EA045448B1 - Способ создания шелкового фиброинового нервного трансплантата, слитого с nt3 - Google Patents
Способ создания шелкового фиброинового нервного трансплантата, слитого с nt3 Download PDFInfo
- Publication number
- EA045448B1 EA045448B1 EA202292044 EA045448B1 EA 045448 B1 EA045448 B1 EA 045448B1 EA 202292044 EA202292044 EA 202292044 EA 045448 B1 EA045448 B1 EA 045448B1
- Authority
- EA
- Eurasian Patent Office
- Prior art keywords
- silk fibroin
- creating
- fused
- solution
- nerve graft
- Prior art date
Links
- 108010022355 Fibroins Proteins 0.000 title claims description 79
- 210000005036 nerve Anatomy 0.000 title claims description 31
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 21
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 claims description 23
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 claims description 23
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 21
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 14
- 108090000742 Neurotrophin 3 Proteins 0.000 claims description 13
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 11
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 10
- 239000000835 fiber Substances 0.000 claims description 10
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 9
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 claims description 9
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 claims description 7
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L Sodium Carbonate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C([O-])=O CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 6
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 claims description 6
- 108010025020 Nerve Growth Factor Proteins 0.000 claims description 5
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 claims description 5
- ZJZXSOKJEJFHCP-UHFFFAOYSA-M lithium;thiocyanate Chemical compound [Li+].[S-]C#N ZJZXSOKJEJFHCP-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 5
- 235000008708 Morus alba Nutrition 0.000 claims description 4
- 240000000249 Morus alba Species 0.000 claims description 4
- 108010013296 Sericins Proteins 0.000 claims description 4
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 4
- 241000672609 Escherichia coli BL21 Species 0.000 claims description 3
- 102000007072 Nerve Growth Factors Human genes 0.000 claims description 3
- 239000003900 neurotrophic factor Substances 0.000 claims description 3
- 229910000029 sodium carbonate Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 claims description 2
- 238000002791 soaking Methods 0.000 claims description 2
- 102100029268 Neurotrophin-3 Human genes 0.000 claims 2
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 claims 1
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 6
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 6
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 5
- 208000028389 Nerve injury Diseases 0.000 description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- 230000008764 nerve damage Effects 0.000 description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 4
- 210000003050 axon Anatomy 0.000 description 3
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 3
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 3
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 3
- 101150108335 FIBL gene Proteins 0.000 description 2
- 102000015336 Nerve Growth Factor Human genes 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 230000001537 neural effect Effects 0.000 description 2
- 230000014511 neuron projection development Effects 0.000 description 2
- 230000000324 neuroprotective effect Effects 0.000 description 2
- 235000003170 nutritional factors Nutrition 0.000 description 2
- 210000000578 peripheral nerve Anatomy 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 2
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 2
- 208000020431 spinal cord injury Diseases 0.000 description 2
- 210000003594 spinal ganglia Anatomy 0.000 description 2
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 2
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 1
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 1
- 102000016942 Elastin Human genes 0.000 description 1
- 108010014258 Elastin Proteins 0.000 description 1
- 102000009123 Fibrin Human genes 0.000 description 1
- 108010073385 Fibrin Proteins 0.000 description 1
- BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N Fibrin monomer Chemical compound CNC(=O)CNC(=O)CN BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150036143 NTF3 gene Proteins 0.000 description 1
- 208000010886 Peripheral nerve injury Diseases 0.000 description 1
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 description 1
- 238000007605 air drying Methods 0.000 description 1
- 229940030225 antihemorrhagics Drugs 0.000 description 1
- 230000003376 axonal effect Effects 0.000 description 1
- 230000000975 bioactive effect Effects 0.000 description 1
- 229920001222 biopolymer Polymers 0.000 description 1
- 208000029028 brain injury Diseases 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000021164 cell adhesion Effects 0.000 description 1
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 210000003169 central nervous system Anatomy 0.000 description 1
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 1
- 239000004020 conductor Substances 0.000 description 1
- 239000003431 cross linking reagent Substances 0.000 description 1
- 238000002425 crystallisation Methods 0.000 description 1
- 230000008025 crystallization Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 238000012377 drug delivery Methods 0.000 description 1
- 229920002549 elastin Polymers 0.000 description 1
- 239000004744 fabric Substances 0.000 description 1
- 229950003499 fibrin Drugs 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- 239000006260 foam Substances 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 239000002874 hemostatic agent Substances 0.000 description 1
- 239000000017 hydrogel Substances 0.000 description 1
- 238000007654 immersion Methods 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 230000008611 intercellular interaction Effects 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 239000002121 nanofiber Substances 0.000 description 1
- 229940053128 nerve growth factor Drugs 0.000 description 1
- 230000004112 neuroprotection Effects 0.000 description 1
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 1
- 210000001428 peripheral nervous system Anatomy 0.000 description 1
- 231100000614 poison Toxicity 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 230000008092 positive effect Effects 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 230000004224 protection Effects 0.000 description 1
- 238000001338 self-assembly Methods 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 210000000278 spinal cord Anatomy 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 239000003356 suture material Substances 0.000 description 1
- 230000000946 synaptic effect Effects 0.000 description 1
- 230000017423 tissue regeneration Effects 0.000 description 1
- 239000002407 tissue scaffold Substances 0.000 description 1
- 239000003440 toxic substance Substances 0.000 description 1
- -1 tubes Substances 0.000 description 1
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 1
Description
Изобретение относится к области биомедицинских материалов, в частности к шелковому фиброиновому нервному трансплантату с NT3-активностью, и может способствовать восстановлению нервов, что может быть применено при восстановлении и регенерации периферических нервов, травмах спинного и головного мозга.
