CN115282324B - 一种丝素蛋白水凝胶敷料及其制备方法和应用 - Google Patents
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-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
- A61L2300/00—Biologically active materials used in bandages, wound dressings, absorbent pads or medical devices
- A61L2300/40—Biologically active materials used in bandages, wound dressings, absorbent pads or medical devices characterised by a specific therapeutic activity or mode of action
- A61L2300/412—Tissue-regenerating or healing or proliferative agents
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
- C08J—WORKING-UP; GENERAL PROCESSES OF COMPOUNDING; AFTER-TREATMENT NOT COVERED BY SUBCLASSES C08B, C08C, C08F, C08G or C08H
- C08J2389/00—Characterised by the use of proteins; Derivatives thereof
Abstract
本发明提供了一种丝素蛋白水凝胶敷料及其制备方法和应用，本发明属于医用敷料技术领域。本发明提供了一种丝素蛋白水凝胶敷料的制备方法，包括如下步骤：(1)将丝素蛋白纤维用溶解液溶解，得到丝素蛋白原液；(2)所述丝素蛋白原液经透析后，得到丝素蛋白溶液；(3)所述丝素蛋白溶液经旋流剪切后，浸入载体，再经热处理进行原位凝胶化，得到丝素蛋白水凝胶敷料。本发明所制备的丝素蛋白凝胶敷料，不使用任何添加助剂，通过物理交联方法、剪切协同热效应，可在载体上进行原位可控凝胶化，应用于医药领域具有更高的安全性和可操作性。
Description
技术领域
本发明涉及医用敷料技术领域，尤其涉及一种丝素蛋白水凝胶敷料及其制备方法和应用。
背景技术
随着医学美容技术的发展，医疗项目(激光、光子嫩肤微晶磨削、果酸活肤术等)在皮肤美容及治疗学上的应用越来越广泛，许多难治损容性皮肤病得到了很好的治疗。但在治疗过程中，这些医疗设备作用于人体组织，皮肤时会因局部高热量而产生炎性红斑、水肿，甚至突发水疱等不良反应，常伴有红、肿、痒、痛及紧绷等皮肤症状。因此，术后对于皮肤进行科学的护理，促进受损皮肤结构修复，预防和减轻皮肤的炎症及过敏反应是十分必要的。
丝素蛋白分子链由于大量的链间氢键而得以稳定。可制备各种形状的丝素蛋白基材料，主要途径是通过将丝素蛋白溶解以获取大量丝素蛋白溶液。因此溶解用的试剂选择至关重要。通常获得丝素蛋白溶液的溶剂包括酸、碱、盐或者酶溶液，常用的溶解体系有40％氯化钙(CaCl2)溶液，9.3M的溴化锂(LiBr)溶液，摩尔比为1：2：8的氯化钙—乙醇—水(CaCl2—EtOH—H2O)的三元溶解体系。
目前大多仍采用溴化锂试剂溶解来获取丝素蛋白溶液，但由于溶解后的溶液中存在大量的溴离子和锂离子，此类丝素蛋白溶液不能直接用于制备许多医用生物材料中的丝素蛋白基材料，往往需要通过透析或凝胶过柱的方式来得到。尽管透析可除去大部分的溴离子和锂离子，但仍有少量的锂离子存在于丝素蛋白溶液中而使丝素蛋白溶液未达到相应使用指标。根据最新版ICH Q3D(元素杂质)指导原则，其中锂离子在不同给药途径中的允许吸收入量为550μg/day，因此对丝素蛋白溶液中离子的进一步去除至关重要。
