CN115252889A

CN115252889A - 产氧支架及其制备方法

Info

Publication number: CN115252889A
Application number: CN202210829551.3A
Authority: CN
Inventors: 闫书芹; 茹敏; 张强; 尤仁传; 李秀芳; 罗祖维; 黄颖
Original assignee: Wuhan Textile University
Current assignee: Wuhan Textile University
Priority date: 2022-07-15
Filing date: 2022-07-15
Publication date: 2022-11-01
Anticipated expiration: 2042-07-15
Also published as: CN115252889B

Abstract

本发明公开了一种产氧支架及其制备方法。通过将丝素蛋白溶液、聚乙烯醇溶液，过氧化钙颗粒三元体系混合，并控制丝素蛋白与聚乙烯醇的质量比例以及混合体系中丝素蛋白与聚乙烯醇的总质量，将混合体系经过预冷冻、退火冷冻、冷冻干燥和化学交联处理，制备得到一定孔径范围的产氧支架。所述支架具有较好的水稳定性、丰富的孔结构和极佳的柔韧性，且初始释氧量在3.5％以上，能在植入前期改善局部环境的缺氧状态，同时释氧时间可达10天左右，有助于修复部位的新血管生成与瘢痕抑制。将所述产氧支架作为组织工程氧源时，既可以持续高水平地为组织输送氧气，又可以为种子细胞提供粘附、增殖的场所，具有广泛的应用前景。

Description

产氧支架及其制备方法

技术领域

本发明涉及产氧材料技术领域，尤其涉及一种产氧支架及其制备方法。

背景技术

分子氧，作为一种重要的代谢底物和信号分子，参与了细胞增殖、分化等基本生命活动。例如，当皮肤受损自我修复时，受伤部位往往是缺氧的，而缺氧引发机体过度分泌缺氧诱导因子-1(HIF-1)，是诱发成纤维细胞过度增殖和胶原过度沉积、无序排列，进而加剧瘢痕形成的重要原因之一。其次，在骨折修复时，修复部位的分子氧水平会显著影响胶原蛋白的合成以及干细胞的分化，且适量的高浓度分子氧能加强骨髓干细胞成骨分化的能力。另外，分子氧还可用于心肌梗死病症的辅助治疗，改善心肌梗死后因缺氧导致的心肌细胞大面积坏死的现象。因此，开发氧源材料在生命医学领域具有巨大的应用价值。

过氧化钙(CaO₂)是一种常用的无机释氧剂，因反应温和、细胞毒性较小，释氧周期长，而被广泛用作组织工程释氧剂。例如公开号为CN105561378A的专利提供了一种由过氧化钙和氰基丙烯酸酯组成的释氧材料的方法，用于粘合或覆盖伤口；公开号为CN108310470A的专利提供了一种以明胶为基质包裹过氧化钙的释氧微球及其制备方法，用于骨修复工程。

上述专利均为基于零维或一维材料，采用物理共混或乳化作用将过氧化钙包覆于基质材料之中。从组织工程的观点来看，上述几种材料存在部分不足，因为人体组织细胞外环境是一种复杂的拓扑结构，基质材料应当具有三维立体结构，尤其是具有相互连通的孔结构，以便更好的为种子细胞提供粘附、迁移和增殖的场所。其次，低维材料作为控释的载体，始终无法解决突释的问题，难以满足病灶区或临床上对氧源材料长期释氧的要求。进一步的，上述专利所制备的氧源材料及其所用基材缺乏生物相容性，同时制备过程中存在有毒有害试剂的使用问题。因此，亟待开发一种具有三维结构、对环境友好的氧源材料。

三维生物支架被用来模仿细胞外基质(ECM)结构，广泛用于组织工程，而多孔结构是生物支架最突出的特点。丝素蛋白是蚕丝的主要组成成分，因其优异的生物相容性和可调控的生物降解性等优异特性而被广泛用于制备生物三维支架。公开号为CN104288835A的专利提供了一种丝素蛋白-人发角蛋白-明胶-过氧化钙复合产氧支架及其制备方法，用于尿道修复重建。然而该专利所述人发角蛋白在提取过程中存在环境污染问题，同时使用的试剂有生物毒性。此外，通过乙醇处理尽管可以增加支架水稳定性，但是支架的收缩和结晶度难以调控以及柔性下降等问题仍制约着其在生命医学领域的应用。