Уровень техники
С развитием тканевой инженерии, биоматериаловедения и других новых дисциплин для восстановления нервов используются все больше и больше биоматериалов. Превосходные биоматериалы должны обладать хорошей биосовместимостью, поддерживать клеточную адгезию, миграцию, межклеточное взаимодействие, пролиферацию и дифференцировку. В то же время эти материалы также нуждаются в соответствующей скорости деградации, механических свойствах и ограниченном иммунном ответе, а также имеют множество вариантов обработки, которые могут изменять структуру и морфологию в соответствии с конкретными потребностями ткани. В качестве компонента натуральной ткани белок является рациональным выбором для приложений тканевой инженерии. Структурные белки, такие как коллаген, эластин, фибриллярный белок, альбумин и фибрин, используются в качестве шовных материалов, тканевых каркасов, гемостатиков и средств доставки лекарств.
Повреждение нерва включает повреждение периферического нерва и повреждение центрального нерва. В настоящее время для лечения отдаленных повреждений периферических нервов и повреждений спинного мозга часто требуется использование различных типов трансплантатов. Из-за отсутствия источников и ограниченной области применения начинают искать новые заменители тканеинженерных трансплантатов. Протеин шелка является распространенным природным биополимерным материалом, который имеет долгую историю применения в организме человека в качестве шовного материала. В последние годы он постепенно привлекает внимание людей как биоматериал благодаря некоторым своим характеристикам. По сравнению с другими биоматериалами на основе белков из тех же или гетерогенных исходных тканей, фиброин шелка имеет несколько основных преимуществ: хорошую биосовместимость, отличные механические свойства, контролируемую биоразлагаемость, простую технологию обработки и др. В то же время полимеры фиброина шелка проявляют различную пластичность при обработке. Благодаря изменениям в технологии производства можно получить различные конфигурации матриц, включая трехмерную пористую пену, нановолокна, гидрогели, трубки и пленки, которые можно применять для восстановления различных тканей. Нейротрофический фактор 3 представляет собой белок, кодируемый геном NTF3. Это важный член семейства факторов роста нервов. Он способен питать нейроны периферической и центральной нервной системы. Он может не только способствовать выживанию существующих нейронов, но также выживанию и дифференцировке новообразованных нейронов и синаптических связей.
В настоящее время функция каркасов тканевой инженерии, построенных только из фиброина шелка, является относительно единственной, а роль содействия восстановлению нервной ткани относительно ограничена. Было изучено, что нервные трансплантаты могут быть пропитаны питательными факторами (такими как NGF) или лиофилизированы после смешивания с фиброином шелка для формирования проводников, что оказывает хороший эффект на стимулирование роста нервов на ранней стадии, однако этот эффект будет постепенно ослабевают с увеличением времени. В то же время нестабильность факторов питания в организме и ограниченность источников сильно ограничивают их использование.
Суть изобретения
Стремясь устранить недостатки предшествующего уровня техники, изобретение объединяет активный пептид нейропротекторного фактора 3 (NT-3) с пептидом легкой цепи фиброина шелка с образованием слитого белка. На основе слитого белка осуществляется самосборка фиброина шелка и получается новый тип нервного трансплантата, способный не только обеспечить хорошую механическую поддержку, но и стабильно длительное время выполнять нейропротекторную функцию.
