CN111671980A - 一种仿生复合骨支架及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种仿生复合骨支架的制备方法,包括以下步骤:A)将蚕丝置于温水中进行预处理,再置于65~95℃的水中处理,干燥,得到初处理的蚕丝;B)将所述初处理的蚕丝在中性盐溶液中处理,将得到的丝素丝胶蛋白复合溶解液再纯化,得到丝素丝胶蛋白复合溶液;C)将所述丝素丝胶蛋白复合溶液浓缩后冷冻干燥,将得到的初始骨架置于小分子一元醇中处理后冻干,得到仿生复合骨支架。本申请采用温和脱胶、一步溶解法制备了丝素丝胶蛋白复合溶液,利用该种丝素丝胶蛋白复合溶液制备得到的仿生复合骨支架具有高强度和高模量高韧性,解决了骨再生修复的天然生物聚合物组织工程支架力学性能不足的卡脖子技术难题。
Description
技术领域
本发明涉及生物医用材料技术领域,尤其涉及一种仿生复合骨支架及其制备方法。
背景技术
骨或牙齿是人体中最坚硬的结缔组织,以骨为例,随着世界人口的老龄化及意外事故不断增加,骨疾病患者不计其数,与骨有关的临床医学治疗面临着越来越大的压力,尤其是骨修补、骨移植。早在19世纪,骨移植手术开始用来修复大范围的骨缺损。目前,常见的骨修复方法有传统的自体骨移植,同种异体骨移植,人工骨移植。自体骨移植修复虽然治疗效果最佳,但存在对供区破坏、取量不足及并发症等诸多因素的严重制约。异体骨移植面临着免疫排斥反应、疾病传播等问题。20世纪90年代提出了组织工程,随后骨组织工程支架材料的研究得到了快速的发展。生物陶瓷类材料具有生物体骨骼和牙齿的重要组成成分相同的羟基磷灰石,具有优良的生物活性和生物力学强度,但其脆性高、韧性差,不利于新生骨的重塑。合成有机高分子材料来源广、物化性质可调控、优异加工成型性等优点,如聚酯、聚酸酐、聚原酸酯、聚膦腈、聚乳酸,聚羟基乙酸及其共聚物等多种合成高分子,但材料缺乏生物活性,细胞相容性较差,不降解或降解产物影响组织微环境。
天然有机高分子由于具有优异的生物活性在组织工程材料研究中广受青睐,如胶原、明胶、海藻酸盐、透明质酸、壳聚糖、蚕丝蛋白等。与其它天然高分子尤其是蛋白质高分子不同的是:蚕丝由丝素纤维(重量占比70~80%)和外覆的丝胶蛋白(重量占比20~30%)组成,组成独特,蛋白纯度很高,制备方法可以比较简单温和,即可以控制对蚕丝蛋白大分子较小的破坏,不像胶原蛋白等天然高分子纯化复杂、分子量小且分布散、易变性等。丝素蛋白大分子由6条约390kDa的重链和6条约26kDa轻链以二硫键连接,再与另一种约25kDa的糖蛋白/P25疏水作用结合,其中重链具有形成致密结构、高性能材料的序列结构基础。丝胶蛋白的分子量也比较大,丝胶蛋白有9种之多,涉川明朗从组织学角度指出丝胶蛋白分外中内三层,小松计一提出外覆丝胶蛋白由外及内存在4种,即丝胶I、丝胶II、丝胶III和丝胶IV,且由外及内溶解性能越来越低,β构象增加。
丝素蛋白和丝胶蛋白具有优异的细胞、血液和组织相容性以及可控成型,作为组织工程支架材料已在皮肤、血管、骨等组织工程应用中开展了广泛研究。再生丝素蛋白溶液都以强碱弱酸盐或酶脱胶盐溶解获得,这些方法造成了丝素蛋白大分子的破坏;再生丝胶蛋白溶液主要来源于蚕茧,两种溶液一般独立分离制备。如CN02138129.1公开了一种丝素丝胶蛋白复合组织工程支架的制备,复合材料采用预先制备好的再生丝素蛋白与再生丝胶蛋白按比例进行混合再制备而成,其中丝素纤维的脱胶方法采用了强碱弱酸盐溶剂,丝胶蛋白提取的是蚕茧茧丝外覆丝胶的较外层的部分。又如CN201510353363.8公开了一种含丝素蛋白和丝胶蛋白的骨组织工程支架材料及其制备方法,也是分步分别获得再生丝素蛋白与再生丝胶蛋白后再加以混合制备支架材料,其中丝素蛋白的制备没有公开具体工艺条件,丝胶蛋白的获得来自于蚕茧,并经醇等有机溶剂处理。
