CN102743796A - 用聚乙烯醇制成的丝素蛋白多孔支架及其制备方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种用聚乙烯醇制成的丝素蛋白多孔海绵状支架及其制备方法和用途，所述支架由以下重量百分含量的丝素蛋白纤维60～80％和聚乙烯醇颗粒20～40％制成，所述支架上设有均匀分布的微孔，所述支架的孔隙率为85～95%；所述制备方法为：1）从蚕丝中提取丝素蛋白形成丝素蛋白水溶液；2）将聚乙烯醇溶液与丝素蛋白溶液混合；3）将丝素蛋白和聚乙烯醇共混液移入透析袋，置于聚乙二醇溶液中透析浓缩；4）将浓缩后的共混物置于塑料模具中，冷冻干燥；5）将干燥后的共混物放入水中漂洗，除去聚乙烯醇，形成海绵状丝素蛋白多孔材料；6）将制成的多孔支架材料在室温下干燥即得；所述支架用于组织工程、软组织修复或药物缓释。

Description

用聚乙烯醇制成的丝素蛋白多孔支架及其制备方法和用途

技术领域

本发明涉及一种聚乙烯醇制备的丝素蛋白多孔支架及其制备方法和用途，属于生物材料技术领域。 

背景技术

丝素蛋白是家蚕体内产生的高分子量（约400KDa）的天然有机分子，其含量占蚕丝的70%～80%，含有18种氨基酸，其中的11种为人体必需氨基酸;另一方面，丝素蛋白对人体无毒害作用，安全可靠，具有良好的生物相容性，适于开发成功能性材料。因此，随着对其独特氨基酸组成及结晶结构等理化特性研究的深入，国内外对丝素的应用正从传统的纺织领域积极向多领域探索，丝素蛋白在生物医学材料领域的应用也日趋广泛和深入。 

丝素蛋白在不需要添加辅助剂及有机溶剂的情况下能够制成多种形态的生物材料，如多孔海绵状支架、薄膜、凝胶、微米及纳米颗粒等。相比于胶原蛋白（天然材料）及聚酯共聚物（合成材料）等传统的生物材料，丝素蛋白具有独特的亲疏水间隔区域的分子结构，因而可以在酸碱度，离子强度，加热，剪切力等外界条件的作用下发生分子结构（无规卷曲到β-折叠）的改变。形成的β-折叠结构可以达到整个蛋白分子二级结构的50%以上。β-折叠化的丝素蛋白分子通过β-折叠结构之间极强的作用力（氢键，疏水作用力）而自发地组装成高密度的结晶区，从而形成不溶于水的高机械强度的多聚物材料。由丝素蛋白制成的生物材料具有机械强度高、生物相容性好以及免疫原性和炎症反应低、安全可靠等优点。在体内，丝素蛋白材料通过蛋白酶的作用降解为多肽和氨基酸， 降解产物安全无毒，并且降解的速率可以通过控制丝素蛋白材料中结晶区（β-折叠结构）的含量进行调节。因此，丝素蛋白材料是一种理想的生物医用材料，不仅适合于制造可植入体内的各种医疗用具和制品，在酶固定化、生物传感器、药物缓释等其他医药工业领域也具有极大的应用潜力 。 

丝素蛋白生物材料，尤其是多孔性的丝素蛋白海绵作为软组织缺损的修复材料已经在世界范围内被广泛的研究。人体内的软组织，如肌肉，乳房等的再生和功能重建通常需要6个月以上的时间并需要多种细胞和生长因子的协同作用，而现今通常使用的生物材料如胶原蛋白，透明质酸，聚乳酸等在体内的降解速度过快，对组织再生所需的细胞的生长分化很难起到长期稳定的支持作用。如果将缓慢降解（几个月以上）的丝素蛋白海绵支架作为修复材料植入体内缺损（创伤）的部位，由于在较长的时间内支架的完整性和机械性能得以保持，因而周围的细胞（包括干细胞）及细胞生长因子得以通过支架的孔隙进入并附着在支架壁上，进而增殖并分化为成熟细胞， 分泌各种胞外物质，最终形成所需的组织结构，完成修复的过程。此外，如果将病人自体的干细胞预先在体外增殖并接种于丝素蛋白支架材料中，然后再将材料移植入病人体内将可以使这一修复过程更为快速有效，形成的组织将更为完整自然。 