Техническая схема настоящего изобретения выглядит следующим образом.
Способ создания шелкового фиброинового нервного трансплантата, слитого с NT3, включающий следующие этапы:
синтезировать фрагмента гена, содержащего легкую цепь фиброина шелка и NT-3, соединить его с вектором экспрессии pET-30 и перенести полученный рекомбинантный вектор экспрессии в кишечную палочку BL21 для получения слитого белка;
слитый белок и раствор фиброина шелка смешать для получения раствора смешанного белка, шелковую фиброиновую сеть поместить в форму, раствор смешанного белка залить в форму для лиофилизации и формирования нервного канала; после денатурации получают конечный продукт с активностью NT-3 из шелковых фиброиновых нервных трансплантатов. Далее, из фиброина шелка на ткацком станке ткут шелковую фиброиновую сеть.
Далее, способ создания раствора шелкового фиброина заключается в следующем: шелковое фиброиновое волокно помещают в раствор тиоцианата лития для растворения, а растворенный раствор помещают в мешок для диализа и подвергают диализу с тройной дистиллированной водой в качестве диализата в течение 60-80 часов для получения раствора фиброина шелка.
- 1 045448
Далее способ создания шелкового фиброина заключается в следующем: тутовый шелк помещают в раствор карбоната натрия и кипятят без в течение менее 20 мин, его полностью промывают тройной дистиллированной водой, и этот этап повторяют от 2 до 4 раз для получения волокон фиброина шелка с удаленным наружным серицином.
Далее, концентрация раствора слитого белка и шелкового фиброина составляет 5-40%, массовое соотношение слитого белка и шелкового фиброина составляет 1:99-50:50.
Далее, деформационная обработка заключается в погружении в 60%-ый этанол на 10-14 ч.
Далее, молекулярная масса диализного мешка составляет 12-16 кДа.
Далее температура лиофилизации составляет -70°C.
Далее, концентрация раствора тиоцианата лития составляет 9 моль/л.
Настоящее изобретение также относится к шелковому фиброиновому нервному трансплантату, слитому с NT3, который получают описанным выше способом.
Положительные эффекты.
В предшествующем уровне техники в основном используется метод адсорбции нейротрофического фактора или ковалентного соединения с каркасом. В настоящем изобретении используется биоактивный фрагмент NT-3 и фиброина легкой цепи шелка для одновременной экспрессии в слитом белке. Слитый белок является эффективным компонентом слияния NT-3 с фиброином шелка в качестве основного тела и может фиксироваться в шелковом катетере с фиброином шелка. Он может играть роль нейропротекции и регенерации нервов в течение длительного времени без изменения состава фиброина шелка.
Основным материалом, используемым в настоящем изобретении, является шелковый фиброин, дополненный легкой цепью шелкового фиброина, слитой с активным пептидным сегментом NT-3. В процессе обработки токсичные вещества и вещества с побочными эффектами, такие как сшивающий агент и поверхностно-активное вещество, не добавляются, поэтому он обладает хорошей биосовместимостью.
Когда слитый белок шелкового фиброина согласно настоящему изобретению совместно культивируют in vitro с клетками нервной ткани, он проявляет очевидный стимулирующий рост эффект посредством морфологического наблюдения и определения экспрессии факторов, родственных NT-3, среди которых FIBL-NT3-L-NT3 самый активный.
Катетер из шелкового фиброина, описанный в изобретении, вводит легкую цепь шелкового фиброина, слитую с сегментом функционального пептида NT-3, перед кристаллизацией шелкового фиброина. Следовательно, в процессе самосборки шелкового фиброина активный полипептид NT-3 будет фиксироваться в катетере шелкового фиброина вместе с легкой цепью шелкового фиброина, что может играть роль защиты нерва и регенерации нерва в течение длительного времени, в то же время пропорцию активного пептида NT-3 в нервном канале можно регулировать в соответствии с реальной ситуацией, что способствует восстановлению повреждения нерва.
Описание прилагаемых чертежей
На фиг. 1 показано влияние различных конструкций слитых белков, содержащих NT3, на рост нейритов нейронов ганглия дорзальных корешков, культивируемых in vitro.
На фиг. 2 показано влияние различных конструкций слитых белков, содержащих NT3, на рост нейритов нейронов ганглия дорзальных корешков, культивируемых in vitro.