但上述研究的再生蚕丝(丝素,丝胶)蛋白材料同样力学性能较差,难以满足骨、牙齿等硬组织替换的要求,其问题的关键是现有的脱胶方法和抽提方法对丝素蛋白和丝胶蛋白大分子结构破坏较大,而高分子的聚合度(分子量)是决定高分子性能的极其重要的内在因素。
发明内容
本发明解决的技术问题在于提供一种仿生复合骨架的制备方法,该仿生复合骨架具有高强度和模量。
有鉴于此,本申请提供了一种仿生复合骨支架的制备方法,包括以下步骤:
A)将蚕丝置于温水中进行预处理,再置于65~95℃的水中处理,干燥,得到初处理的蚕丝;
B)将所述初处理的蚕丝在中性盐溶液中处理,将得到的丝素丝胶蛋白复合溶解液再纯化,得到丝素丝胶蛋白复合溶液;
C)将所述丝素丝胶蛋白复合溶液浓缩后冷冻干燥,将得到的初始骨架置于小分子一元醇中处理后冻干,得到仿生复合骨支架。
优选的,所述温水的温度为35~60℃,所述预处理的时间为1~10min。
优选的,步骤A)中,所述置于65~95℃的水中处理的时间为1~8h。
优选的,步骤A)中,所述蚕丝与温水的比例为1g:(40~60)ml,预处理后的蚕丝与水的比例为1g:(40~60)ml。
优选的,步骤A)中,所述预处理之后还包括:将预处理后的蚕丝取出后于25~30℃的水中洗净、脱水;
所述处理后干燥之前还包括:将处理后的蚕丝于25~30℃的水中清洗后脱水;所述干燥采用40~60℃的热风干燥。
优选的,所述中性盐溶液为8~10M的溴化锂水溶液,所述初处理的蚕丝与所述溴化锂水溶液的比例为1g:(20~30)ml。
优选的,步骤B)中,所述处理的温度为50~80℃。
优选的,所述纯化的方法具体为:
将得到的丝素丝胶蛋白复合溶解液灌注于截留分子量10~50kDa的透析袋内,置于去离子水中持续透析1~3天。
优选的,步骤C)中,所述小分子一元醇为浓度为70~80%的乙醇溶液,所述处理的时间为10~60min;所述冷冻干燥的冷冻温度为-10~-80℃,时间为12~36h,干燥的时间为24~72h。
本申请还提供了一种仿生复合骨支架,由丝素丝胶蛋白复合溶液制备得到,所述丝素丝胶蛋白复合溶液的制备方法,包括以下步骤:
A)将蚕丝置于温水中进行预处理,再置于65~95℃的水中处理,干燥,得到初处理的蚕丝;
B)将所述初处理的蚕丝在中性盐溶液中处理,将得到的丝素丝胶蛋白复合溶解液再纯化,得到丝素丝胶蛋白复合溶液。
本申请提供了一种仿生复合骨架的制备方法,采用温和脱胶、一步溶解法制备了丝素丝胶蛋白复合溶液,在温水中的预处理以及后续的特定温度水中的处理,使得蚕丝表面的丝胶蛋白部分脱除或全部脱除,丝胶蛋白的存在增加了复合膜分子链之间的强氢键结合和网络结构,提高了复合骨架的强度和模量,或采用特定温度水中脱胶、丝素纤维后续脱胶过程中丝素蛋白大分子结构得到保护,而使得再生丝素蛋白分子量高以提高复合骨架的强度;丝素纤维外层的丝胶蛋白随着包覆层的由外及内,丝胶蛋白的种类、结构和性能也不同,通过控制脱胶程度,得到了不同组成、力学性能可控的高强高韧丝素蛋白复合三维支架,解决了骨再生修复的天然生物聚合物组织工程三维支架力学性能不足的卡脖子技术难题,且复合支架具有原位快速诱导羟基磷灰石沉积的骨生成活性。
具体实施方式
为了进一步理解本发明,下面结合实施例对本发明优选实施方案进行描述,但是应当理解,这些描述只是为进一步说明本发明的特征和优点,而不是对本发明权利要求的限制。