目前丝素蛋白支架的制备主要为以下几种方法，有机溶剂法，该方法制备过程中使用高浓度的丝素蛋白溶液，因而制成的多孔材料机械强度高，降解缓慢（一年以上），适合于骨，软骨，肌肉等大多数组织的修复。然而，多孔材料中残留的有机溶剂有可能导致细胞毒性，产生炎症反应，进而影响组织修复的过程。完全去除残留的有机溶剂则需要优化的制备工艺及额外的设备和费用。此外，在制备过程中向材料中加入的生物活性分子，如细胞生长因子会受到有机溶剂的影响而失活，进而限制了功能性多孔支架材料的制备和使用。 

盐析法，该方法制备过程中不使用有机溶剂，避免了组织修复过程中产生炎症反应等毒副作用，而且简化了多孔材料的制备工艺，降低了产品的成本。然而，由于制备过程需使用较低浓度的丝素蛋白溶液，因而制成的丝素蛋白多孔支架材料机械强度较差，降解速度较快（半年至一年），适用于那些对材料的机械强度要求较低且组织生长较快的组织修复领域，如皮肤的修复。此外，与有机溶剂法相似，制备过程中加入的功能性生物活性分子有可能会受到周围高浓度的盐溶液的影响而失活。 

冷冻干燥法，其制备过程简单，成本低，不含有毒有机溶剂。材料中添加的生物活性分子易保持活性。然而，由于制备过程中使用低比例且小分子的化合物（醇）与低浓度的丝素蛋白溶液共混，因而很难有效地控制支架材料的孔隙率和孔径度。平均的孔径大小通常低于200微米，不利于周围的组织细胞进入支架并生长分化。此外，与盐析法相似，制备的多孔支架材料机械性能较差，降解较快。 

并且目前的丝素蛋白在用于组织工程和组织修复时存在材料表面疏水性过高，因而限制了周围组织细胞的快速吸附及生长分化的缺陷。同样的原因使得其在药物缓释剂方面的应用存在对某些药物分子，尤其是含大量疏水基团的分子具有非特异性不可逆吸附，因而影响了药物的持续释放的缺陷。 向丝素蛋白材料中混入某些亲水性的聚合物从而改变材料的性状是解决这些问题的最为简单和有效的方法。 

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供一种有机溶剂含量低、生物亲和性强，机械性能强，降解慢，制备过程简单的用聚乙烯醇制成的丝素蛋白多孔支架及其制备方法和用途，以使其作为生物材料，更好地应用于组织工程中。 

本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一种用聚乙烯醇制成的丝素蛋白多孔海绵状支架，由以下重量百分含量的丝素蛋白纤维60～80％和聚乙烯醇颗粒20～40％共混物制成，所述支架上设有均匀分布的微孔，所述微孔的孔径为100～500微米，所述支架的孔隙率为85～95％，所述孔隙率为多孔支架材料中所有孔隙的体积占材料总体积的百分比。 

本发明的用聚乙烯醇制成的丝素蛋白多孔海绵状支架有益效果是：本发明的支架材料的机械性能和降解速率更为优良，同时具备降解缓慢，质地柔软弹性的特点，由于制备中使用大分子量的聚乙烯醇作为分离相并且经过浓缩的过程使聚乙烯醇相形成固态的均一的致孔剂，从而使制成的支架材料具有更好的多孔性，支架材料中残留的少量聚乙烯醇能够改变材料表面的疏水性，有利于细胞的生长和组织的修复。 

在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。 

本发明解决上述技术问题的又一技术方案如下：一种用聚乙烯醇制成的丝素蛋白多孔海绵状支架的制备方法，包括以下步骤： 

1）将从蚕丝中提取的丝素蛋白制成重量体积百分比为5～8％的丝素蛋白水溶液;

