CN103642923A - 体外检测胎儿性别的方法、引物及探针、荧光pcr试剂盒 - Google Patents

体外检测胎儿性别的方法、引物及探针、荧光pcr试剂盒 Download PDF

Info

Publication number
CN103642923A
CN103642923A CN201310662440.9A CN201310662440A CN103642923A CN 103642923 A CN103642923 A CN 103642923A CN 201310662440 A CN201310662440 A CN 201310662440A CN 103642923 A CN103642923 A CN 103642923A
Authority
CN
China
Prior art keywords
primer
probe
sry
vitro
dna
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201310662440.9A
Other languages
English (en)
Inventor
叶盛
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Individual
Original Assignee
Individual
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Individual filed Critical Individual
Priority to CN201310662440.9A priority Critical patent/CN103642923A/zh
Publication of CN103642923A publication Critical patent/CN103642923A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种体外检测胎儿性别的方法，其步骤包括：（1）、母体血液样本离心，取血浆，提取血浆DNA；（2）、以提取的DNA为模板进行荧光定量PCR扩增反应，加入引物SRY-P1及探针SPY-PNA1；（3）检测扩增产物。本发明还公开了一种体外检测胎儿性别的引物及探针，以及一种体外检测胎儿性别的荧光PCR试剂盒。本发明提供了一种在早孕期即可体外检测胎儿性别的方法，根据只存在于男性体内的遗传信息基因SRY，设计了引物SRY-P1及探针SPY-PNA1，对母体血液样本进行荧光定量PCR扩增。本方法用于体外检测胎儿性别，对于怀孕6周的母体的检测准确率能达到100%。根据该方法设计的试剂盒使用方法简单，结果可靠性高。