针对现有技术中,丝素蛋白大分子破坏严重或丝素丝胶复合溶液分别制备而影响丝素丝胶蛋白复合骨架强度和模量的问题,本申请提供了一种仿生复合骨架,该种复合骨架是由丝素丝胶复合溶液制备得到,在丝素丝胶仿生复合骨架制备过程中,采用去离子水温和脱胶、一步溶解法制备了大分子量高粘度丝素丝胶蛋白复合溶液,该方法可以避免丝素纤维大分子的破坏,最终使制备的丝素丝胶蛋白复合溶液中的丝素蛋白具有较高的粘度和大分子量,进而由其制备得到的丝素丝胶仿生复合骨架具有较好的抗压模量和强度。具体的,本发明实施例公开了一种仿生复合骨支架的制备方法,包括以下步骤:
A)将蚕丝置于温水中进行预处理,再置于65~95℃的水中处理,干燥,得到初处理的蚕丝;
B)将所述初处理的蚕丝在中性盐溶液中处理,将得到的丝素丝胶蛋白复合溶解液再纯化,得到丝素丝胶蛋白复合溶液;
C)将所述丝素丝胶蛋白复合溶液浓缩后冷冻干燥,将得到的初始骨架置于小分子一元醇中处理后冻干,得到仿生复合骨支架。
在上述丝素丝胶蛋白仿生复合骨架制备过程中,本申请首先将蚕丝置于温水中进行预处理,再置于65~95℃的水中处理,干燥,即得到初处理的蚕丝;在此过程中,蚕丝的丝胶蛋白全部或部分溶解,而丝素蛋白仍然是纤维状态,若有未溶解的丝胶,则未溶解的丝胶包裹在丝素纤维的外表面,溶解掉的丝胶则存在于水中,呈溶液状态。所述温水的温度为35~60℃,即所述蚕丝可在35℃、40℃、45℃、50℃、55℃或60℃的温水中进行预处理,所述蚕丝与温水的比例为1g:(40~60)ml,更具体地,所述蚕丝与所述温水的比例为1g:42ml、1g:45ml、1g:48ml、1g:52ml、1g:55ml、1g:58ml。所述预处理在上述恒温的温水中进行,所述预处理的时间为1~10min,且上述预处理一直在搅拌中进行,以保证蚕丝可以初步、完全浸渍于水中。在预处理完成后,则将预处理后的蚕丝取出后于25~30℃的去离子水中洗净、脱水。脱水后的蚕丝则在65~95℃的水中处理,更具体地,脱水后的蚕丝可在68℃、70℃、72℃、75℃、78℃、80℃、82℃、84℃、87℃、90℃或93℃的水中处理。本申请蚕丝先在水中预处理再在水中处理的方式,可以在保护丝素蛋白大分子结构不被破坏的同时溶解丝胶蛋白。所述预处理后的蚕丝与水的比例为1g:(40~60)ml,更具体地,所述预处理后的蚕丝与水的比例为1g:42ml、1g:45ml、1g:48ml、1g:50ml、1g:52ml、1g:55ml、1g:58ml或1g:60ml。根据水的不同温度以及时间可以调整蚕丝丝胶蛋白的脱胶率,以实现不同粘度和不同分子量丝素丝胶蛋白复合溶液的制备;在本申请中,所述水中处理的时间优选为1~8h,以使蚕丝部分或全部脱胶;更具体地,所述水中处理的时间为1.5h、2h、2.5h、3h、3.2h、3.6h、4.2h、4.5h、5.0h、5.5h、6.0h、6.5h、6.8h、7.0h或7.5h。在处理之后,则将处理后的蚕丝于25~30℃的水中清洗后脱水、干燥;所述干燥采用40~60℃的热风干燥。蚕丝经过上述处理,得到初处理的蚕丝,该蚕丝仍然呈现纤维状态,实现了丝素蛋白大分子的保护,以利于保证丝素丝胶蛋白的粘度。
按照本发明,然后将初处理的蚕丝在中性盐溶液中处理,纯化,即得到丝素丝胶蛋白复合溶液。在此过程中,将初处理的纤维状的蚕丝溶解,即得到丝素丝胶蛋白复合溶液,此时的蚕丝内芯为丝素纤维,外围包裹有不同含量的丝胶。所述中性盐溶液在本申请中具体选自溴化锂水溶液,其浓度为8~10M,所述初处理的蚕丝与所述溴化锂水溶液的比例为1g:(20~30)ml,更具体地,所述初处理的蚕丝雨所述溴化锂水溶液的比例为1g:22ml、1g:24ml、1g:25ml、1g:27ml或1g:29ml。所述处理的温度具体为50~80℃,更具体地,所述处理的温度具体为52℃、57℃、62℃、65℃、67℃、68℃、72℃、75℃或78℃。
