CN101792802B - SRY特异性TaqMan探针引物对与实时荧光SRY基因检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
SRY特异性TaqMan探针引物对，由第一引物对、第一探针、第二引物对和第二探针组成；所述第一引物对由正向引物和反向引物组成，第一引物对中的正向引物的核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO：1所示，第一引物对中的反向引物的核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO：2所示，第一探针的核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO：3所示；所述第二引物对由正向引物和反向引物组成，第二引物对中的正向引物的核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO：4所示，第二引物对中的反向引物的核苷酸序列为序列表中SEQ IDNO：5所示，第二探针的核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO：6所示。一种实时荧光SRY基因检测试剂盒，包括样品处理液、PCR反应液I和PCR反应液II。
Description
技术领域
本发明属于性别决定基因(Sex-determining region Y，本专利申请文件中简称SRY基因)检测领域，特别涉及检测SRY基因的TaqMan探针引物对及实时荧光检测试剂盒。
背景技术
性别分化异常是一种常见的遗传病，其发病率约为1％～3％。这类疾病长期困扰着患者及其亲属，他(她)们无法分辨患者的性别，对患者身心和婚姻等造成严重伤害。人类性别决定和分化是一个及其复杂的过程，其中SRY基因是性别分化的关键基因。SRY基因在未分化的性腺中表达以后，大量与睾丸分化相关的转录因子和生长因子基因开始特异性表达。SRY基因一直被认为是睾丸决定因子的最佳候选基因，在胚胎发育早期的性组织中有短暂的表达，导致原始性腺组织向睾丸组织分化。SRY基因的缺失或突变是造成性发育异常的主要原因之一。对性发育异常患者进行SRY基因检测，有利于了解该类患者的遗传学病因，为其诊断和治疗提供科学依据。
聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，本专利申请文件中简称PCR)是一种选择性体外扩增DNA或cDNA的技术，为最常用的分子生物学技术之一。它包括三个基本步骤：(1)变性：加热模板DNA，使其解离成为单链；(2)退火：使人工合成的一对寡聚核苷酸引物在较低温度条件下(常为37-60℃)与模板DNA上需扩增目的序列结合；(3)延伸：在适宜温度下(一般为72℃)，Taq DNA聚合酶以dNTP为原料使引物端向前延伸，合成与一条与模板碱基序列完全互补的DNA新链。由这三个基本步骤组成一轮循环，理论上每一轮循环将使目的DNA扩增一倍，新合成产生的DNA又可作为下一轮循环的模板，使体系中目的片段呈指数迅速增长，将目的基因或某一DNA片段于数小时内体外扩增至百万倍、千万倍。因此，PCR技术一经问世就被迅速而广泛地用于分子生物学的各个领域。
实时荧光PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程。该技术不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃，而且与PCR相比，它特异性更强，由引物和探针双重保证，非特异性双链DNA不会产生荧光信号、灵敏度更高、能实现多重反应，具有自动化程度高、有效解决PCR污染、实时性和准确性的优势。
目前检测SRY基因一般采用PCR技术，其观察结果主要为凝胶电泳成像法，耗时、耗力、灵敏度低且易污染。在现有技术中，尚未见应用实时荧光PCR技术检测SRY基因的报道，也未见实时荧光PCR技术中涉及的SRY特异性TaqMan探针引物对及试剂盒的报道。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供SRY特异性TaqMan探针引物对和实时荧光SRY基因检测试剂盒，以提高SRY基因检测的准确性和效率，并有效解决PCR的污染问题。