2）将聚乙烯醇溶液与丝素蛋白溶液以1:5～1:2的重量比混合，得到共混液，所述聚乙烯醇溶液由分子量为30000～186000道尔顿的聚乙烯醇溶于水制得；

    3）将共混液移入透析袋，置于重量体积比为10～20％的聚乙二醇溶液中透析浓缩12～24小时，制得浓缩共混液，所述共混液与聚乙烯醇溶液的体积比为1：10～1：100倍;

4）将浓缩后的共混液置于模具中，冷冻干燥24～72小时，得到共混物；

5）将共混物放入水中漂洗，除去聚乙烯醇，形成海绵状丝素蛋白多孔材料;

6）将制成的多孔支架材料在室温下干燥24～48小时，即得。

本发明的用聚乙烯醇制成的丝素蛋白多孔海绵状支架有益效果是：与有机溶剂制备法相比， 本发明（一）不需要任何有毒的有机溶剂，制备过程中唯一使用的化合物聚乙烯醇已被作为药物载体或医疗器械的组成成分广泛用于医学临床，因而整个制备过程安全无毒，易于大规模生产和应用；（二）在有机溶剂制备法中，丝素蛋白的浓缩和诱导产生β－折叠结构分为两个步骤，需要使用不同的试剂。本发明采用一步法处理，并采用高分子量的聚乙烯醇在诱导丝素蛋白形成β-折叠结构的同时在材料中形成大小均一适合的孔洞，因而大大简化了生产的过程，降低了成本；（三）由于制备过程简单，条件温和，制备过程中添加的生物活性分子被有效地包裹在丝素蛋白相中，不宜失活；与盐析（添加盐颗粒）方法制备法相比， 本发明（一）更易于操作，由于丝素蛋白溶液在与盐颗粒接触的瞬间即变性形成凝胶，因而很难将盐颗粒均匀地加入到丝素蛋白溶液中，尤其是大体积的溶液。本发明完全克服了这个问题，制备过程不受体积的限制，因而更加适合大规模标准化的生产；二）由于在制备过程中对丝素蛋白进行浓缩，因而制成的多孔海绵状支架材料具有更好的机械强度和更慢的降解速度；并可通过改变丝素蛋白和聚乙烯醇的比例对孔径的大小和密度进行调控。 

进一步，在步骤2）中，所述聚乙烯醇溶液由分子量为30，000～70，000道尔顿，水解度为87～90％的聚乙烯醇制得。 

采用上述进一步方案的有益效果是，如果聚乙烯醇的分子量低于30000，则制成的聚乙烯醇溶液不能与丝素蛋白溶液形成分离相，并且不能诱导丝素蛋白形成β-折叠结晶结构，从而不能最终形成多孔材料；相反，如果聚乙烯醇的分子量高于70000， 则共混物中的聚乙烯醇不能充分溶于水，因而不能形成孔径均匀的材料。 

进一步，所述聚乙烯醇溶液为重量体积比为2～10%的聚乙烯醇溶液。 

进一步，所述聚乙烯醇溶液的重量体积百分比为5%。 

采用上述进一步方案的有益效果是，如果聚乙烯醇溶液的重量百分比低于5％，则达到一定重量比所需的共混液的体积增加，进而增加下面浓缩步骤中聚乙二醇溶液的使用量和透析的时间；相反，如果聚乙烯醇溶液的重量体积百分比高于5%，则溶液难于在室温条件下溶解，并且溶液在室温或低温状态下保存时容易有固体聚乙烯醇析出。另外，高浓度的聚乙烯醇较难与丝素蛋白溶液充分共混。 重量体积百分比为5%的聚乙烯醇溶液为最佳。 