Конкретные варианты осуществления
Пример 1.
Способ создания шелкового фиброинового нервного трансплантата, слитого с NT3, включающий следующие этапы.
1. Экспрессия и очистка слитого белка шелкового фиброина: создание рекомбинантного вектора экспрессии, экспрессия целевого белка и его очистка.
2. Получение волокна шелкового фиброина: взять шелк-сырец из шелка шелковицы, удалить серицин и получить волокно шелкового фиброина.
3. Приготовление раствора шелкового фиброина.
4. Подготовка шелковой фиброиновой сети.
5. Поместить шелковую фиброиновую сеть в форму, перемешать белковый раствор, полученный на этапах 1 и 3, и переместить в форму. Лиофилизировать шелковый фиброин для самосборки и формирования нервного канала.
Пример 2.
Способ создания шелкового фиброинового нервного трансплантата, слитого с NT3, включающий следующие этапы.
1. Конструирование рекомбинантного вектора экспрессии: синтезировать фрагмент гена, содержащий легкую цепь шелкового фиброина и NT-3, соединить его с вектором экспрессии pET-30 и завершить конструирование рекомбинантного вектора экспрессии. Различные последовательности слитых белков, содержащие tag и linker, следующие.
Последовательность слитого белка (включая N-концевой His и гибкий Linker):
- 2 045448
Длина белка FIBL=253 MW=26898,8 pI=6,10
MHHHHHHAPSVTINQYSDNEIPRDIDDGKASSVISRAWDYVDDTDKSI AILNVQEILKDMASQGDYASQASAVAQTAGIIAHLSAGIPGDACAAANVINS YTDGVRSGNFAGFRQSLGPFFGHVGQNLNLINQLVINPGQLRYSVGPALGC AGGGRIYDFEAAWDAILASSDSSFLNEEYCIVKRLYNSRNSQSNNIAAYITAH LLPPVAQVFHQSAGSITDLLRGVGNG NDATGLVANAQRYIAQAASQVHV
Длина белка FIBL-NT3=372 MW=40503,7 pl=7,39
MHHHHHHAPSVTINQYSDNEIPRDIDDGKASSVISRAWDYVDDTDKSI AILNVQEILKDMASQGDYASQASAVAQTAGIIAHLSAGIPGDACAAANVINS YTDGVRSGNFAGFRQSLGPFFGHVGQNLNLINQLVINPGQLRYSVGPALGC AGGGRIYDFEAAWDAILASSDSSFLNEEYCIVKRLYNSRNSQSNNIAAYITAH LLPPVAQVFHQSAGSITDLLRGVGNGNDATGLVANAQRYIAQAASQVHVYA EHKSHRGEYSVCDSESLWVTDKSSAIDIRGHQVTVLGEIKTGNSPVKQYFYE TRCKEARPVKNGCRGIDDKHWNSQCKTSQTYVRALTSENNKLVGWRWIRI DTSCVCALSRKIGRT
FIBL-linker-NT3 Длина белка=382 MW=41134,1 pl=7,39
MHHHHHHAPSVTINQYSDNEIPRDIDDGKASSVISRAWDYVDDTDKSI AILNVQEILKDMASQGDYASQASAVAQTAGIIAHLSAGIPGDACAAANVINS YTDGVRSGNFAGFRQSLGPFFGHVGQNLNLINQLVINPGQLRYSVGPALGC AGGGRIYDFEAAWDAILASSDSSFLNEEYCIVKRLYNSRNSQSNNIAAYITAH LLPPVAQVFHQSAGSITDLLRGVGNGNDATGLVANAQRYIAQAASQVHVGG GGSGGGGSYAEHKSHRGEYSVCDSESLWVTDKSSAIDIRGHQVTVLGEIKT GNSPVKQYFYETRCKEARPVKNGCRGIDDKHWNSQCKTSQTYVRALTSEN NKLVGWRWIRIDTS CVCALSRKIG RT
FIBL- (NT3) 2 Длина белка=501 MW=54739,0 pl=8,28
MHHHHHHAPSVTINQYSDNEIPRDIDDGKASSVISRAWDYVDDTDKSI AILNVQEILKDMASQGDYASQASAVAQTAGIIAHLSAGIPGDACAAANVINS YTDGVRSGNFAGFRQSLGPFFGHVGQNLNLINQLVINPGQLRYSVGPALGC AGGGRIYDFEAAWDAILASSDSSFLNEEYCIVKRLYNSRNSQSNNIAAYITAH LLPPVAQVFHQSAGSITDLLRGVGNGNDATGLVANAQRYIAQAASQVHVYA EHKSHRGEYSVCDSESLWVTDKSSAIDIRGHQVTVLGEIKTGNSPVKQYFYE TRCKEARPVKNGCRGIDDKHWNSQCKTSQTYVRALTSENNKLVGWRWIRI DTSCVCALSRKIGRTGGGGSGGGGSYAEHKSHRGEYSVCDSESLWVTDKSS AIDIRGHQVTVLGEIKTGNSPVKQYFYETRCKEARPVKNGCRGIDDKHWNS QCKTSQTYVRALTSENNKLVGWRWIRIDTSCVCALSRKIGRT
2. Экспрессия и очистка слитого белка: перенос рекомбинантного вектора экспрессии, полученного на этапе 1, в кишечную палочку BL21, индукция экспрессии при 37°C и разрушение ее ультразвуком. Очистка слитого белка с помощью Ni NTA и его идентификация, чтобы получить слитый белок.