本发明所述SRY特异性TaqMan探针引物对，由第一引物对、第一探针、第二引物对和第二探针组成；所述第一引物对由正向引物和反向引物组成，第一引物对中的正向引物的核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO：1所示，第一引物对中的反向引物的核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO：2所示，第一探针的核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO：3所示；所述第二引物对由正向引物和反向引物组成，第二引物对中的正向引物的核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO：4所示，第二引物对中的反向引物的核苷酸序列为序列表中SEQ IDNO：5所示，第二探针的核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO：6所示。
本发明所述实时荧光SRY基因检测试剂盒，包括样品处理液、PCR反应液I和PCR反应液II；所述样品处理液为含Chelex 100和蛋白酶K的水溶液，所述水溶液中，Chelex100的质量浓度为5％～20％，蛋白酶K的浓度为0.01～0.1mg/ml；所述PCR反应液I为含PCR缓冲液Premix Ex Taq、上述第一引物对和上述第一探针的水溶液，所述水溶液中，PCR缓冲液Premix Ex Taq的体积浓度为50％，第一引物对中正向引物和反向引物的浓度均为0.1～0.8nmol/ml，第一探针的浓度为0.1～0.4nmol/ml；所述PCR反应液II为含PCR缓冲液Premix Ex Taq、上述第二引物对和上述第二探针的水溶液，所述水溶液中，PCR缓冲液Premix Ex Taq的体积浓度为50％，第二引物对中正向引物和反向引物的浓度均为0.1～0.8nmol/ml，第二探针的浓度为0.1～0.4nmol/ml。
使用此试剂盒时，还需要阴性对照和阳性对照，所述阴性对照为女性外周血白细胞DNA溶液，白细胞DNA的浓度10μg/ml，所述阴性对照为男性外周血白细胞DNA溶液，白细胞DNA的浓度10μg/ml；阴性对照和阳性对照既可由使用者制备，也可作为试剂盒的组分提供。
所述试剂盒中，样品处理液、PCR反应液I、PCR反应液II、阴性对照和阳性对照分别各自单独存放。
本发明具有以下有益效果：
1、本发明所述SRY特异性TaqMan探针引物对，针对性别分化异常特殊患者人群设计，该TaqMan探针引物对作为试剂盒的组成部分，提高了SRY基因检测的灵敏度，降低了漏检率的发生。
2、本发明所述实时荧光SRY基因检测试剂盒中的样品处理液实现了从血浆直接检测SRY基因，既大大简化了被检测样品的处理流程，又降低了被检测样品量，使用本发明所述试剂盒运用实时荧光PCR技术进行SRY基因检测，被检测样品仅需10～20μl血浆，而采用常规PCR技术进行SRY基因检测，被检测样品需100～200μl全血(被检测样品处理是从全血白细胞中提取核酸)。
3、使用本发明所述试剂盒运用实时荧光PCR技术进行SRY基因检测，整个检测时间缩短为现有常规PCR技术的三分之一，且操作更为简单。
4、使用本发明所述试剂盒运用实时荧光PCR技术进行SRY基因检测，由于实时闭管检测消除了对PCR产物操作，杜绝了PCR产物的污染。
附图说明
图1是本发明所述引物探针对的设计示意图。
图2是使用本发明所述SRY特异性引物的普通PCR电泳结果图；图中，1-8：使用第一引物对，其中1，2为女性样本，3-7为男性样本，8为试剂空白对照；1’-8’：使用第二引物对，其中1’，2’为女性样本，3’-7’为男性样本，8’为试剂空白对照。
图3是实时荧光PCR特异性试验结果图，图中，1号曲线、2号曲线为第二探针引物体系男性样本扩增曲线；3号曲线、4号曲线为第一探针引物体系男性样本扩增曲线；5号曲线、6号曲线、7号曲线、8号曲线分别为第一，第二探针引物体系女性对照和试剂空白扩增曲线。
图4是使用本发明所述第一探针引物对的实时荧光PCR敏感性试验结果图，图中，1号曲线为未稀释男性样本扩增曲线，2号曲线为10倍稀释男性样本扩增曲线，3号曲线为100倍稀释男性样本扩增曲线，4号曲线为1000倍稀释男性样本扩增曲线，5号曲线为阴性对照扩增曲线。
图5是使用本发明所述第二探针引物对的实时荧光PCR敏感性试验结果图，图中，1号曲线为未稀释男性样本扩增曲线，2号曲线为10倍稀释男性样本扩增曲线，3号曲线为100倍稀释男性样本扩增曲线，4号曲线为1000倍稀释男性样本扩增曲线，5号曲线为阴性对照扩增曲线。
图6是实施例4中的实时荧光PCR试验扩增结果图，图中，1号曲线为使用第二探针引物体系的扩增曲线，2号曲线为使用第一探针引物体系的扩增曲线。