Description

体外检测胎儿性别的方法、引物及探针、荧光PCR试剂盒
技术领域
本发明涉及一种用母体血液样本体外检测胎儿性别的方法、引物及探针、荧光PCR试剂盒。
背景技术
与性别相关的遗传疾病，一些可能只出现在男性中，而还有一些可能只出现在女性中。因此对于可能有这类遗传疾病史的家庭，早期鉴定胎儿性别将有利于优生优育计划。过去，胎儿性别鉴定经常使用介入性早孕期诊断方法，比如绒毛活检。由于采用怀孕组织直接取材，介入性早孕期诊断的准确率很高。但是，因为诊断过程需要用针头刺人子宫内取样，这种手术容易引起母体及胎儿的损伤，严重的会导致流产。
超声波诊断也可以用于胎儿性别鉴定， 但是它只能对妊娠中期的胎儿性别做出准确鉴定。在一些医院，超声波检查胎儿性别可以在妊娠13周左右进行，但多数医院会建议在妊娠15-16周时进行检查。而对于诊断与性别相关的遗传疾病，基因检测计划的制定需要在早孕期（6-12周）鉴定胎儿性别，因此，在这种情况下，超声波检测并不是一个很好的方法。
细胞游离DNA（ffDNA）是一种来自于胎儿的遗传信息材料，在妊娠期间，ffDNA可以在怀孕6周以上的母体血液中被检测到。有人针对只存在于男性体内的遗传信息基因SRY，设计SRY特有引物，采用PCR的方法来鉴定母体血液中是否存在SRY基因。但是由于母体血液中的ffDNA的含量极低，而母体背景DNA的含量非常高，采用普通的PCR扩增的方法，由于母体背景DNA的影响及DNA双链匹配的不完全严格性，导致试验结果的准确度偏低。
肽核酸(PNA)是具有类多肽骨架的DNA类似物，PNA的主链骨架是由N(2-氨基乙基)-甘氨酸与核酸碱基通过亚甲基羰基连接而成的。PNA可以特异性地与DNA或RNA杂交，形成稳定的复合体。PNA有3个特点：1、PNA与DNA的结合能力胜于DNA与DNA的结合能力；2、DNA/PNA双链比DNA/DNA双链的稳定性高；3、PNA只能与完全匹配的DNA或RNA结合。由于PNA不能作为PCR引物，因此， PNA-PCR主要用于点突变的基因检测，它能与未突变的基因完美结合，阻止引物与未突变的基因结合，与突变的基因则不能结合，而引物可与突变的基因结合，从而使突变基因扩增。
发明内容
本发明的目的是提供一种用母体血液样本体外检测胎儿性别的方法。
为达到上述目的，本发明采用的技术方案为：一种体外检测胎儿性别的方法，其步骤包括：
（1）、母体血液样本离心，取血浆，提取血浆DNA；
（2）、以提取的DNA为模板进行荧光定量PCR扩增反应，加入引物SRY-P1及探针SPY-PNA1，其中引物SRY-P1上游序列为：SRY-PF1 5’-CTGTAACTCTAAGTATCAGTGTG-3’（SEQ ID NO：1），引物SRY-P1下游序列：SRY-PR1 3’-AGCTGCTTGCTGATCTCTGAG-5’（SEQ ID NO：2），荧光探针SPY-PNA1的序列为：DABSYL-Lys-AAGCGACCCATGAA-Glu-FAM（SEQ ID NO：3）；
（3）检测扩增产物。
进一步的，所述母体血液样本取自妊娠6周后的母体。
本发明还提供了一种体外检测胎儿性别的引物及探针，所述引物为上述的引物SRY-P1，所述探针为上述的荧光探针SPY-PNA1。
本发明还提供了一种体外检测胎儿性别的荧光PCR试剂盒，包括上述的引物及探针。
本发明提供了一种在早孕期即可体外检测胎儿性别的方法，根据只存在于男性体内的遗传信息基因SRY，设计了引物SRY-P1及探针SPY-PNA1，对母体血液样本进行荧光定量PCR扩增。本发明在探针SPY-PNA1的谷氨酸端标记FAM荧光基团，在赖氨酸端标记DABSYL淬灭基团，由于PNA只能与完全匹配的DNA结合，如果母体血液中存在SRY基因，则经扩增后探针SPY-PNA1能结合上去，并显示出荧光，如果母体血液中不存在SPY基因，即使引物在错配后扩增，探针SPY-PNA1也无法与之结合，从而被淬灭，荧光显示不出来，而即使微量的存在荧光，现有的检测仪器也能检测出来，因此，本方法用于体外检测胎儿性别，对于怀孕6周的母体的检测准确率能达到100%。根据该方法设计的试剂盒使用方法简单，结果可靠性高。
附图说明
图1：样本PCR产物电泳图。其中泳道1. DNA ladder
泳道2. 空白对照
泳道3. 阳性对照（男性胎儿胎盘DNA）
泳道4. 样本1（女性1怀孕6周的血浆DNA）
泳道5. 样本2 （女性2怀孕6周的血浆DNA）
泳道6. 样本3（女性3怀孕6周的血浆DNA）
泳道7. 样本4（女性1怀孕12周的血浆DNA）
泳道8. 样本5 （女性2怀孕12周的血浆DNA）
泳道9. 样本6（女性3怀孕6周的血浆DNA）
泳道10. 阴性对照（未怀孕女性DNA）。
图2：样本荧光定量PCR检测结果图。
 