在上述处理之后,则将得到的丝素丝胶溶解液进行纯化,以去除溴化锂和小分子量丝素丝胶蛋白;所述纯化的方式具体为将得到的丝素丝胶蛋白复合溶解液灌注于截留分子量10~50kDa的透析袋内,置于去离子水持续透析1~3天。
本申请最后是利用制备得到的丝素丝胶蛋白复合溶液成骨架的过程,其具体是将丝素丝胶蛋白复合溶液浓缩至一定程度,脱除气泡后于-20~-80℃预冷冻12~48h后再冷冻干燥24~72h,得到的初始复合骨架再置于小分子一元醇溶液中处理10~60min,以使得到的复合骨架不溶于水以及组织液,最后于水中浸泡,恒温恒湿风干,再冻干即得到丝素丝胶蛋白仿生复合骨架;更具体地,所述处理的时间为15min、20min、22min、26min、32min、36min、47min、46min、52min、54min、56min或58min。
本发明采用温和脱胶、一步溶解法制备了丝素丝胶蛋白复合溶液,突破了传统的丝素蛋白和丝胶蛋白分别制备、分别溶解后混合再用于制备复合材料的方法。重要的是,本发明从高分子的分子量这个影响聚合物性能的根本因素出发,提供了高性能再生丝素丝胶蛋白复合材料的制备技术。温和脱胶一步溶解法丝蛋白溶液制备过程中,采用热水法脱胶,使得丝素蛋白大分子链(尤其是重链)在脱胶过程中不会被破坏,该复合材料中丝蛋白分子量集中在150kDa以上的高分子量区域,而报导的常规方法制备的丝素蛋白或丝素与丝胶混合后制备的材料分子量大小呈现连续分布、主要分布在85kDa以下直至15kDa甚至更小,因此本发明提供的丝素蛋白分子量大且分子量分散程度很小,提高了复合三维骨架的强度和模量。丝胶蛋白的存在增加了复合骨架分子链之间的强氢键结合,也提高了复合骨架的强度和模量。丝素纤维外层的丝胶蛋白随着包覆层的由外及内,丝胶的种类、结构和性能(尤其是力学性能)也不同。本发明通过控制脱胶程度,得到了不同组成、力学性能可控的高强高韧丝素丝胶蛋白复合三维支架,解决了骨再生修复的天然生物聚合物组织工程三维支架力学性能不足的卡脖子技术难题,且复合支架具有原位快速诱导羟基磷灰石沉积的骨生成活性。
同时,本申请还提供了一种仿生复合骨支架,由丝素丝胶蛋白复合溶液制备得到,所述丝素丝胶蛋白复合溶液的制备方法,包括以下步骤:
A)将蚕丝置于温水中进行预处理,再置于65~95℃的水中处理,干燥,得到初处理的蚕丝;
B)将所述初处理的蚕丝在中性盐溶液中处理,将得到的丝素丝胶蛋白复合溶解液再纯化,得到丝素丝胶蛋白复合溶液。
上述步骤A)和步骤B)为丝素丝胶蛋白复合溶液制备的过程,此处不进行赘述。本申请所述丝素丝胶蛋白仿生复合骨支架由丝素丝胶蛋白复合溶液制备得到。
为了进一步理解本发明,下面结合实施例对本发明提供的丝素丝胶蛋白复合支架的制备方法进行详细说明,本发明的保护范围不受以下实施例的限制。
实施例1
1.以经过煮茧缫制的家蚕生丝为原料,将家蚕生丝1公斤,按照浴比1:50(g/mL)量取50L去离子预热至60℃,放入生丝恒温60℃搅拌处理1~10分钟,然后取出用25~30℃的去离子将丝洗净、脱水、40~60℃的热风进行干燥;
2.干燥后的蚕丝按照浴比1:50(g/mL)置于90℃预热的去离子水中控制恒温煮3小时,取出含有丝胶的蚕丝用25~30℃的去离子充分清洗干净,脱水后用40~60℃的热风进行干燥;