图7是实施例5中的实时荧光PCR试验扩增结果图，图中，1号曲线为使用第二探针引物体系的扩增曲线，2号曲线为使用第一探针引物体系的扩增曲线。
图8是实施例6中的实时荧光PCR试验扩增结果图，图中，1号曲线为使用第二探针引物体系的扩增曲线，2号曲线为使用第一探针引物体系的扩增曲线。
具体实施方式
下述实施例中，配制样本处理液、PCR反应液I和PCR反应液II在室温(25℃)进行，所用水均为无菌水。
实施例1：SRY特异性TaqMan探针引物对的设计和合成
SRY基因(基因序列号：NM_003140)位于Ypl1.3，无内含子，全长897bp，编码204个氨基酸的睾丸决定因子(testis-determining factor，TDF)。所述睾丸决定因子蛋白被分为三个区域，其中间72个氨基酸残基的HMG box(high mobility group box)是主要的功能区域，82％性别分化异常相关突变集中在此结构域。为准确灵敏地检测SRY基因，在设计引物对和探针时，采用了以下设计方案，其设计示意图见图1：
1.避开突变热点区域和已发现的26个SNPs位点，选择了SRY基因HMG box以外的保守区域。
2.考虑到约18％性别分化异常相关SRY基因突变属片段缺失或插入，设计两组引物和探针，分别覆盖HMG box左、右翼区，降低或消除基因缺失引起的假阴性扩增。
3.使用5‘FAM标记和3’TAMRA标记的Taqman水解探针。
SRY特异性TaqMan探针引物对的设计过程中，使用了NCBI和UCSC数据库，以及NCBI在线Prime 3软件。
所设计的SRY特异性TaqMan探针引物对由第一引物对、第一探针、第二引物对和第二探针组成；所述第一引物对由正向引物和反向引物组成，第一引物对中的正向引物的核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO：1所示，第一引物对中的反向引物的核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO：2所示，第一探针的核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO：3所示；所述第二引物对由正向引物和反向引物组成，第二引物对中的正向引物的核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO：4所示，第二引物对中的反向引物的核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO：5所示，第二探针的核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO：6所示。
SRY特异性TaqMan探针引物对的合成：采用固相亚磷酰胺三酯法，使用ABIExpediteTM 8909核酸合成仪(ABI公司)合成。其合成过程可简述为：首先通过固相载体可控微孔玻璃珠连接、合成、戴帽、氧化四个步骤，将一个脱氧核苷酸连接到固相载体，再以三氯乙酸脱去它的5′-羟基上的保护基团。重复以上步骤直到所有要求合成的碱基被联接上去。最后通过氨水高温处理，切下寡核苷酸序列。通过聚丙烯凝胶电泳纯化、浓缩、脱盐、沉淀得到所述探针和引物的纯品。自90年代起，国内外有关核苷酸序列的合成均已专业化、商品化。因此，将所设计的SRY特异性TaqMan探针引物对交由有关专业公司合成。本发明的SRY特异性TaqMan探针引物对均交由TaKaRa公司合成。
实施例2：SRY特异性引物的普通PCR试验
使用全血DNA提取试剂盒(QIAamp DNA mini kit，Qiagen)提取女性和男性外周血白细胞DNA。然后使用紫外分光光度计(Smart Spec Plus，Bio-rad)测量所提取的女性和男性外周血白细胞DNA的浓度，并将所述DNA的浓度调整到500ug/ml。所需时间为45～60分钟。
采用普通PCR电泳体系，反应体系由PCR缓冲液(10×PCR buffer，含2.5mmol/L Mg2+)、dNTP、Taq DNA聚合酶和实施例1所设计和合成的第一引物对和第二引物对组成。其中，dNTP浓度为250μmol/L，Taq DNA聚合酶用量为每个反应0.5U，第一引物对和第二引物对浓度均为0.5nmol/ml。模板用量为2μl，总反应体积20μl。扩增程序：95℃60s→(95℃20s→58℃20s→72℃35s)×40循环。扩增时间70分钟。