有鉴于此，有必要设计一种产氧支架及其制备方法，以解决上述问题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种以丝素蛋白-聚乙烯醇为骨架，过氧化钙为释氧剂，在体内水分的作用下，通过过氧化钙的逐步水解，达到持续的高水平产氧效果，有助于修复部位的新血管生成与瘢痕抑制的产氧支架及其制备方法。

为实现上述发明目的，本发明提供了一种产氧支架的制备方法，包括如下步骤：

S1、将家蚕丝置于预定量的去离子水中，加入无水碳酸钠，经搅拌、煮沸、清洗后，再次加入无水碳酸钠，重复若干次，烘干得到脱胶蚕丝；

S2、将步骤S1制备得到的所述脱胶蚕丝剪碎并置于溴化锂溶液中，加热搅拌至完全溶解，经透析、离心、过滤，得到SF溶液；

S3、将PVA颗粒置于预定量的去离子水中，加热搅拌至完全溶解得到PVA溶液；

S4、将步骤S2制备得到的所述SF溶液稀释得到溶液a，将所述溶液a与所述PVA溶液混合，充分搅拌后得到溶液b，将CaO₂粉末加入所述溶液b中，充分搅拌得到悬浮液c；

S5、将所述悬浮液c经预冷冻、退火冷冻、冷冻干燥和在交联剂气氛中进行化学交联处理后得到SF-PVA-CaO₂支架。

作为本发明的进一步改进，步骤S4中，所述溶液b中SF和PVA的总质量分数为2～5wt％，所述SF与所述PVA的质量比为30:70～70:30，所述CaO₂质量与所述SF和PVA总质量的比为1：(1～10)。

作为本发明的进一步改进，步骤S5中，所述预冷冻操作为：将步骤S4中制备得到的所述悬浮液c浇筑于器皿内，在温度T1下预冷冻得到冷冻体d；所述温度T1为-200℃～-150℃，处理时间为10～40min。

作为本发明的进一步改进，步骤S5中，所述退火冷冻操作为：将所述冷冻体d置于温度T2下处理得到冷冻体e，再将所述冷冻体e置于温度T3下处理得到冷冻体f；所述温度T2为-140℃～-70℃，处理时间为10～30h；所述温度T3为-20℃～-1℃，处理时间为36～96h。

作为本发明的进一步改进，步骤S5中，所述冷冻干燥操作为：将所述冷冻体f置于冷冻温度为T4的干燥机中冷冻干燥得到冻干材料g；所述冷冻温度T4为-60℃～-20℃，处理时间为24～96h。

作为本发明的进一步改进，步骤S5中，所述化学交联操作为：将所述冻干材料g置于温度为T5的交联剂气氛中处理得到SF-PVA-CaO₂支架；所述温度T5为20℃～100℃，处理时间为2～8h；所述交联剂为环氧乙烷、乙醛、乙酸、酚醛树脂、乙醇或戊二醛等有机物中的一种或几种的组合。

作为本发明的进一步改进，步骤S1中，所述家蚕丝与去离子水的质量比为1:15～1:80，所述无水碳酸钠的质量分数为(0.05％～0.30％)；优选的，加入无水碳酸钠重复的次数为3次，所述无水碳酸钠的质量分数分别为(0.05％～0.30％)、(0.05％～0.30％)、(0.05％～0.20％)。

作为本发明的进一步改进，步骤S2中，所述水浴加热温度为50℃～90℃，加热时间为1～3h。

作为本发明的进一步改进，步骤S3中，所述加热温度为60℃～120℃，加热时间为4～8h。

为实现上述目的，本发明还提供了一种产氧支架，所述产氧支架根据上述技术方案中任一技术方案制备得到，包括作为骨架的丝素蛋白-聚乙烯醇和作为释氧剂的过氧化钙。

本发明的有益效果是：

1、本发明通过聚乙烯醇这一新型组分的引入，有利于维持制备过程中的均相体系的稳定性，保证过氧化钙在溶液中的均匀分布，达到氧气缓释的效果，同时聚乙烯醇还能大幅度提升支架的湿态机械性能，满足支架的性能需求。