3.测得蚕丝的脱胶率14%;
4.称取干燥后的蚕丝按1:25(g/mL)的浴比溶解于9.3M的溴化锂水溶液中,65℃处理直至蚕丝完全溶解,得到家蚕丝素丝胶蛋白复合溶解液;
5.将丝素丝胶蛋白复合溶解液灌注于截留分子量为50kDa的透析袋内,透析袋壁是半透膜,将灌注了丝素丝胶蛋白溶解液的透析袋置于盛有去离子水的容器内,每隔2小时用新的去离子水更换容器内的水,持续透析3天,得到纯化后的家蚕丝素丝胶蛋白复合水溶液;
6.采用旋转蒸发器浓缩得50mg/mL的复合溶液,搅拌均匀,去除溶液中的气泡,加入到圆柱形或方形的器皿中,将样品-10~-80℃冷冻12~36h,然后立即放进冷冻干燥机中干燥24~72h,取出后用80%的乙醇溶液浸泡样品20min左右,然后在恒温恒湿间风干得家蚕丝素丝胶蛋白复合支架。
7.使用质构仪测得丝素丝胶蛋白复合支架的抗压强度和抗压模量分别是3.2MPa和101.3MPa。
实施例2
1.以经过煮茧缫制的家蚕生丝为原料,将家蚕生丝1公斤,按照浴比1:50(g/mL)量取50L去离子预热至60℃,放入生丝恒温60℃搅拌处理1~10分钟,然后取出用25~30℃的去离子将丝洗净、脱水、40~60℃的热风进行干燥;
2.干燥后的蚕丝按照浴比1:50(g/mL)置于90℃预热的去离子水中控制恒温煮6小时,取出含有丝胶的蚕丝用25~30℃的去离子充分清洗干净,脱水后用40~60℃的热风进行干燥;
3.测得蚕丝的脱胶率21.8%;
4.称取干燥后的蚕丝按1:25(g/mL)的浴比溶解于9.3M的溴化锂水溶液中,65℃处理直至蚕丝完全溶解,得到家蚕丝素丝胶蛋白复合溶解液;
5.将丝素丝胶蛋白复合溶解液灌注于截留分子量为50kDa的透析袋内,透析袋壁是半透膜,将灌注了丝素丝胶蛋白溶解液的透析袋置于盛有去离子水的容器内,每隔2小时用新的去离子水更换容器内的水,持续透析3天,得到纯化后的家蚕丝素丝胶蛋白复合水溶液;
6.采用旋转蒸发器浓缩得50mg/mL的复合溶液,搅拌均匀,去除溶液中的气泡,加入到圆柱形或方形的器皿中,将样品-10~-80℃冷冻12~36h,然后立即放进冷冻干燥机中干燥24~72h,取出后用80%的乙醇溶液浸泡样品20min左右,然后在恒温恒湿间风干得家蚕丝素丝胶蛋白复合支架。
7.使用质构仪测得丝素丝胶蛋白复合支架的抗压缩强度和抗压模量分别为3.8MPa和115.5MPa。
实施例3
1.以经过煮茧缫制的家蚕生丝为原料,将家蚕生丝1公斤,按照浴比1:50(g/mL)量取50L去离子预热至60℃,放入生丝恒温60℃搅拌处理1~10分钟,然后取出用25~30℃的去离子将丝洗净、脱水、40~60℃的热风进行干燥;
2.干燥后的蚕丝按照浴比1:50(g/mL)置于90℃预热的去离子水中控制恒温煮6小时,取出含有丝胶的蚕丝用25~30℃的去离子充分清洗干净,脱水后用40~60℃的热风进行干燥;
3.测得蚕丝的脱胶率21.8%;
4.称取干燥后的蚕丝按1:25(g/mL)的浴比溶解于9.3M的溴化锂水溶液中,65℃处理直至蚕丝完全溶解,得到家蚕丝素丝胶蛋白复合溶解液;
5.将丝素丝胶蛋白复合溶解液灌注于截留分子量为50kDa的透析袋内,透析袋壁是半透膜,将灌注了丝素丝胶蛋白溶解液的透析袋置于盛有去离子水的容器内,每隔2小时用新的去离子水更换容器内的水,持续透析3天,得到纯化后的家蚕丝素丝胶蛋白复合水溶液;
6.采用旋转蒸发器浓缩得80mg/mL的复合溶液,搅拌均匀,去除溶液中的气泡,加入到圆柱形或方形的器皿中,将样品-10~-80℃冷冻12~36h,然后立即放进冷冻干燥机中干燥24~72h,取出后用80%的乙醇溶液浸泡样品20min左右,然后在恒温恒湿间风干得家蚕丝素丝胶蛋白复合支架。