3. Взять соответствующее количество шелка тутового дерева и кипятят его в 0,2% растворе карбоната натрия в течение 30 мин. После извлечения полностью промыть его тройной дистиллированной водой. Повторить этот шаг три раза, чтобы получить шелковое фиброиновое волокно с удаленным внешним серицином, и поместить его в ультрачистый стол для просушки в режиме ожидания.
4. Поместите шелковое фиброиновое волокно в 9М раствор тиоцианата лития для растворения, поместите растворенный раствор в мешок для диализа (остаточная молекулярная масса составляет около 14 кДа) и диализировать тройной дистиллированной водой в качестве диализата в течение 72 часов для получения раствора шелкового фиброина.
5. Шелковое фиброиновое волокно, полученное на этапе 3, вплетают в шелковую фиброиновую сеть с помощью ткацкого станка.
- 3 045448
6. Смешать слитый белок, полученный на этапе 2, и раствор шелкового фиброина, полученный на этапе 4, в определенной пропорции, чтобы получить раствор смешанного белка. Настроить концентрацию смешанного белкового раствора на 5-40%, а массовое соотношение слитого белка и шелкового фиброина - 1:99-50:50. Поместить полотно из шелковой фиброиновой сети, полученной на этапе 5, в форму, залить раствор смешанного белка в форму и лиофилизировать его при температуре -70°C, шелковый фиброин, слитые белки и шелковая фиброиновая сеть перекрестно связываются, образуя нервные каналы.
7. Замачивание в 60% этаноле для деформационной обработки в течение 12 ч, промывание тройной дистиллированной водой и сушка на воздухе, и наконец, получение шелковых фиброиновых нервных трансплантатов с активностью NT-3.
Чертеж (фиг. 1) и статистическая диаграмма (фиг. 2). Фиброин, слитый с NT-3, FIBL, FIBL-NT3, FIBL-linker-NT3, FIBL-(NT3)2 способствует росту аксонов DRG. Статистические данные получают из среднего значения длины аксонов 30 нейронов в каждой группе. Из чертежей видно, что по сравнению с контрольной группой NT3 может способствовать росту аксонов клеток, а FIBL-NT3, FIBL-linker-NT3, FIBL-(NT3) могут более эффективно способствовать росту аксонов.
Claims (9)
1. Способ создания шелкового фиброинового нервного трансплантата, слитого с нейротрофическим фактором 3 (NT3), отличающийся тем, что включает следующие этапы:
синтез фрагмента гена, содержащего легкую цепь фиброина шелка и NT-3, соединение его с вектором экспрессии pET-30 и перенос полученного рекомбинантного вектора экспрессии в кишечную палочку BL21 для получения слитого белка;
затем слитый белок и раствор фиброина шелка смешивают для получения раствора смешанного белка, шелковую фиброиновую сеть помещают в форму, раствор смешанного белка заливают в форму для лиофилизации и формирования нервного канала; выполняют деформационную обработку и получают шелковые фиброиновые нервные трансплантаты с активностью NT-3.
2. Способ создания шелкового фиброинового нервного трансплантата, слитого с NT3, по п.1, отличающийся тем, что шелковая фиброиновая сеть соткана из шелкового фиброина на ткацком станке.