2、本发明通过控制支架前体的预冷冻处理温度，以加快冷冻体的形成，同时通过退火处理使预冷冻形成的冰晶重组，进行冰晶的二次生长，并结合冷冻干燥处理，从而得到一定孔径范围的支架，以便于种子细胞的粘附、增殖等行为。另外，退火处理可以对支架的结晶度进行调控，赋予支架与组织相匹配的机械性能，减少因机械失配引发的过度免疫反应，改善材料的生物相容性。同样的，支架的降解速率可以通过控制退火时间来调控，为其作为组织工程氧源支架奠定基础。此外，通过使用不同温度对支架前体进行冷冻处理，可以增强支架的柔韧性，同时通过冷冻退火和在交联剂气氛下交联处理共同改善支架的水稳定性，避免了支架发生收缩的问题。

3、本发明通过控制丝素蛋白与聚乙烯醇的质量比，调控聚乙烯醇-丝素蛋白体系的亲水性，使产氧支架在植入前期快速释氧，改善局部环境的缺氧状态，避免因丝素蛋白比例过大导致支架溶失率过高。另外，通过调控支架孔径并结合支架内部的过氧化钙颗粒表面被丝素蛋白-聚乙烯醇基质包裹的特点，可以调节水分子进入支架内部与过氧化钙发生反应的速度，使得本发明的产氧支架能够在第10天仍保持氧气水平释放量在0.5％以上，从而保证产氧支架在10天内的高水平氧气释放，有助于修复部位的新血管生成与瘢痕抑制。

4、本发明提供的产氧支架的制备方法简单可控，流程短、绿色环保，成本较低。制备的产氧支架具有优异的生物相容性、适宜的机械性能及可调控的降解性，能够满足实际生产与应用的要求，作为组织工程氧源有较大的应用前景。

附图说明

图1为本发明提供的产氧支架的制备流程示意图。

图2为实施例1～3与对比例1～3制备的产氧支架的氧气水平检测结果。

图3为实施例1～3与对比例1～3制备的产氧支架的热水溶失检测结果。

图4为对比例5制备的产氧支架的孔径分布结果。

图5为对比例6制备的产氧支架的电镜检测结果。

图6为对比例7制备的产氧支架的电镜检测结果。

图7为实施例5制备的产氧支架的电镜检测结果。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细描述。

在此，还需要说明的是，为了避免因不必要的细节而模糊了本发明，在附图中仅仅示出了与本发明的方案密切相关的结构和/或处理步骤，而省略了与本发明关系不大的其他细节。

另外，还需要说明的是，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。

本发明提供了一种产氧支架的制备方法，包括如下步骤：

S1、将家蚕丝置于预定量的去离子水中，加入无水碳酸钠，经搅拌、煮沸、清洗后，再次加入无水碳酸钠，重复3次，烘干得到脱胶蚕丝；

S2、将步骤S1制备得到的脱胶蚕丝剪碎并置于9.3mol/L的溴化锂(LiBr)溶液中，加热搅拌至完全溶解，经透析、离心、过滤，得到SF溶液；

S4、将步骤S2制备得到的SF溶液稀释得到溶液a，将所述溶液a与步骤S3制备得到的PVA溶液混合，充分搅拌后得到溶液b，将CaO₂粉末加入所述溶液b中，充分搅拌得到悬浮液c；

S5、预冷冻：将步骤S4中制备得到的悬浮液c浇筑于器皿内，在温度T1下预冷冻得到冷冻体d；

S6、退火冷冻：将步骤S5制备得到的冷冻体d置于温度T2下处理得到冷冻体e，再将冷冻体e置于温度T3下处理得到冷冻体f；

S7、冷冻干燥：将步骤S6中制备得到的冷冻体f置于冷冻温度为T4的干燥机中冷冻干燥得到冻干材料g；

S8、化学交联：将步骤S7中制备得到的冻干材料g置于温度为T5的交联剂气氛中处理得到SF-PVA-CaO₂支架。

具体的，步骤S1中，家蚕丝与去离子水的质量比为1:15～1:80，每次煮沸时间为20～30min，每次清洗2～3次，无水碳酸钠的质量分数分别为(0.05％～0.30％)、(0.05％～0.30％)，(0.05％～0.20％)，烘干温度为40～80℃。