目前医美领域应用的医用敷料有透明质酸和胶原蛋白两大类，丝素蛋白敷料有良好的生物相容性和生物可降解性。研究发现丝素蛋白敷料可以代替损伤表皮，模拟细胞外环境，保持生长因子的活性，加快创面愈合进程，且移去时不必担心对创面造成二次损伤；丝素蛋白敷料能够在创面形成一层保护膜可预防创面感染；丝素蛋白敷料能够在伤口部位诱导利于皮肤伤口修复的细胞群结构，抑制皮肤瘢痕的形成。目前市场暂无丝素蛋白医用敷料应用于医疗美容领域。中国发明专利CN113679883一种含丝素蛋白凝胶敷料的制备方法公布了一种丝素蛋白水凝胶敷料的制备方法，宣称应用于医用敷料领域，其中添加大量的化学成分，主要用于化妆品研制，该敷料产品安全性难以保证，该组成成分并不适合应用于医用敷料，按照医疗器械分类界定相关法规，该配方不作为医疗器械管理，不能宣称“医用”，可作为化妆品管理。中国发明专利CN 103536962 A一种难溶于水的丝素蛋白膜及其制备与应用将丝素蛋白溶液灌注在模具内，通过溶剂挥发干燥，溶质沉积于模具底部，形成难溶于水的膜。该膜应用于防粘连膜、护创膜或人工膜。上述两个专利均为膜结构，丝素蛋白水凝胶敷料与其制备工艺和应用场景均不相同。
中国发明CN 10686699 A公布了一种蚕丝丝素蛋白质凝胶的快速制备方法，采用在弱电场条件下使丝素蛋白分子间发生作用，快速形成凝胶。但在初期时形成的凝胶无明显的构象变化，其溶胶-凝胶转变是可逆的；中国发明CN 110064077 A公布了一种宫腔黏连治疗的丝素蛋白水凝胶，该制备方法通过加入泊洛沙姆化学交联剂来形成凝胶，但泊洛沙姆等物质的加入，其生物相容性有待确认。
因此需要一种在不引入其他物质的条件下，快速批量制备一种具有良好生物相容性的丝素蛋白水凝胶敷料及其制备方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种不添加任何化学试剂并具有良好生物相容性和原位凝胶性能的可以用作医用敷料的丝素蛋白水凝胶敷料及其制备方法。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种丝素蛋白水凝胶敷料的制备方法，包括如下步骤：
(1)将丝素蛋白纤维用溶解液溶解，得到丝素蛋白原液；
(2)所述丝素蛋白原液经透析后，得到丝素蛋白溶液；
(3)所述丝素蛋白溶液经旋流剪切后，浸入载体，再经热处理进行原位凝胶化，得到丝素蛋白水凝胶敷料。
优选的，所述溶解液为氯化钙/乙醇/水三元溶解体系和/或溴化锂溶液；
所述氯化钙/乙醇/水三元溶解体系中氯化钙的质量分数为20～50％，乙醇的质量分数为10～40％和余量的水；
所述溴化锂溶液的浓度为8～10M；
所述丝素蛋白纤维与溶解液的质量体积比为1g∶4～10ml。
优选的，所述溶解的温度为50～100℃，所述溶解的时间为1～10h。
优选的，所述透析用透析袋的截留分子量为8000Da～100KDa，所述透析的次数为10～14次，每次透析的时间为3～5h；
在所述透析的第1～3次透析液中调节透析液的pH值为3～9；
所述调节pH用的酸碱调节剂为硫酸、盐酸、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾和碳酸中的一种或几种。
优选的，所述丝素蛋白溶液中离子残留浓度为5～90mg/L，所述丝素蛋白溶液的质量浓度为0.1～15％。
优选的，所述载体为蚕丝纤维、壳聚糖纤维、天然纤维素纤维、海藻纤维和铜氨纤维、铝箔、玻璃中的一种或多种；
所述丝素蛋白溶液与载体混合比例为1mL∶8～12cm2。