具体实施方式
下列实施例中未注明具体条件的实验方法及未说明配方的试剂均为按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：试验手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件或者制造商建议的条件进行或配置。
实施例一：
1、            样本处理：样本1-3为从6孕周的孕妇静脉抽取的血液，样本4-6为从12孕周的孕妇静脉抽取的血液。将样本1-6离心去除血细胞，取血浆，提取血浆DNA。
2、            引物、探针设计与合成：从GeneBank中调出SPY基因的DNA序列，然后通过DNAStar软件进行比较，在相对保守的区域设计引物序列及相应的PNA序列并进行合成。在PNA探针的谷氨酸端标记荧光基团FAM（发射波长：522nm），在赖氨酸端标记淬灭基团DABSYL 。
3、            PCR反应体系：
模板                      2 μl
PCR-MIX                   2.5 μl
Taq酶                  1μl
上游引物                  2 μl
下游引物                   2 μl
探针                       1μl
ddH2O                     14.5 μl
    总计                      25μl
PCR反应条件：95℃保温2分钟；93℃ 10秒和62℃ 50秒交替循环40次；单点荧光检测在62℃。结果见图1，其中空白对照采用ddH2O，阳性对照所用模板为男性胎儿胎盘DNA，样本1-3为女性1-3在6孕周的血液样本，样本4-6为女性1-3在12孕周的血液样本，阴性对照为未怀孕女性DNA。在图1中横线上的5个荧光检测结果分别对应阳性对照、样本2、3、5、6，对应图2中的泳道3、5、6、8、9。即PCR扩增SRY基因成功。
在图中横线下的4个荧光检测结果分别对应空白对照、阴性对照和样本1、4，对应图2中的泳道2、4、7、10。即PCR扩增未检测到SRY基因信号。
4、电泳：将荧光PCR产物电泳后观察结果，电泳图见图2。其中泳道1. DNA ladder；
泳道2. 空白对照；泳道3. 阳性对照（男性胎儿胎盘DNA）；泳道4. 样本1（女性1怀孕6周的血浆DNA）；泳道5. 样本2 （女性2怀孕6周的血浆DNA）；泳道6. 样本3（女性3怀孕6周的血浆DNA）；泳道7. 样本4（女性1怀孕12周的血浆DNA）；泳道8. 样本5 （女性2怀孕12周的血浆DNA）；泳道9. 样本6（女性3怀孕6周的血浆DNA）
泳道10. 阴性对照（未怀孕女性DNA）。可以看出，泳道3、5、6、8、9显示PCR扩增SRY基因成功，泳道2、4、7、10显示PCR扩增未检测到SRY基因信号。
后期证实女性2和3所怀有的为男婴，女性1的母体所怀有的为女婴。
 
<110>  
<120>  体外检测胎儿性别的方法、试剂盒及荧光PCR试剂盒
<130>
<160>  3 
<170>  PatentIn version 3.5
<210>  1
<211>  23
<212>  DNA
<213>  人工序列
<400>1
 ctgtaactct aagtatcagt gtg                                                                          23
<210>  2
<211>  21
<212>  DNA
<213>  人工序列
<400>  2
agctgcttgc tgatctctga g                                                                           21
<210>  3
<211>  14
<212>  DNA
<213>  人工序列
<400>  3
aagcgaccca tgaa                                                                                  14

Claims (4)

1.一种体外检测胎儿性别的方法，其步骤包括：
（1）、母体血液样本离心，取血浆，提取血浆DNA； 
（2）、以提取的DNA为模板进行荧光定量PCR扩增反应，加入引物SRY-P1及探针SPY-PNA1，其中引物SRY-P1上游序列为：SRY-PF1 5’-CTGTAACTCTAAGTATCAGTGTG-3’（SEQ ID NO：1），引物SRY-P1下游序列：SRY-PR1 3’-AGCTGCTTGCTGATCTCTGAG-5’（SEQ ID NO：2），荧光探针SPY-PNA1的序列为：DABSYL-Lys-AAGCGACCCATGAA-Glu-FAM（SEQ ID NO：3）；
（3）检测扩增产物。
2.根据权利要求1所述的体外检测胎儿性别的方法，其特征在于：所述母体血液样本取自妊娠6周后的母体。
3.一种体外检测胎儿性别的引物及探针，其特征在于：所述引物为权利要求1中所述的引物SRY-P1，所述探针为权利要求1中所述的荧光探针SPY-PNA1。
4.一种体外检测胎儿性别的荧光PCR试剂盒，包括权利要求3所述的引物及探针。
CN201310662440.9A 2013-12-10 2013-12-10 体外检测胎儿性别的方法、引物及探针、荧光pcr试剂盒 Pending CN103642923A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201310662440.9A CN103642923A (zh) 2013-12-10 2013-12-10 体外检测胎儿性别的方法、引物及探针、荧光pcr试剂盒

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201310662440.9A CN103642923A (zh) 2013-12-10 2013-12-10 体外检测胎儿性别的方法、引物及探针、荧光pcr试剂盒

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN103642923A true CN103642923A (zh) 2014-03-19

Family

ID=50248203

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201310662440.9A Pending CN103642923A (zh) 2013-12-10 2013-12-10 体外检测胎儿性别的方法、引物及探针、荧光pcr试剂盒