扩增结束后在2％琼脂糖凝胶，上样5μl，150V电压，电泳35分钟。以DL2000(上海闪晶分子生物科技有限公司)为分子量指示(片段从小到大依次为100，250，500，750，1000，2000bp)。电泳结果见图2，电泳结果显示，女性样本无扩增，男性样本均有相应扩增产物(第一引物对应扩增产物长度为135bp，第二引物对应扩增产物长度为95bp)。上述结果表明实施例1中所设计和合成的SRY特异性引物的普通PCR试验是成功的。
实施例3：实时荧光PCR试验的特异性和敏感性
试剂组成：
(1)样本处理液：含Chelex 100(Sigma-Aldrich公司)和蛋白酶K(Sigma-Aldrich公司)的水溶液，其中Chelex 100的质量浓度为10％，蛋白酶K的浓度为0.05mg/ml。
(2)PCR反应液I：含PCR缓冲液Premix Ex Taq(TaKaRa公司)、第一引物对和第一探针的水溶液，所述水溶液中，PCR缓冲液Premix Ex Taq的体积浓度为50％，第一引物对中正向引物和反向引物的浓度均为0.5nmol/ml，第一探针的浓度为0.2nmol/ml。
(3)PCR反应液II：含PCR缓冲液Premix Ex Taq、第二引物对和第二探针的水溶液，所述水溶液中，PCR缓冲液Premix Ex Taq的体积浓度为50％，第二引物对中正向引物和反向引物的浓度均为0.5nmol/ml，第二探针的浓度为0.2nmol/ml。
所述第一引物对、第一探针、第二引物对、第二探针为实施例1设计和合成，样本处理液、PCR反应液I和PCR反应液II按上述组分及其含量用无菌水配制而成。
特异性试验：
取正常男性和女性EDTA抗凝的血浆各10μl分别与样品处理液10μl混匀，100℃孵育8min，14000rpm离心5min获处理样本上清液。将18μl PCR反应液I和18μl PCR反应液II分别分配入扩增用毛细管，转入样本处理区，分别加入以上处理样本的上清液2μl。将加样后的扩增管转移到全自动荧光PCR检测仪LightCycler(Roche公司)上进行扩增检测，扩增程序为95℃10s→(95℃5s→60℃20s)×40循环→37℃5s，运行时间35min。结果分析选择F1通道。结果见图3，结果显示：第一引物探针对和第二引物探针对扩增体系中，男性样本均有典型扩增曲线，而女性样本均无扩增。上述结果表明采用实施例1中设计和合成的探针引物及样本处理的实时荧光PCR具有特异性。
敏感性试验：
取实施例2中提取的男性外周血白细胞DNA溶液，用灭菌水10倍稀释，构成500μg/ml，50μg/ml，5μg/ml，0.5μg/ml稀释系列样品。以实施例2中的女性外周血白细胞提取DNA溶液为阴性对照。将上述配方的18μl PCR反应液I和18μl PCR反应液II分别分配入扩增用毛细管，转入样本处理区，分别加入以上稀释系列样品和阴性对照2μl。将加样后的扩增用毛细管转移到全自动荧光PCR检测仪LightCycler(Roche公司)上进行扩增检测，扩增程序为95℃10s→(95℃5s→60℃20s)×40循环→37℃5s，运行时间35min。结果分析选择F1通道。结果见图4和图5，结果显示：第一引物探针对体系和第二引物探针对体系，稀释系列样本扩增曲线呈间隔3.2CT值的典型稀释系列扩增曲线。阴性对照无扩增。上述结果表明采用实施例1中设计和合成的探针引物及样本处理的实时荧光PCR具有足够的敏感性。
实施例4：
试剂盒组成：
样本处理液：含Chelex 100(Sigma-Aldrich公司)和蛋白酶K(Sigma-Aldrich公司)的水溶液，其中Chelex 100的质量浓度为5％，蛋白酶K的浓度为0.01mg/ml。
PCR反应液I：含PCR缓冲液Premix Ex Taq(TaKaRa公司)、第一引物对和第一探针的水溶液，所述水溶液中，PCR缓冲液Premix Ex Taq的体积浓度为50％，第一引物对中正向引物和反向引物的浓度均为0.8nmol/ml，第一探针的浓度为0.4nmol/ml。
PCR反应液II：含PCR缓冲液Premix Ex Taq、第二引物对和第二探针的水溶液，所述水溶液中，PCR缓冲液Premix Ex Taq的体积浓度为50％，第二引物对中正向引物和反向引物的浓度均为0.8nmol/ml，第二探针的浓度为0.4nmol/ml。
所述第一引物对、第一探针、第二引物对、第二探针为实施例1设计和合成，样本处理液、PCR反应液I和PCR反应液II按上述组分及其含量用无菌水配制而成。
实时荧光PCR检测：