优选的，所述旋流剪切的转速为100～8000rpm/min，所述旋流剪切的时间为10s～12h。
优选的，所述热处理的温度为40～90℃，所述热处理的时间为1～24h。
本发明还一种所述的制备方法得到的丝素蛋白水凝胶敷料。
本发明还提供了一种所述的丝素蛋白水凝胶敷料制备修复皮肤损伤的医用敷料中的应用。
本发明所制备的丝素蛋白凝胶，不使用任何添加助剂，通过物理交联方法、剪切协同热效应，可在载体上进行原位可控凝胶化，应用于医药领域具有更高的安全性和可操作性。
本发明提供的丝素蛋白水凝胶敷料，不含任何防腐剂及添加剂，其由0.1％～15％的丝素蛋白和85％～99.9％水组成。本发明在不添加任何添加剂的情况下，丝素蛋白溶液通过自组装在载体表面原位凝胶化，进而形成凝胶辅料。该凝胶敷料通过丝素蛋白分子中的亲水基团，锁住水分子，具有良好的保水性和液体亲和性，同时遇到创面，当创面水含量较低时，会释放其中的水分，向创面排出，提供湿性愈合微环境，由于丝素蛋白水凝胶敷料在凝胶过程中形成了β-折叠结构，因此，随着水分的排出，丝素蛋白凝胶结构更加紧凑，分子间距离缩小，最终在创面处形成β-折叠化的丝素蛋白保护膜，形成皮肤屏障(示意图如图8所示)。同时，本发明中还得到了一种简易的去除丝素蛋白溶液中锂离子、溴离子等残留离子的方法。
附图说明
图1为实施例5制备的丝素蛋白水凝胶敷料的红外光谱图；
图2为实施例5制备的丝素蛋白水凝胶敷料的XRD图；
图3为对比例1中对照样品和实施例3制备的丝素蛋白水凝胶的凝胶情况；
图4为实验例1中实施例5制备的丝素蛋白水凝胶敷料的动物创面愈合情况；
图5为实验例1中实施例5制备的丝素蛋白水凝胶敷料的动物实验创面愈合率统计结果；
图6为实验例1中实施例5制备的丝素蛋白水凝胶敷料的动物实验HE染色结果；
图7为本发明提供的丝素蛋白水凝胶敷料使用示意图；
图8为本发明提供的丝素蛋白水凝胶敷料形成β-折叠化的丝素蛋白保护膜的示意图。
具体实施方式
本发明提供了一种丝素蛋白水凝胶敷料的制备方法，包括如下步骤：
(1)将丝素蛋白纤维用溶解液溶解，得到丝素蛋白原液；
(2)所述丝素蛋白原液经透析后，得到丝素蛋白溶液；
(3)所述丝素蛋白溶液经旋流剪切后，浸入载体，再经热处理进行原位凝胶化，得到丝素蛋白水凝胶敷料。
在本发明中，所述丝素蛋白纤维通过将蚕丝投入到碳酸钠溶液中脱胶得到。
在本发明中，所述碳酸钠溶液的浓度优选为0.02～0.05M，进一步优选为0.03～0.04M，再进一步优选为0.035M。
在本发明中，所述蚕丝与碳酸钠溶液的质量体积比优选为1g：80～120ml，进一步优选为1g：100ml。
在本发明中，所述脱胶的温度优选为90～98℃，进一步优选为93～96℃，再进一步优选为95℃。
在本发明中，所述脱胶的时间优选为20～100min，进一步优选为40～80min，再进一步优选为60min。
在本发明中，所述脱胶后，优选用清水清洗蚕丝蛋白纤维2～4次，进一步优选为3次。以去除残留的碳酸钠。每次清洗的用水体积与碳酸钠溶液的体积相同。
在本发明中，将清洗后的丝素蛋白纤维烘干，即可用于本发明。
在本发明中，所述烘干的温度优选为50～70℃，进一步优选为60℃。
在本发明中，所述烘干的时间优选为13～17h，进一步优选为15h。
将上述步骤烘干后的丝素蛋白纤维用溶解液溶解，得到丝素蛋白原液。
在本发明中，所述溶解液优选为氯化钙/乙醇/水三元溶解体系和/或溴化锂溶液，进一步优选为溴化锂溶液。
在本发明中，所述氯化钙/乙醇/水三元溶解体系中氯化钙的质量分数优选为20～50％，进一步优选为30％，乙醇的质量分数优选为10～40％，进一步优选为20％和余量的水。
在本发明中，所述溴化锂溶液的浓度优选为8～10M，进一步优选为9M。
在本发明中，所述丝素蛋白纤维与溶解液的质量体积比优选为1g：4～10ml，进一步优选为1g：5ml。