7.使用质构仪测得丝素丝胶蛋白复合支架的抗压强度和抗压模量分别为5.0MPa和133.7MPa。
比较例1常规纯丝素溶液制备方法
1.以经过煮茧缫制的家蚕生丝为原料,将家蚕生丝按照浴比1:50(g/mL)放入浓度为0.1~0.06%的碳酸钠水溶液中,于98~100℃处理三次,每次处理30分钟,然后用25~30℃的去离子水将丝充分清洗干净,脱水后用40~60℃的热风进行干燥;
2.测得蚕丝的脱胶率23%;
3.称取干燥后的家蚕丝按1:25(g/mL)的浴比溶解于9.3M的溴化锂水溶液中,65℃处理直至蚕丝完全溶解,得家蚕丝素蛋白溶解液;
4.将丝素蛋白溶解液灌注于截留分子量为50kDa的透析袋内,透析袋壁是半透膜,将灌注了丝素蛋白溶解液的透析袋置于盛有去离子水的容器内,每隔2小时用新的去离子水更换容器内的水,持续透析3天,得到纯化后的家蚕丝素蛋白水溶液;
5.采用旋转蒸发器浓缩得80mg/mL的丝素蛋白溶液,搅拌均匀,去除溶液中的气泡,加入到圆柱形或方形的器皿中,将样品-10~-80℃冷冻12~36h,然后立即放进冷冻干燥机中干燥24~72h,取出后用80%的乙醇溶液浸泡样品20min左右,然后在恒温恒湿间风干得家蚕丝素蛋白支架;
6.使用质构仪测得丝素蛋白支架的抗压缩性能:抗压强度1.65MPa,抗压模量40.5MPa。
比较例2常规纯丝素溶液制备方法再与丝胶混合的复合支架
1.以经过煮茧缫制的家蚕生丝为原料,将家蚕生丝按照浴比1:50(g/mL)放入浓度为0.1~0.06%的碳酸钠水溶液中,于98~100℃处理三次,每次处理30分钟,然后用25~30℃的去离子水将丝充分清洗干净,脱水后用40~60℃的热风进行干燥;
2.测得蚕丝的脱胶率23%;
3.称取干燥后的家蚕丝按1:25(g/mL)的浴比溶解于9.3M的溴化锂水溶液中,65℃处理直至蚕丝完全溶解,得家蚕丝素蛋白溶解液;
4.将丝素蛋白溶解液灌注于截留分子量为50kDa的透析袋内,透析袋壁是半透膜,将灌注了丝素蛋白溶解液的透析袋置于盛有去离子水的容器内,每隔2小时用新的去离子水更换容器内的水,持续透析3天,得到纯化后的家蚕丝素蛋白水溶液;
5.另取经过煮茧缫制的家蚕生丝1公斤,按照浴比1:50(g/mL)量取50L去离子水预热至60℃,放入生丝恒温60℃搅拌处理1~10分钟,然后取出用25~30℃的去离子将丝洗净、脱水;
6.脱水后的蚕丝按照浴比1:50(g/mL)置于90℃预热的去离子水中控制恒温煮7小时,弃去纤维,收集丝胶水溶液冷冻干燥得固体丝胶;
7.然后采用旋转蒸发器浓缩步骤4得到的丝素蛋白水溶液、添加与实施例3等同含量、步骤6制备的丝胶、溶解混合均匀,调制丝素丝胶复合溶液浓度80mg/mL,去除溶液中的气泡,加入到圆柱形或方形的器皿中,将样品-10~-80℃冷冻12~36h,然后立即放进冷冻干燥机中干燥24~72h,取出后用80%的乙醇溶液浸泡样品20min左右,然后在恒温恒湿间风干得家蚕丝素蛋白支架。
8.使用质构仪测得丝素蛋白支架的抗压缩性能如下:抗压强度1.4MPa,抗压初始模量33MPa。
以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以对本发明进行若干改进和修饰,这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。