在步骤2）中，所述聚乙烯醇溶液与丝素蛋白溶液以1:5～1:3的重量比混合。 

采用上述进一步方案的有益效果是，如果共混物中两者的重量比例低于2／1，则丝素蛋白材料在水洗的过程中会部分或完全溶解；相反，如果两者的比例过高，则制成的多孔材料的孔隙率和孔径度会大大降低，以1：5～1:3的重量比混合可以达到最佳的效果。 

进一步，在步骤3）中，置于重量体积比为15％聚乙二醇溶液中透析浓缩18～24小时。 

采用上述进一步方案的有益效果是，短时间的透析浓缩（丝素蛋白浓度低于10％）的海绵支架非常柔软，且在外加压力下易碎。 

进一步，在步骤3）中，所述浓缩后的共混液含有重量体积百分比为10～30％的丝素蛋白。 

采用上述进一步方案的有益效果是，如果浓缩液中的丝素蛋白重量体积百分比过低，则制成的丝素蛋白多孔支架材料中形成的丝素蛋白腔壁较薄，不连续，因而导致支架的压缩机械强度较差，降解速率高等缺点；相反，如果丝素蛋白的重量体积比过高，则制成的多孔支架中丝素蛋白腔壁较厚，孔隙较小，因而导致支架过于坚硬，难降解，不利于软组织的修复。 浓缩后的共混液含有10～30％重量体积百分比的丝素蛋白为最佳。 

进一步，在步骤5）中，所述共混物放入10倍以上共混物体积的水中，于20～100°C下漂洗8～24小时，期间每间隔2～6小时换水一次。 

进一步，将共混物放入50倍共混物体积的水中，于室温漂洗24小时，期间每隔6小时换水一次，共换水4次。 

采用上述进一步方案的有益效果是，由于丝素蛋白在高温处理下形成了更多的β-折叠结构，高温水洗使得丝素蛋白海绵变得更为坚硬，为了保持制成的丝素蛋白海绵的质地柔软同时具有一定的β-折叠结构含量（适合软组织修复），因而选择室温洗脱作为标准的制备工艺。 

本发明解决上述技术问题的再一技术方案如下：一种用聚乙烯醇制成的丝素蛋白多孔海绵状支架的用途，所述用聚乙烯醇制成的丝素蛋白多孔海绵状支架用于组织工程，作为软组织修复材料和／或药物缓释剂。 

进一步，所述软组织修复材料直接用于包括止血、残腔填充等外科手术的填充材料。 

采用上述进一步方案的有益效果是，多孔海绵状支架作为可降解医用吸收性耗材直接用于普外, 神经，妇产，骨，烧伤等外科手术中的止血、残腔填充，促进急性和慢性刨面的快速愈合（非功能性修复）。 

进一步，所述组织工程包括组织修复材料和支架材料。 

进一步，所述组织修复材料中结合有选自组织修复或疾病治疗所需成分中的一种或多种，用于缺损组织的功能性恢复，所述组织修复或疾病治疗所需成分 包含病人自身提取的或其他来源的干细胞和/或生长因子。 

采用上述进一步方案的有益效果是干细胞可以在生长因子的诱导下分化成成熟的组织细胞，分泌蛋白酶降解丝素蛋白支架材料，并分泌各种形成组织结构必需的多聚物用于组织结构的重建，因而在外科或美容手术后作为填充材料可以充分恢复缺损组织原有的形态和生理功能。 

进一步，所述支架材料中含有通过物理吸附、包埋或化学偶联固定在支架材料中的药物分子，所述药物分子选自蛋白质、多肽、抗体或核酸中的一种或多种，用于慢性病的药物缓释治疗。 

采用上述进一步方案的有益效果是，通过改变丝素蛋白的微观分子结构和宏观材料形态（孔隙率，比表面积等）可以有效地包裹和保护具有不同性质的药物分子，如亲水性和疏水性药物，易降解变性的蛋白质药物等。药物分子在体内以一定的速率在较长的时间范围内释放，从而达到降低药物的使用次数和频率，降低毒副作用，减轻病人的痛苦和经济负担等多重目的 