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN103642923A (zh)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107119110A (zh) * 2017-03-20 2017-09-01 谱天福信（天津）分子诊断技术有限公司 微量样本中人类基因组DNA SRY基因的TaqMan探针实时荧光PCR检测的引物
CN112176039A (zh) * 2020-08-28 2021-01-05 浙江原创医疗科技有限公司 提高基于pna的pcr抑制效率的方法及应用
CN112522377A (zh) * 2020-08-28 2021-03-19 浙江原创医疗科技有限公司 Pna在检测dna裂解片段中的应用

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101792802A (zh) * 2010-02-10 2010-08-04 四川大学华西医院 SRY特异性TaqMan探针引物对与实时荧光SRY基因检测试剂盒

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101792802A (zh) * 2010-02-10 2010-08-04 四川大学华西医院 SRY特异性TaqMan探针引物对与实时荧光SRY基因检测试剂盒

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
张胜利等: "母血浆中胎儿游离DNA检测及非侵入性产前诊断的研究进展", 《中国产前诊断杂志（电子版）》, 30 June 2013 (2013-06-30) *
李晓红等: "孕妇血浆胎儿DNA定量分析在产前性别诊断中的应用", 《中国全科医学》, 30 September 2003 (2003-09-30) *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107119110A (zh) * 2017-03-20 2017-09-01 谱天福信（天津）分子诊断技术有限公司 微量样本中人类基因组DNA SRY基因的TaqMan探针实时荧光PCR检测的引物
CN112176039A (zh) * 2020-08-28 2021-01-05 浙江原创医疗科技有限公司 提高基于pna的pcr抑制效率的方法及应用
CN112522377A (zh) * 2020-08-28 2021-03-19 浙江原创医疗科技有限公司 Pna在检测dna裂解片段中的应用

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN1219074C (zh) 非侵入的出生前监测
Stanghellini et al. Quantitation of fetal DNA in maternal serum during the first trimester of pregnancy by the use of a DAZ repetitive probe
Houfflin-Debarge et al. High sensitivity of fetal DNA in plasma compared to serum and nucleated cells using unnested PCR in maternal blood
US20080108071A1 (en) Methods and Systems to Determine Fetal Sex and Detect Fetal Abnormalities
CN101918589A (zh) 糖尿病的诊断生物标志物
CN103642923A (zh) 体外检测胎儿性别的方法、引物及探针、荧光pcr试剂盒
CN107385050A (zh) 用于检测胰腺癌的基因标志物、试剂盒及胰腺癌检测方法
Hochstenbach et al. Cell-free fetal DNA in the maternal circulation originates from the cytotrophoblast: proof from an unique case
EP4008793A1 (en) Analytical method and kit
Mayer et al. Early pregnancy diagnosis in dairy cows using circulating nucleic acids
George et al. The impact of chimerism in DNA-based forensic sex determination analysis
CN107043811A (zh) Cfap20基因在骨质疏松症诊断中的应用
Lildballe et al. Diagnostic performance of quantitative fluorescence PCR analysis in high-risk pregnancies after combined first-trimester screening
JP2008537676A (ja) 核酸の検出
Jacob et al. Noninvasive diagnosis of fetal gender: utility of combining DYS14 and SRY
KR101387582B1 (ko) 산모 혈액 내 세포 유리 태아 핵산 검출 방법
WO2015002845A1 (en) Biomarker for preeclampsia
Jauniaux et al. Very early prenatal diagnosis on coelomic cells using quantitative fluorescent polymerase chain reaction
Mouawia Genotyping analysis of circulating fetal cells reveals high frequency of vanishing twin following transfer of multiple embryos
CN104928394B (zh) 胎儿宫内生长受限诊治分子标志物
CN103642922A (zh) Pna检测母体血液中的循环胎儿dna的应用及方法
Eason Prenatal diagnosis of single gene disorders
CN106755426A (zh) Ifi27在制备诊断布加综合征产品中的用途
US20210214805A1 (en) Analytical method and kit
Nigam et al. Detection of fetal nucleic acid in maternal plasma: A novel noninvasive prenatal diagnostic technique

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C02 Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001)
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20140319