具体的，步骤S2中，水浴加热温度为50℃～90℃，加热时间为1～3h。

具体的，步骤S3中，加热温度为60℃～120℃，加热时间为4～8h；离心机转速为5000～10000rpm，离心时间为5～10min。

具体的，步骤S4中，溶液b中SF和PVA的总质量分数为2～5wt％，SF与PVA的质量比为30:70～70:30，CaO₂质量与SF和PVA总质量的比为1：(1～10)；制备溶液b时的搅拌速度为100～400rpm，搅拌时间为10～20min；制备悬浮液c时的搅拌速度为1000～2000rpm，搅拌时间为4～10min。

具体的，步骤S5中，温度T1为-200℃～-150℃，处理时间为10～40min。

具体的，步骤S6中，温度T2为-140℃～-70℃，处理时间为10～30h；所述温度T3为-20℃～-1℃，处理时间为36～96h。

具体的，步骤S7中，冷冻温度T4为-60℃～-20℃，处理时间为24～96h。

具体的，步骤S8中，温度T5为20℃～100℃，处理时间为2～8h；交联剂为环氧乙烷、乙醛、乙酸、酚醛树脂、乙醇或戊二醛等有机物中的一种或几种的组合。

本发明还提供了一种支架，所述产氧支架根据上述技术方案中任一技术方案制备得到，包括作为骨架的丝素蛋白-聚乙烯醇和作为释氧剂的过氧化钙，所述支架的平均孔径为40～105μm。

下面结合具体的实施例对本发明提供的产氧支架的制备方法进行说明。

实施例1

本实施例提供了一种产氧支架的制备方法，包括如下步骤：

S1.将家蚕丝置于盛有去离子水的玻璃器皿中，使家蚕丝与去离子水的质量比为1:50，再加入0.1％无水碳酸钠搅拌，煮沸30min后，清洗2次；再次加入0.1％无水碳酸钠搅拌，煮沸30min后，清洗2次；最后加入0.05％无水碳酸钠搅拌，煮沸30min后，取出清洗2次，在60℃条件下烘干得到脱胶蚕丝；

S2.将步骤S1中制备的脱胶蚕丝剪碎置于盛有9.3mol/L的溴化锂(LiBr)溶液中，脱胶蚕丝与溴化锂(LiBr)溶液的比例为1:50(m/v)，70℃水浴加热并缓慢搅拌至完全溶解，经透析、离心，过滤，得到SF溶液；

S3.将固体PVA颗粒置于盛有去离子水的玻璃器皿中，控制PVA质量分数为6.0wt％，加热至100℃并搅拌(300rpm，4h)至完全溶解得到PVA溶液；

S4.将步骤S2中得到的SF溶液与去离子水混合，控制SF质量分数为4.0wt％，搅拌(100rpm，5min)得溶液a，接下来将步骤S3中制备的PVA溶液与溶液a混合，其中丝素蛋白与聚乙烯醇质量比为30:70，搅拌(100rpm，15min)得溶液b，控制溶液b的总质量分数为4wt％，最后将CaO₂固体粉末加入溶液b中，控制过氧化钙与溶液b中总溶质质量比为1:6，搅拌(1000rpm，5min)得悬浮液c。

S5.将步骤S4中制备的悬浮液c浇筑于器皿内，在-150℃下预冷冻30min得到冷冻体d。

S6.将步骤S5中制备的冷冻体d置于-90℃下处理24h得到冷冻体e，再将冷冻体e置于-20℃下处理96h得到冷冻体f。

S7.将步骤S6中制备的冷冻体f置于冷冻温度为-60℃的干燥机中冷冻干燥24h得到冻干材料g。

S8.将步骤S7中制备的冻干材料g置于50℃的戊二醛气氛中处理2h得到SF-PVA-CaO₂支架。

实施例2～3及对比例1～3

实施例2～3及对比例1～3分别提供了一种产氧支架的制备方法，与实施例1相比，实施例2～3及对比例1～3仅更改了步骤S4中丝素蛋白溶液与聚乙烯醇溶液的溶质质量比，实施例2～3及对比例1～3中对应的丝素蛋白溶液与聚乙烯醇溶液的溶质质量比如表1所示。