进一步，所述支架材料中还结合有干细胞、组织细胞和/或生长因子，所述生长因子在制备过程中包埋在支架材料中，所述干细胞或组织细胞吸附在制成的支架材料的孔隙中。

本发明制成的丝素蛋白海绵可以同时应用于组织缺损修复和疾病防治等不同目的。例如，将包裹有抗癌药物的丝素蛋白海绵用于乳腺癌病人的乳房切除术后的修复，在修复缺损乳房组织的过程中可以在切除部位长期地释放一定量的抗癌药物，杀死周围残留的癌细胞。利用同样原理也可以将某种癌细胞检测试剂包裹在丝素蛋白海绵中，通过长期定量的释放对周围可能复发的癌细胞进行即时的监测和预防。 

本发明中使用的聚乙烯醇是安全无毒的高亲水性化合物，将其与丝素蛋白共混制成多孔材料并在随后的水洗步骤中去除，不但有效地克服了以上丝素蛋白海绵材料制备工艺上的不足，而且少量残留的聚乙烯醇能够改善丝素蛋白材料表面的疏水性质，有利于组织工程和组织修复的效果。 

具体实施方式

以下对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。 

本发明所述的用聚乙烯醇制成的丝素蛋白多孔海绵状支架，由以下重量百分含量的丝素蛋白纤维60～80％和聚乙烯醇颗粒20～40％共混物制成，所述支架上设有均匀分布的微孔，所述微孔的孔径为100～500微米，所述支架的孔隙率为85～95％。 

所述用聚乙烯醇制成的丝素蛋白多孔海绵状支架用于组织工程， 作为软组织修复材料和/或药物缓释剂，所述软组织修复材料包括止血、残腔填充材料和细胞支架材料，所述药物缓释剂由用聚乙烯醇制成的丝素蛋白多孔海绵状支架与药物分子相混合制得，所述止血、残腔填充材料用于外科手术，所述组织工程包括组织修复材料和支架材料，所述组织修复材料中结合有选自组织修复或疾病治疗所需成分中的一种或多种，用于缺损组织的功能性恢复，所述组织修复或疾病治疗所需成分 包含病人自身提取的或其他来源的干细胞和/或生长因子；所述支架材料与干细胞和/或生长因子相结合，所述药物分子为蛋白质、多肽、抗体或核酸中的一种或多种的组合，所述支架材料与干细胞和/或生长因子及治疗用药物分子同时相结合。 

 实施例1 

1．丝素蛋白的纯化

将10克粗蚕丝（纺织工业用粗蚕丝购自江苏苏州苏豪集团）置于2升0.02M碳酸钠溶液中煮沸30分钟以去除蚕丝表面上包裹的丝胶（残留的丝胶易引起免疫反应）。脱胶后的蚕丝在空气中晾干后浸泡于50毫升9.3M溴化锂溶液中，经60°C加热4小时后得到丝素蛋白浓溶液，最后经透析去除溶液中的溴化锂得到浓度约为8% （w/v）的丝素蛋白水溶液。丝素蛋白溶液可以在4°C保存1-2个月。

2．用聚乙烯醇制成的丝素蛋白多孔海绵状支架的制备 

1）将丝素蛋白溶液稀释至浓度5% （w/v）；

2） 将丝素蛋白水溶液中加入5% （w/v）聚乙烯醇（分子量30000-70000）溶液，充分混匀，所述丝素蛋白水溶液与聚乙烯醇溶液的重量比为1:3；

3） 将丝素蛋白和聚乙烯醇共混液移入透析袋，置于50倍体积的重量体积比为15％聚乙二醇溶液中透析浓缩12小时，制得浓缩后的共混物，其丝素蛋白重量体积百分比10％;

4）将浓缩后的共混液，置于塑料模具中，冷冻干燥24小时，制得共混物；

5）将共混物放入水中，于室温漂洗24小时，每隔6小时换水一次，共换4次水，去除聚乙烯醇，形成海绵状丝素蛋白多孔材料;

6）将制成的多孔支架材料在室温下干燥备用。

  