以正常男性EDTA抗凝血浆为样本，取血浆10μl与样品处理液10μl混匀，100℃孵育10min，14000rpm离心5min获处理样本上清液。将上述配方的18μl PCR反应液I和18μlPCR反应液II分别分配入扩增用毛细管，转入样本处理区，分别加入以上处理样本的上清液2μl。将加样后的扩增用毛细管转移到全自动荧光PCR检测仪LightCycler(Roche公司)上进行扩增检测，扩增程序为95℃10s→(95℃5s→60℃20s)×40循环→37℃5s，运行时间35min。结果分析选择F1通道。结果见图6，结果显示第一引物探针体系扩增CT值为26.50，第二引物探针体系扩增CT值为26.14。
实施例5：
试剂盒组成：
样本处理液：含Chelex 100(Sigma-Aldrich公司)和蛋白酶K(Sigma-Aldrich公司)的水溶液，其中Chelex 100的质量浓度为12％，蛋白酶K的浓度为0.06mg/ml。
PCR反应液I：含PCR缓冲液Premix Ex Taq(TaKaRa公司)、第一引物对和第一探针的水溶液，所述水溶液中，PCR缓冲液Premix Ex Taq的体积浓度为50％，第一引物对中正向引物和反向引物的浓度均为0.6nmol/ml，第一探针的浓度为0.3nmol/ml。
PCR反应液II：含PCR缓冲液Premix Ex Taq、第二引物对和第二探针的水溶液，所述水溶液中，PCR缓冲液Premix Ex Taq的体积浓度为50％，第二引物对中正向引物和反向引物的浓度均为0.6nmol/ml，第二探针的浓度为0.3nmol/ml。
所述第一引物对、第一探针、第二引物对、第二探针为实施例1设计和合成，样本处理液、PCR反应液I和PCR反应液II按上述组分及其含量用无菌水配制而成。
实时荧光PCR检测：
以正常男性EDTA抗凝血浆为样本，取血浆10μl与样品处理液10μl混匀，100℃孵育10min，14000rpm离心5min获处理样本上清液。将上述配方的18μl PCR反应液I和18μlPCR反应液II分别分配入扩增用毛细管，转入样本处理区，分别加入以上处理样本的上清液2μl。将加样后的扩增用毛细管转移到全自动荧光PCR检测仪LightCycler(Roche公司)上进行扩增检测，扩增程序为95℃10s→(95℃5s→60℃20s)×40循环→37℃5s，运行时间35min。结果分析选择F1通道。结果见图7，结果显示第一引物探针体系扩增CT值为29.05，第二引物探针体系扩增CT值为26.02。
实施例6：
试剂盒组成：
样本处理液：含Chelex 100(Sigma-Aldrich公司)和蛋白酶K(Sigma-Aldrich公司)的水溶液，其中Chelex 100的质量浓度为20％，蛋白酶K的浓度为0.1mg/ml。
PCR反应液I：含PCR缓冲液Premix Ex Taq(TaKaRa公司)、第一引物对和第一探针的水溶液，所述水溶液中，PCR缓冲液Premix Ex Taq的体积浓度为50％，第一引物对中正向引物和反向引物的浓度均为0.1nmol/ml，第一探针的浓度为0.1nmol/ml。
PCR反应液II：含PCR缓冲液Premix Ex Taq、第二引物对和第二探针的水溶液，所述水溶液中，PCR缓冲液Premix Ex Taq的体积浓度为50％，第二引物对中正向引物和反向引物的浓度均为0.1nmol/ml，第二探针的浓度为0.1nmol/ml。
所述第一引物对、第一探针、第二引物对、第二探针为实施例1设计和合成，样本处理液、PCR反应液I和PCR反应液II按上述组分及其含量用无菌水配制而成。
实时荧光PCR检测：
以正常男性EDTA抗凝血浆为样本，取血浆10μl与样品处理液10μl混匀，100℃孵育10min，14000rpm离心5min获处理样本上清液。将上述配方的18μl PCR反应液I和18μlPCR反应液II分别分配入扩增用毛细管，转入样本处理区，分别加入以上处理样本的上清液2μl。将加样后的扩增用毛细管转移到全自动荧光PCR检测仪LightCycler(Roche公司)上进行扩增检测，扩增程序为95℃10s→(95℃5s→60℃20s)×40循环→37℃5s，运行时间35min。结果分析选择F1通道。结果见图8，结果显示第一引物探针体系扩增CT值为＞35，第二引物探针体系扩增CT值为＞35。
实施例7：本发明所述方法与现有方法时效性比较
发明所述方法：(时间/单个标本)：从实施例4，5和6提取单个样本分析时间。
样本处理：时间15分钟；
反应体系配置和上样：5分钟；
扩增检测：35分钟；
结果分析：5分钟；
总时间：60分钟。
现有普通PCR方法：从实施2例提取单个样本分析时间
样本处理：外周血白细胞基因组核酸提取45～60分钟；
反应体系配置和上样：5分钟；
扩增：普通PCR扩增70分钟；