表1实施例1～3及对比例1～3对应的丝素蛋白溶液与聚乙烯醇溶液的溶质质量比

丝素蛋白溶液与聚乙烯醇溶液的溶质质量比的变化对制得的产氧支架的氧气释放行为有较大的影响。如图2所示，随着丝素蛋白溶液与聚乙烯醇溶液的溶质质量比增大，氧气的初始释放速率随之增大。这是由于随着丝素蛋白比例的增大，体系的亲水性增加，当聚乙烯醇比例增高时，体系的亲水性下降，水分子需要较长的时间才能渗入支架内部与过氧化钙颗粒反应。作为组织工程氧源应当在植入前期快速释氧，改善局部环境缺氧的状态，初始释氧水平在3.5％以上具有较好的补氧效果，当丝素蛋白溶液与聚乙烯醇溶液的溶质质量比为20:80时，释氧效果较差，且初始释氧水平均低于3.5％，不满足组织工程对于氧源初始释氧水平的要求。此外，当支架材料仅使用丝素蛋白制备时，制备过程中的均相体系难以保证，过氧化钙分布不均匀，并且体系亲水性过大，从而易发生氧气突释现象，如图2所示，对比例1制备的产氧支架的氧气水平在7天内迅速下降至0，无法保持氧气的高水平缓释。

另外，对实施例1～3和对比例1～3制备的产氧支架进行热水溶失率表征(图3)，随着丝素蛋白比例增加，体系热水溶失率呈上升趋势，一般来说，SF/PVA/CaO₂支架体系热水溶失率在18％～26％时(因为CaO₂遇水会水解，进而产生质量损失)，支架能够稳定的保持一定的形态。因此将丝素蛋白溶液与聚乙烯醇溶液的溶质质量比控制在30:70～70:30范围内时，制备得到的产氧支架能满足实际使用需求。

实施例4～5及对比例4～5

实施例4～5及对比例4～5分别提供了一种产氧支架的制备方法，与实施例2相比，实施例4～5及对比例4～5仅更改了步骤S4中溶液b的总溶质质量分数；实施例4～5及对比例4～5对应的溶液b的总溶质质量分数如表2所示。

表2实施例2、4、5及对比例4～5对应的溶液b的总溶质质量分数

对实施例2、4、5及对比例4～5制备得到的产氧支架进行电镜表征后发现，随着总溶质质量分数的增加，支架的孔径越来越小，孔分布越来越密集。这是因为随着总浓度的提升，体系黏度增加，当预冷冻时，冰晶的生长受限，成型小。经过冷冻干燥后，冰晶升华，形成的支架孔径较小。

当溶液b的总溶质质量分数为1.0wt％时，支架的成型效果较差，并伴有些许过氧化钙沉积在支架底部；当溶液b的总溶质质量分数为6.0wt％时，支架的平均孔径为27.76μm(图4)，不利于种子细胞的粘附。实施例2、4、5制备的产氧支架的平均孔径分别为68.15μm、100.25μm、40.68μm符合种子细胞的粘附需求，同时成型效果较好(图7)。

对比例6～10

对比例6～10分别提供了一种产氧支架的制备方法，与实施例2相比，对比例6仅将步骤S5中预冷冻的温度更改为-30℃，对比例7在S5步骤中未实施预冷冻步骤，对比例8～10分别将步骤S5中的预冷冻和冷冻退火步骤操作更改为在-40℃下冷冻3h、在-40℃下冷冻6h和在-80℃下冷冻2h。