实施例2

1．丝素蛋白的纯化

同实施例1。

2．用聚乙烯醇制成的丝素蛋白多孔海绵状支架的制备 

1）将丝素蛋白溶液稀释至浓度8% （w/v）；

2）将丝素蛋白水溶液中加入5% （w/v）聚乙烯醇溶液，充分混匀，所述丝素蛋白水溶液与聚乙烯醇溶液的重量比为1:5；

3） 将丝素蛋白和聚乙烯醇共混液移入透析袋，置于10倍体积的重量体积比为15％聚乙二醇溶液中透析浓缩20小时，制得浓缩后的共混物，其丝素蛋白重量体积百分比20％;

4）将浓缩后的共混液，置于塑料模具中，冷冻干燥48小时；

5）将干燥后的共混物放入水中，于60°漂洗16小时，每隔4小时换水一次，共换4次水，去除聚乙烯醇，形成海绵状丝素蛋白多孔材料;

6）将制成的多孔支架材料在室温下干燥备用。

  

实施例3

1．丝素蛋白的纯化

同实施例1。

2．用聚乙烯醇制成的丝素蛋白多孔海绵状支架的制备 

1）将丝素蛋白溶液稀释至浓度6% （w/v）；

2）将丝素蛋白水溶液中加入5% （w/v）聚乙烯醇溶液，充分混匀，所述丝素蛋白水溶液与聚乙烯醇溶液的重量比为1:2；

3） 将丝素蛋白和聚乙烯醇共混液移入透析袋，置于100倍体积的重量体积比为20％聚乙二醇溶液中透析浓缩18小时，制得浓缩后的共混物，其丝素蛋白重量体积百分比30％;

4）将浓缩后的共混液，置于塑料模具中，冷冻干燥72小时；

5）将干燥后的共混物放入水中，于100°漂洗8小时，每隔2小时换水一次，共换4次水，去除聚乙烯醇，形成海绵状丝素蛋白多孔材料;

6）将制成的多孔支架材料在室温下干燥备用。

实施例4 

以下细胞培养所用试剂均购自Invitrogen公司。

a.人骨髓干细胞的体外培养和增殖 

人骨髓干细胞来源于临床中新鲜获取的人骨髓提取液。由于骨髓干细胞具有很好的贴壁性，因而可以通过培养中几次换液处理将悬浮的不贴壁的造血细胞去除。 细胞培养液的成分为90％DMEM，10％ 胎牛血清， 100 单位 / 毫升青霉素，1000单位/毫升链霉素，0.2％ 抗真菌混合液，以及1 纳克/毫升碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）。最后将贴壁的骨髓干细胞用0.25％的胰蛋白酶消化，经离心后悬浮于含有8％二甲基亚砜的培养液中，分装冻存，得到的首代骨髓干细胞用于下面的传代和扩增培养。

  

b.人骨髓干细胞在用聚乙烯醇制成的丝素蛋白多孔海绵状支架中的接种和生长

首先将用聚乙烯醇制成的丝素蛋白多孔海绵状支架切成大约2.5毫米高，5毫米直径的圆柱体，浸泡于70％酒精中12小时，置于超净工作台中完全干燥，然后浸泡于细胞培养液中备用。将扩增培养的约50万个人骨髓干细胞悬浮于50微升的细胞培养液中，然后均匀地滴在挤干的丝素蛋白海绵表面上，待细胞悬浮液被海绵完全吸收后将样品在 37°C二氧化碳培养箱中培养2小时，然后加入细胞培养液进行培养。

具体试验实施例

将实施例1-3制得的用聚乙烯醇制成的丝素蛋白多孔海绵状支架的平均值同其他方法制成的丝素蛋白支架三个样品的平均值相比较，具体参数如下表1所示。

1．扫描电镜测定丝素蛋白海绵的表面特性和孔径大小 

将丝素蛋白海绵样品切成薄片，用两面胶固定在扫描电镜的标本支架上，然后置于溅射镀膜机（Ploaron SC502，法伊森仪器，英国）中表面镀金，随后用JEOL公司的JSM 840A扫描电子显微镜在15千伏的电压下进行观察。