对所公开的实施例的上述说明,使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的,本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下,在其它实施例中实现。因此,本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例,而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
Claims (10)
1.一种仿生复合骨支架的制备方法,包括以下步骤:
A)将蚕丝置于温水中进行预处理,再置于65~95℃的水中处理,干燥,得到初处理的蚕丝;
B)将所述初处理的蚕丝在中性盐溶液中处理,将得到的丝素丝胶蛋白复合溶解液再纯化,得到丝素丝胶蛋白复合溶液;
C)将所述丝素丝胶蛋白复合溶液浓缩后冷冻干燥,将得到的初始骨架置于小分子一元醇中处理后冻干,得到仿生复合骨支架。
2.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,所述温水的温度为35~60℃,所述预处理的时间为1~10min。
3.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,步骤A)中,所述置于65~95℃的水中处理的时间为1~8h。
4.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,步骤A)中,所述蚕丝与温水的比例为1g:(40~60)ml,预处理后的蚕丝与水的比例为1g:(40~60)ml。
5.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,步骤A)中,所述预处理之后还包括:将预处理后的蚕丝取出后于25~30℃的水中洗净、脱水;
所述处理后干燥之前还包括:将处理后的蚕丝于25~30℃的水中清洗后脱水;所述干燥采用40~60℃的热风干燥。
6.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,所述中性盐溶液为8~10M的溴化锂水溶液,所述初处理的蚕丝与所述溴化锂水溶液的比例为1g:(20~30)ml。
7.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,步骤B)中,所述处理的温度为50~80℃。
8.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,所述纯化的方法具体为:
将得到的丝素丝胶蛋白复合溶解液灌注于截留分子量10~50kDa的透析袋内,置于去离子水中持续透析1~3天。
9.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,步骤C)中,所述小分子一元醇为浓度为70~80%的乙醇溶液,所述处理的时间为10~60min;所述冷冻干燥的冷冻温度为-10~-80℃,时间为12~36h,干燥的时间为24~72h。
10.一种仿生复合骨支架,由丝素丝胶蛋白复合溶液制备得到,所述丝素丝胶蛋白复合溶液的制备方法,包括以下步骤:
A)将蚕丝置于温水中进行预处理,再置于65~95℃的水中处理,干燥,得到初处理的蚕丝;
B)将所述初处理的蚕丝在中性盐溶液中处理,将得到的丝素丝胶蛋白复合溶解液再纯化,得到丝素丝胶蛋白复合溶液。
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