本发明将所述丝素蛋白原液经透析后，得到丝素蛋白溶液。
在本发明中，所述透析用头透析袋的截留分子量优选为8000Da～100KDa，进一步优选为50KDa。
在本发明中，所述透析的次数优选为10～14次，进一步优选为12次。
在本发明中，每次透析的时间优选为3～5h，进一步优选为4h。
在本发明中，优选调节第1～3次透析液的pH值，进一步优选调节第2次透析液的pH值。
在本发明中，所述pH值优选调节为3～9，进一步优选调节为6。
在本发明中，调节pH用的酸碱调节剂优选为硫酸、盐酸、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾和碳酸中的一种或几种，进一步优选为硫酸、盐酸和碳酸中的一种。
经过以上透析处理可以除去溶液中95％以上的溴离子、锂离子。尤其是在第1～3次透析液中调解pH值后，通过离子交换作用可以进一步除去溴离子、锂离子，而由于调解pH所加入的酸碱调节剂离子，可以在后续多次的透析步骤中去除。最终所得丝素蛋白溶液中离子残留浓度可以控制到5～90mg/L，得到离子残留可接受的丝素蛋白溶液。
制备得到丝素蛋白溶液后，在所述丝素蛋白溶液经旋流剪切后，浸入载体，再经热处理，进行原位凝胶化，得到丝素蛋白水凝胶敷料。
在本发明中，所述丝素蛋白溶液的质量浓度优选为0.1～15％，进一步优选为1～10％，再进一步优选为5％。
在本发明中，所述载体优选为蚕丝纤维、壳聚糖纤维、天然纤维素纤维、海藻纤维和铜氨纤维、铝箔、玻璃中的一种或多种，进一步优选为蚕丝纤维、海藻纤维、天然纤维素纤维和铜氨纤维中的一种。
在本发明中，所述丝素蛋白溶液与载体的混合比例优选为1ml：8～12cm2；进一步优选为1ml：10cm2。
在本发明中，
所述旋流剪切的转速优选为100～8000rpm/min，进一步优选为100～4000rpm/min，再进一步优选为200～2000rpm/min。
在本发明中，所述旋流剪切的时间优选为10s～12h，进一步优选为10min～1.5h，再进一步优选为20min～1.5h，再进一步优选为1h。
在本发明中，所述热处理的温度优选为40～90℃，进一步优选为50℃。
所述热处理的时间优选为1～24h，进一步优选为5～18h，再进一步优选为12h。
在本发明中，所述热处理的方式优选为超声热处理、热传导处理、红外线热处理中的一种；所述热传导处理为热风加热或水浴加热。
在本发明中，制备得到丝素蛋白水凝胶敷料后还进行无菌处理。
在本发明中，所述无菌处理的方法优选为γ射线辐射灭菌、干热灭菌(125～180℃)、电子束灭菌或X射线灭菌。
本发明还提供了一种按照上述制备方法得到的丝素蛋白水凝胶敷料。
本发明还提供了一种所述丝素蛋白水凝胶敷料在制备修复皮肤损伤的医用敷料中的应用。
所述皮肤损伤优选为烧烫伤创面、供皮区创面、糖尿病溃疡伤口、压疮、静脉性溃疡、创伤和术后慢性感染伤口。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
将蚕丝投递到0.02M碳酸钠溶液中，其中蚕丝与碳酸钠溶液的质量体积比为1g∶100ml，进行脱胶，脱胶温度为95℃，脱胶时间为100分钟，脱胶后用纯化水清洗3次去除残留的碳酸钠，每次所需水的体积与使用的碳酸钠溶液的体积等同，然后置于60℃烘干15h后，得到丝素蛋白纤维，备用。
将上述丝素蛋白纤维溶解于9.3M溴化锂溶液，丝素蛋白纤维与溴化锂溶液的质量体积比为1g∶5ml，65℃溶解2h后，得到浓度的丝素蛋白原液。将该丝素蛋白原液装入截留分子量为8000～14000Da的透析袋中，进行透析，总透析次数为12次，每次透析的时间为4h，在第1～3次透析液中均加入盐酸调整透析液的pH为6。以置换溶液中的溴离子和锂离子，从而更彻底的清除。透析完毕后，检测溶液中的残留溴离子浓度低于设备检测限(检测限2μg/ml)，锂离子浓度在22.63μg/ml。因此，经过透析后得到了离子残留可接受的丝素蛋白溶液。