2．丝素蛋白海绵的孔径率测定 

丝素蛋白海绵的孔径率是根据文献报导所采用的液体置换法进行测定的。由于丝素蛋白材料在正己烷中不会发生膨胀和收缩，因而在实验中作为置换用的液体渗透并填充丝素蛋白海绵中的空隙。具体的操作步骤如下：将一定体积的正己烷（V1）置于一个量筒中，再将一定重量的丝素蛋白海绵（W）完全浸没在正己烷中，静置10分钟，记录下总体积(V2)。将浸有正己烷的丝素蛋白海绵从量筒中取出，再记录下量筒中剩余的正己烷体积（V3）。丝素蛋白海绵的总体积为：V=（V2- V1）+（V1- V3）= V2- V3，其中V2- V1为丝素蛋白海绵的体积，而V1- V3为丝素蛋白海绵空隙中正己烷的体积。丝素蛋白海绵的空隙率则为：ε（%）=（V1- V3）/（V2- V3）×100。

3．丝素蛋白海绵的机械强度测定 

丝素蛋白海绵的机械抗压性能是通过Instron 8511材料测试机（美国Instron公司），使用0.1KN的重力传感器，在室温下进行测定的。圆柱形样品的尺寸为 8 毫米直径× 6 毫米高, 施加载荷速度为2 毫米/分钟. 同样条件下每组测六个样品,通过压应力和应变的参数计算得到平均压缩强度，压缩模量以及标准差。

  

表1 用聚乙烯醇制成的丝素蛋白多孔海绵状支架同其他方法制得的支架参数对比 

从上述表1可以看出本发明的方法制备的用聚乙烯醇制成的丝素蛋白多孔海绵状支架的孔隙率（90％以上）与其他方法制备的丝素蛋白海绵支架相当，孔径大小（200－400微米）优于冻干法制成的丝素蛋白海绵。通过控制聚乙烯醇一步法制备过程中的参数，丝素蛋白海绵的机械强度可以在较大的范围内进行调控，其应压力（200－500 Kpa）和 压缩模量 （800－1400 Kpa）明显优于冻干法和盐析法制成的丝素蛋白海绵。

  

将实施例4制成的丝素蛋白多孔海绵状支架中的人骨髓干细胞的生长情况同其他方法制成的丝素蛋白支架三个样的平均值相比较，具体步骤和结果如下

细胞生长率的测定

在一定的时间点，将培养的丝素蛋白海绵样品取出，浸泡于一定体积的0.1% Triton X-100溶液中，用手术剪刀将其彻底剪碎，然后离心去除海绵碎片，利用PicoGreen荧光分析法对上清液中含有的DNA含量进行测定。每组测定至少使用4个样品以得到标准偏差。

  

我们对比了几种不同的丝素蛋白海绵材料的对人骨髓干细胞生长速率的影响，如表2所示。

  

表2用聚乙烯醇制成的丝素蛋白多孔海绵状支架同其他方法制得的支架生物相容性的对比

从表2可以看出，其中盐析法和本发发明的方法制备的丝素蛋白支架对细胞的生长有轻微的促进作用（较高的生物相容性），这可能是由于这两种方法制备的丝素蛋白海绵比有机溶剂法制备的海绵有较高的亲水性和较低的β-折叠结构含量，更利于细胞的贴壁生长。细胞生长率在冻干法制备的海绵材料中首先下降（头两周），随后上升，因此生物相容性较差。这可能是由于材料支架的孔径较小（100微米以下），孔隙率较低，影响了培养液中的营养成分的传递及细胞代谢所产生废物的排出。随着海绵材料的降解，这种负面影响逐渐消除，使得细胞逐渐恢复了正常生长 。

  