结果分析：电泳上样，电泳和凝胶成像约需45～55分钟；
总时间：165～190分钟。
序列表
<110>四川大学华西医院
<120>SRY特异性TaqMan探针引物对与实时荧光SRY基因检测试剂盒
<160>6
<170>PatenInVersion 3.2
<210>1
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>1
cctttgcact gaaagctgta actc 24
<210>2
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<400>2
gccatcttgc gcctctgat 19
<210>3
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>3
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<210>4
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<400>4
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<210>5
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>5
caatgttacc cgattgtcct acag 24
<210>6
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>6
FAM-agccagctca ccgcagcaac g-TAMRA 21
Claims (2)
1.性别决定基因SRY特异性TaqMan探针引物对，其特征在于由第一引物对、第一探针、第二引物对和第二探针组成；
所述第一引物对由正向引物和反向引物组成，第一引物对中的正向引物的核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO：1所示，第一引物对中的反向引物的核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO：2所示，第一探针的核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO：3所示；
所述第二引物对由正向引物和反向引物组成，第二引物对中的正向引物的核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO：4所示，第二引物对中的反向引物的核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO：5所示，第二探针的核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO：6所示。
2.一种实时荧光性别决定基因SRY基因检测试剂盒，其特征在于所述试剂盒包括样品处理液、PCR反应液I和PCR反应液II；
所述样品处理液为含Chelex 100和蛋白酶K的水溶液，所述水溶液中，Chelex 100的质量浓度为5％～20％，蛋白酶K的浓度为0.01～0.1mg/ml，
所述PCR反应液I为含PCR缓冲液Premix Ex Taq、权利要求1所述第一引物对和权利要求1所述第一探针的水溶液，所述水溶液中，PCR缓冲液Premix Ex Taq的体积浓度为50％，第一引物对中正向引物和反向引物的浓度均为0.1～0.8nmol/ml，第一探针的浓度为0.1～0.4nmol/ml，
所述PCR反应液II为含PCR缓冲液Premix Ex Taq、权利要求1所述第二引物对和权利要求1所述第二探针的水溶液，所述水溶液中，PCR缓冲液Premix Ex Taq的体积浓度为50％，第二引物对中正向引物和反向引物的浓度均为0.1～0.8nmol/ml，第二探针的浓度为0.1～0.4nmol/ml。
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| CN2010101082477A CN101792802B (zh) | 2010-02-10 | 2010-02-10 | SRY特异性TaqMan探针引物对与实时荧光SRY基因检测试剂盒 |
Applications Claiming Priority (1)
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