3. Способ создания шелкового фиброинового нервного трансплантата, слитого с NT3, по п.1, отличающийся тем, что способ создания описанного раствора шелкового фиброина заключается в следующем: шелковое фиброиновое волокно помещают в раствор тиоцианата лития для растворения, а полученный раствор помещают в мешок для диализа и подвергают диализу в тройной дистиллированной воде в течение 60-80 ч для получения раствора фиброина шелка.
4. Способ создания шелкового фиброинового нервного трансплантата, слитого с NT3, по п.2 или 3, отличающийся тем, что способ создания описанного шелкового фиброинового волокна заключается в следующем: тутовый шелк помещают в раствор карбоната натрия и кипятят в течение менее 20 мин, его полностью промывают тройной дистиллированной водой, и этот этап повторяют от 2 до 4 раз для получения волокон фиброина шелка с удаленным наружным серицином.
5. Способ создания шелкового фиброинового нервного трансплантата, слитого с NT3, по п.1, отличающийся тем, что концентрация белка в смешанном белковом растворе составляет 5-40%; массовое соотношение слитого белка и фиброина шелка составляет 1:99~50:50.
6. Способ создания шелкового фиброинового нервного трансплантата, слитого с NT3, по п.1, отличающийся тем, что деформационную обработку проводят замачиванием в 60% этаноле и выдержкой 1014 ч.
7. Способ создания шелкового фиброинового нервного трансплантата, слитого с NT3, по п.3, отличающийся тем, что у мешка для диализа молекулярная масса перехвата составляет 12-16 кДа.
8. Способ создания шелкового фиброинового нервного трансплантата, слитого с NT3, по п.1, отличающийся тем, что температура лиофилизации составляет -70°C.
9. Способ создания шелкового фиброинового нервного трансплантата, слитого с NT3, по п.1, отличающийся тем, что концентрация раствора тиоцианата лития составляет 9 моль/л.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202010396807.7 | 2020-05-12 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| EA045448B1 true EA045448B1 (ru) | 2023-11-27 |
Family
ID=
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN107998450B (zh) | 人工皮肤及人工皮肤的制备方法和应用 | |
| Hernández‐Rangel et al. | Collagen based electrospun materials for skin wounds treatment | |
| Kapoor et al. | Silk protein-based hydrogels: Promising advanced materials for biomedical applications | |
| US8071722B2 (en) | Silk biomaterials and methods of use thereof | |
| Hu et al. | Biocompatible fibroin blended films with recombinant human-like collagen for hepatic tissue engineering | |
| JP4463702B2 (ja) | 伸縮性コラーゲン成形体、その製造方法および用途 | |
| Li et al. | Silk fibroin scaffolds with a micro-/nano-fibrous architecture for dermal regeneration | |
| CN111821514B (zh) | 一种丝素丝胶蛋白复合膜及其制备方法 | |
| Bakhshandeh et al. | A review on advances in the applications of spider silk in biomedical issues | |
| WO2004001103A2 (en) | Silk biomaterials and methods of use thereof | |
| CN106039416A (zh) | 壳聚糖—丝胶蛋白复合生物支架及其制备方法和应用 | |
| WO2021227255A1 (zh) | 一种融合有nt3的丝素蛋白神经移植物的制备方法 | |
| CN111671980B (zh) | 一种仿生复合骨支架及其制备方法 | |
| Dong et al. | Electrospun nanofibrous membranes of recombinant human collagen type III promote cutaneous wound healing | |
| Mohammadzadehmoghadam et al. | Electrospinning of silk fibroin-based nanofibers and their applications in tissue engineering | |
| Monzack et al. | Natural materials in tissue engineering applications | |
| EA045448B1 (ru) | Способ создания шелкового фиброинового нервного трансплантата, слитого с nt3 | |
| US20130230573A1 (en) | Collagen structures and method of fabricating the same | |
| Das et al. | Silk fiber composites in biomedical applications | |
| Wang et al. | Degradable allyl Antheraea pernyi silk fibroin thermoresponsive hydrogels to support cell adhesion and growth | |
| CN111777685A (zh) | 一种融合有vegf的丝素蛋白移植物及其制备方法 | |
| CN105079877B (zh) | 丝素蛋白牙周补片及其制备方法 | |
| CN114591419B (zh) | 一种热水解蛋白及其制备方法和应用 | |
| CN117100840A (zh) | 丝素融合蛋白在制备皮肤损伤外用产品中的应用 | |
| Sokolova et al. | The Relation of Biological Properties of the Silk Fibroin/Gelatin Scaffolds with the Composition and Fabrication Technology |