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种用聚乙烯醇制成的丝素蛋白多孔海绵状支架，其特征在于，由以下重量百分含量的丝素蛋白纤维60～80％和聚乙烯醇颗粒20～40％制成，所述支架上设有均匀分布的微孔，所述微孔的孔径为100～500微米，所述支架的孔隙率为85～95%。

2.根据权利要求1所述的用聚乙烯醇制成的丝素蛋白多孔海绵状支架的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）将从蚕丝中提取的丝素蛋白制成重量体积百分比为5～8％的丝素蛋白水溶液;

2）将聚乙烯醇溶液与丝素蛋白溶液以1:5～1:2的重量比混合，得到共混液，所述聚乙烯醇溶液由分子量为30000～186000道尔顿的聚乙烯醇溶于水制得；

    3）将共混液移入透析袋，置于重量体积比为10～20％的聚乙二醇溶液中透析浓缩12～24小时，制得浓缩共混液，所述共混液与聚乙烯醇溶液的体积比为1：10～1：100倍;

4）将浓缩后的共混液置于模具中，冷冻干燥24～72小时，得到共混物；

5）将共混物放入水中漂洗，除去聚乙烯醇，形成海绵状丝素蛋白多孔材料;

6）将制成的多孔支架材料在室温下干燥24～48小时，即得。

3.根据权利要求2所述的用聚乙烯醇制成的丝素蛋白多孔海绵状支架的制备方法，其特征在于，在步骤2）中，所述聚乙烯醇溶液由分子量为30，000～70，000道尔顿，水解度为87～90％的聚乙烯醇制得。

4.根据权利要求3所述的用聚乙烯醇制成的丝素蛋白多孔海绵状支架的制备方法，其特征在于，所述聚乙烯醇溶液为重量体积比为2～10%的聚乙烯醇溶液，所述聚乙烯醇溶液的重量体积百分比优选为5%。

5.根据权利要求2至4任一项所述的用聚乙烯醇制成的丝素蛋白多孔海绵状支架的制备方法，其特征在于，在步骤2）中，所述聚乙烯醇溶液与丝素蛋白溶液以1:5～1:3的重量比混合。

6.根据权利要求2至4任一项所述的用聚乙烯醇制成的丝素蛋白多孔海绵状支架的制备方法，其特征在于，在步骤3）中，置于重量体积比为15％聚乙二醇溶液中透析浓缩18～24小时，所述浓缩后的共混液含有重量体积百分比为10～30％的丝素蛋白。

7.根据权利要求2至4任一项所述的用聚乙烯醇制成的丝素蛋白多孔海绵状支架的制备方法，其特征在于，在步骤5）中，所述共混物放入10倍以上共混物体积的水中，于20～100°C下漂洗8～24小时，期间每间隔2～6小时换水一次，优选地，将共混物放入50倍共混物体积的水中，于室温漂洗24小时，期间每隔6小时换水一次，共换水4次。

8.根据权利要求1所述的用聚乙烯醇制成的丝素蛋白多孔海绵状支架的用途，其特征在于，所述用聚乙烯醇制成的丝素蛋白多孔海绵状支架用于组织工程，作为软组织修复材料和／或药物缓释剂。

9. 根据权利要求8所述的用聚乙烯醇制成的丝素蛋白多孔海绵状支架的用途，其特征在于，所述软组织修复材料包括止血、残腔填充材料和细胞支架材料，所述组织工程包括组织修复材料和支架材料，所述组织修复材料中结合有选自组织修复或疾病治疗所需成分中的一种或多种，所述组织修复或疾病治疗所需成分包含病人自身提取的干细胞和/或生长因子，所述支架材料中含有通过物理吸附、包埋或化学偶联固定在支架材料中的药物分子，所述药物分子选自蛋白质、多肽、抗体或核酸中的一种或多种。

10. 根据权利要求9所述的用聚乙烯醇制成的丝素蛋白多孔海绵状支架的用途，其特征在于，所述支架材料中还结合有干细胞、组织细胞和/或生长因子，所述生长因子在制备过程中包埋在支架材料中，所述干细胞或组织细胞吸附在制成的支架材料的孔隙中。