通过对对比例6～7制备的支架进行电镜表征，发现当预冷冻温度为-30℃和未实施预冷冻时，过氧化钙附着在支架孔壁上(图5、图6)，这可能是因为冷冻温度过高，冷冻体成型慢，使得过氧化钙析出，不利于达到氧气缓释的效果。而对比例8～10制备得到的支架的结晶度相近，仅改变冷冻时间和温度无法对其结晶度进行调控，从而无法调控支架的机械性能和降解行为。

综上所述，本发明提供了一种产氧支架及其制备方法。通过将丝素蛋白溶液、聚乙烯醇溶液，过氧化钙颗粒三元体系混合，并控制丝素蛋白与聚乙烯醇的质量比例以及混合体系中丝素蛋白与聚乙烯醇的总质量，将混合体系经过预冷冻、退火冷冻、冷冻干燥和化学交联处理，制备得到一定孔径范围的SF-PVA-CaO₂产氧支架。所述支架具有较好的物理强度和水稳定性、丰富的孔结构以及极佳的柔韧性，且初始释氧量在3.5％以上，能在植入前期改善局部环境的缺氧状态，同时释氧时间可达10天左右，有助于修复部位的新血管生成与瘢痕抑制。将所述产氧支架作为组织工程氧源时，既可以持续高水平地为组织输送氧气，又可以为种子细胞提供粘附、增殖的场所。此外，所述产氧支架的制备方法简单可控，流程短、绿色环保，成本较低，且具有优异的生物相容性、适宜的机械性能及可调控的降解性，在组织工程氧源领域具有较大的应用前景。

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围。

Claims

1.一种产氧支架的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

2.根据权利要求1所述的产氧支架的制备方法，其特征在于：步骤S4中，所述溶液b中SF和PVA的总质量分数为2～5wt％，所述SF与所述PVA的质量比为30:70～70:30，所述CaO₂质量与所述SF和PVA总质量的比为1：(1～10)。

3.根据权利要求1所述的产氧支架的制备方法，其特征在于：步骤S5中，所述预冷冻操作为：将步骤S4中制备得到的所述悬浮液c浇筑于器皿内，在温度T1下预冷冻得到冷冻体d；所述温度T1为-200℃～-150℃，处理时间为10～40min。

4.根据权利要求3所述的产氧支架的制备方法，其特征在于：步骤S5中，所述退火冷冻操作为：将所述冷冻体d置于温度T2下处理得到冷冻体e，再将所述冷冻体e置于温度T3下处理得到冷冻体f；所述温度T2为-140℃～-70℃，处理时间为10～30h；所述温度T3为-20℃～-1℃，处理时间为36～96h。

5.根据权利要求4所述的产氧支架的制备方法，其特征在于：步骤S5中，所述冷冻干燥操作为：将所述冷冻体f置于冷冻温度为T4的干燥机中冷冻干燥得到冻干材料g；所述冷冻温度T4为-60℃～-20℃，处理时间为24～96h。

6.根据权利要求5所述的产氧支架的制备方法，其特征在于：步骤S5中，所述化学交联操作为：将所述冻干材料g置于温度为T5的交联剂气氛中处理得到SF-PVA-CaO₂支架；所述温度T5为20℃～100℃，处理时间为2～8h；所述交联剂为环氧乙烷、乙醛、乙酸、酚醛树脂、乙醇或戊二醛等有机物中的一种或几种的组合。

7.根据权利要求1所述的产氧支架的制备方法，其特征在于：步骤S1中，所述家蚕丝与去离子水的质量比为1:15～1:80，所述无水碳酸钠的质量分数为0.05％～0.30％；优选的，加入无水碳酸钠重复的次数为3次，所述无水碳酸钠的质量分数分别为0.05％～0.30％、0.05％～0.30％、0.05％～0.20％。

8.根据权利要求1所述的产氧支架的制备方法，其特征在于：步骤S2中，所述水浴加热温度为50℃～90℃，加热时间为1～3h。

9.根据权利要求1所述的产氧支架的制备方法，其特征在于：步骤S3中，所述加热温度为60℃～120℃，加热时间为4～8h。

10.一种产氧支架，其特征在于：所述产氧支架根据权利要求1～9中任一权利要求所述的产氧支架的制备方法制备得到，包括作为骨架的丝素蛋白-聚乙烯醇和作为释氧剂的过氧化钙。