将透析后的丝素蛋白溶液中加入纯化水进行稀释，调整丝素蛋白溶液的浓度为1.5％，进行旋流剪切，转速为1500rpm/min，时间20min，浸入天然纤维素纤维膜布(丝素蛋白溶液与膜布比为1ml∶10cm2)；然后采用热风加热方式进行热处理，控制热处理的温度为70℃，时间为8h。在旋流剪切和热处理的作用下，丝素蛋白溶液会在膜布表面进行原位凝胶化。对原位凝胶化的水凝胶敷料进行γ射线辐射灭菌处理，辐照剂量20kGy，即得到丝素蛋白水凝胶敷料。
实施例2
将蚕丝投递到0.03M碳酸钠溶液中，其中蚕丝与碳酸钠溶液的质量体积比为1g∶100ml，进行脱胶，脱胶温度为98℃，脱胶时间为90分钟，脱胶后用纯化水清洗3次去除残留的碳酸钠，每次清洗所用纯水的体积与碳酸钠溶液的体积等同，然后置于60℃烘干15h后，得到丝素蛋白纤维，备用。
将上述丝素蛋白纤维溶解于氯化钙/乙醇/水溶液(氯化钙质量分数为30％，乙醇质量分数为20％，余量的水)中，丝素蛋白纤维与氯化钙/乙醇/水溶液的质量体积比为1g∶10ml，90℃溶解1h后，得到浓度为的丝素蛋白原液。将该丝素蛋白原液装入截留分子量为50KDa的透析袋中进行透析，透析次数12次，每次透析时间为4小时，在第1～3次透析液中均用盐酸和磷酸氢二钾调整溶液的pH为7。能够除去溶液中95％的钙离子、氯离子和乙醇，这是因为丝素蛋白带有负电荷，在有其他离子的情况下更易吸附阳离子，因此，在第1～3次透析液中加入盐酸和磷酸氢二钾，调节透析液pH为7后，能够置换溶液中的离子，使残留离子更彻底的被清除。经检测透析后的溶液中钙离子残留量为22.14μg/ml，氯离子残留量为41.18μg/ml。从而得到离子残留量可接受的丝素蛋白溶液。
将透析后的丝素蛋白溶液中加入纯化水进行稀释，稀释后的丝素蛋白溶液的浓度为2％，进行旋流剪切，其中旋流剪切的转速为4000rpm/min，时间为10min；在2％的丝素蛋白溶液中浸入海藻纤维膜布(丝素蛋白溶液与膜布比为1ml∶10cm2)；然后采用水浴加热方式进行热处理，控制热处理的温度为55℃，时间为12h。。在旋流剪切和热处理的作用下，丝素蛋白溶液会在膜布表面进行原位凝胶化。对原位凝胶化的水凝胶敷料进行电子束灭菌处理，辐射剂量18kGy，即得到丝素蛋白水凝胶敷料。
实施例3
将蚕丝投递到0.04M碳酸钠溶液中，其中蚕丝与碳酸钠溶液的质量体积比为1g∶100ml，进行脱胶，脱胶温度为90℃，脱胶时间为80分钟，脱胶后用纯化水清洗3次去除残留的碳酸钠，每次清洗所需水的体积与碳酸钠溶液的体积等同，清洗后置于60℃烘干15h，得到丝素蛋白纤维，备用。
将上述丝素蛋白纤维溶解于9.3M溴化锂溶液中，丝素蛋白纤维与溴化锂溶液的质量体积比为1g∶4.5ml，65℃溶解2.5h后，得到浓度为的丝素蛋白原液；将该丝素蛋白原液装入截留分子量为8000～14000Da的透析袋中进行透析，透析次数12次，每次透析时间为4小时，在第1～3次透析液中均用碳酸调整溶液的pH为5。透析后溴离子残留量低于设备检测限(检测限2μg/ml)，锂离子残留量为14.42μg/ml。从而得到离子残留量可接受的丝素蛋白溶液。
将透析后的丝素蛋白溶液中加入纯化水进行稀释，调整丝素蛋白溶液的浓度为1％，进行旋流剪切，转速为2000rpm/min，时间20min；浸入天然纤维素纤维膜布(丝素蛋白溶液与膜布比为1ml∶10cm2)；然后采用水浴加热方式进行热处理，控制热处理的温度为40时间为18h。在旋流剪切和热处理的作用下，丝素蛋白溶液会在膜布表面进行原位凝胶化。对原位凝胶化的水凝胶敷料进行X射线灭菌处理，辐射剂量16kGy，即得到丝素蛋白水凝胶敷料。
