对，上游引物核苷酸序列如SEQID NO.5所示，下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
5.大白菜EST-SSR标记BR-es15，核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。
6.大白菜EST-SSR标记BR-es15的引物，该检测引物为一对，上游引物核苷酸序列如SEQID NO.8所示，下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示。
7.权利要求2所述大白菜EST-SSR标记BR-es10的引物、权利要求4所述大白菜EST-SSR标记BR-es13的引物和/或权利要求6所述大白菜EST-SSR标记BR-es15的引物在大白菜品种鉴定及品种指纹图谱构建中的应用。
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