实施例4
将蚕丝投递到0.04M碳酸钠溶液中，其中蚕丝与碳酸钠溶液的质量体积比为1g∶100ml，进行脱胶，脱胶温度为90℃，脱胶时间为60分钟，脱胶后用纯化水清洗3次去除残留的碳酸钠，每次清洗所用纯水的体积与碳酸钠溶液的体积等同，然后置于60℃烘干15h后，得到丝素蛋白纤维，备用。
将上述丝素蛋白纤维溶解于氯化钙/乙醇/水溶液(氯化钙质量分数为40％，乙醇质量分数为30％，余量的水)中，丝素蛋白纤维与氯化钙/乙醇/水溶液的质量体积比为1g∶10ml，60℃溶解2h后，得到浓度为的丝素蛋白原液。将该丝素蛋白原液装入截留分子量为100KDa的透析袋中进行透析，透析次数12次，每次透析时间为4小时，在第1～3次透析液中均用硫酸调整溶液的pH为5.5。以置换溶液中的离子，使残留离子更彻底的被清除。经检测透析后的溶液中钙离子残留量为22.53μg/ml，氯离子残留量为41.98μg/ml。从而得到离子残留量可接受的丝素蛋白溶液。
将透析后的丝素蛋白溶液进行稀释，稀释后的丝素蛋白溶液的浓度为5％，进行旋流剪切，旋流剪切的转速为500rpm/min，时间为1.5h；将5％的丝素蛋白溶液中浸入铜氨纤维膜布(丝素蛋白溶液与膜布比为1ml∶10cm2)；然后采用热风加热方式进行热处理，控制热处理的温度为90℃，时间为2h。在旋流剪切和热处理的作用下，丝素蛋白溶液会在膜布表面进行原位凝胶化。对原位凝胶化的水凝胶敷料进行γ射线辐射灭菌处理，辐射剂量22kGy，即得到丝素蛋白水凝胶敷料。
实施例5
将蚕丝投递到0.05M碳酸钠溶液中，其中蚕丝与碳酸钠溶液的质量体积比为1g∶100ml，进行脱胶，脱胶温度为95℃，脱胶时间为30分钟，脱胶后用纯化水清洗3次去除残留的碳酸钠，每次清洗所需水的体积与碳酸钠溶液的体积等同，清洗后置于60℃烘干15h，得到丝素蛋白纤维，备用。
将上述丝素蛋白纤维溶解于9.0M溴化锂溶液中，丝素蛋白纤维与溴化锂溶液的质量体积比为1g∶4.8ml，50℃溶解4h后，得到浓度为的丝素蛋白原液；将该丝素蛋白原液装入截留分子量为8000～14000Da的透析袋中进行透析，透析次数12次，每次透析时间为4小时，在第1～3次透析液中均用盐酸调整溶液的pH为5.8。透析后溴离子残留量低于设备检测限(检测限2μg/ml)，锂离子残留量为21.64μg/ml。从而得到离子残留量可接受的丝素蛋白溶液。
将透析后的丝素蛋白溶液进行稀释，调整丝素蛋白溶液的浓度为2％，以1500rpm/min转速进行旋流剪切，时间1.0h；浸入天然纤维素纤维膜布(丝素蛋白溶液与膜布比为1ml∶10cm2)；采用热风加热方式进行热处理，控制热处理的温度为55℃时间为16h。在旋流剪切和热处理的共同作用下，丝素蛋白溶液会在膜布表面进行原位凝胶化。对原位凝胶化的水凝胶敷料进行电子束灭菌处理，辐射剂量25kGy，即得到丝素蛋白水凝胶敷料。
对丝素蛋白溶液和实施例5制备的的原位凝胶化的丝素蛋白水凝胶敷料的β折叠结构进行检测，结果如图1、2所示。图1表明，丝素蛋白溶液酰胺Ⅰ在1637cm-1处，丝素蛋白水凝胶敷料酰胺Ⅰ在1618cm-1处，峰发生偏移，这是蛋白的二级结构从无规则卷曲向β-折叠结构转变的表现。图2表明，丝素蛋白水凝胶敷料位于20.5°处具有β-折叠结构。
对比例1
配置20g/L丝素蛋白溶液进行搅拌加热处理，其中搅拌的转速为1000转，时间为120min，加热温度为50℃。制备得到了一种丝素蛋白水凝胶。如图3(左图)所示。右图为本发明实施例3制备的丝素蛋白水凝胶辅料。实际上本对比例来自发明专利CN201610502786.6，与其技术方案不同的是没有加入额外的表面活性剂成分。从图3的对比结果可知，对比例1制备的水凝胶有絮状物析出，呈流动性液体，未成凝胶。但实施例3制备的水凝胶敷料已经凝胶化。这表明对比例1不使用额外的表面活性剂不能有效凝胶化，而本发明可以在不引入其他物质的情况下，通过物理方法能够快速批量制备具有良好生物相容性的丝素蛋白水凝胶敷料。
实验例1
以实施例5制备的丝素蛋白水凝胶敷料为例进行皮肤创面的动物试验。
采用激光照射大鼠背部皮肤30min造模，每个激光点直径6mm，每只大鼠6个激光点。将12只大鼠随机分为2组，分别为实验组6只，对照组6只。
对实验组大鼠进行术后皮肤损伤护理。将实施例5制备的水凝胶敷料剪切为直径8mm圆形，贴敷在创面每个创面处。术后第一周，每天使用1次，每日两次，每次敷20分钟；术后第二周隔天使用1次，每日两次，每次敷20分钟。对照组贴敷胶原敷料(Ⅰ型胶原)，治疗方法同实验组。于治疗第4、7、9、14天对典型创面拍照，如图4所示，并对所有大鼠创面面积进行测量，按照下述公式计算创面愈合率。结果如图5所示。
从图4中可以看出，实验组的第7天创面愈合情况明显好于对照组。结合图5统计的创面愈合率可以看出，实验组治疗第7天的创面愈合率显著高于对照组，能够达到60％，而对照组仅有25％。由于实验进行到第14天时，实验组和对照组的小鼠创面已基本愈合，因此比较治疗第7天的情况是更有意义的。从前7天的治疗趋势中可以看出，实验组的治疗效率是更高的。需要注意的是，从图4看实验组的愈合情况要好于对照组，从图5看对照组的愈合率高于实验组，这一点并不矛盾，图5为多组数据的统计结果，且图5中第14天两组创面愈合率无显著性差异。
本实验例还于治疗第4、7、14天取大鼠创面切片样本进行HE染色，结果如图6所示。从图6中可以看出第4天，各组成纤维细胞数量、真皮层厚度，明显增加；第7天，实验组的创伤表面的坏死组织脱落，表皮角质形成细胞增生并向创口中央迁移，表皮增厚，但尚未完全覆盖创口；第14天，HE染色显示各组创面基本愈合，表皮层较完整，其中实验组毛囊已生出毛发，皮肤结果趋势于正常。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (2)
1.一种丝素蛋白水凝胶敷料的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）将丝素蛋白纤维用溶解液溶解，得到丝素蛋白原液；
所述丝素蛋白纤维与溶解液的质量体积比为1g：4~10ml；所述溶解液为氯化钙/乙醇/水三元溶解体系或溴化锂溶液；所述氯化钙/乙醇/水三元溶解体系中氯化钙的质量分数为20~50%，乙醇的质量分数为10~40%和余量的水；所述溴化锂溶液的浓度为8~10M；所述溶解的温度为50~100℃，所述溶解的时间为1~10h；
（2）所述丝素蛋白原液经透析后，得到丝素蛋白溶液；
所述透析用透析袋的截留分子量为8000Da~100KDa；所述透析的次数为10~14次，每次透析的时间为3~5h；在所述透析的第1~3次透析液中调节透析液的pH值为5~7；
所述丝素蛋白溶液的质量浓度为0.1~15%；
（3）所述丝素蛋白溶液经旋流剪切后，浸入载体，再经热处理进行原位凝胶化，得到丝素蛋白水凝胶敷料；
所述旋流剪切的转速为500~4000rpm/min，所述旋流剪切的时间为10min~1.5h；
所述载体为蚕丝纤维、天然纤维素纤维、海藻纤维、铜氨纤维中的一种或多种；所述丝素蛋白溶液与载体混合比例为1mL：8~12cm2；
所述热处理的温度为40~90℃，所述热处理的时间为1~24h。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述调节pH用的酸碱调节剂为硫酸、盐酸、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾和碳酸中的一种或几种。
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