CN110615913B - 一种丝蛋白多孔海绵及其制备方法 - Google Patents

一种丝蛋白多孔海绵及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种丝蛋白多孔海绵的制备方法，包括以下步骤：将丝蛋白水溶液置于酸蒸汽中处理；然后将处理后的丝蛋白水溶液进行冷冻，得到丝蛋白冷冻体；最后通过冻干工艺制备出易于保存的干态丝蛋白多孔海绵。可以通过调节丝蛋白溶液浓度、冷冻温度、酸蒸汽处理时间等工艺参数控制多孔材料的孔径、孔隙率、聚集态结构、力学性能、降解性能等。本方法制备的丝蛋白海绵具有完整且均匀的多孔结构、较高的孔隙率、良好的可塑性、结构可调，是优异的生物支架。

Description

一种丝蛋白多孔海绵及其制备方法
技术领域
本发明涉及生物材料技术领域，尤其涉及一种丝蛋白多孔海绵及其制备方法。
背景技术
由于疾病和事故导致的器官或组织损伤和功能缺失的病人每年都有数百万之多，仅美国每年需要800多万次手术对这类病人进行救治，其经济花费在4000亿美元以上。随着现代医学和外科手术技术的发展，通过组织或器官移植来修复功能损失已经被广泛接受，然而却面临着巨大的供体缺口。通过再生医学手段体在体内或体外形成组织或器官为受损功能的修复提供了新的治疗方案。其中，组织工程支架材料的选择及构建成为该治疗方法的关键之一。
丝蛋白是来源于自然界的天然高分子生物材料，具有优异的力学性质、可控的生物降解性、易加工性，特别是其与胶原同等的生物相容性而成为理想的再生医学支架的原材料。我国是蚕丝的主要生产国，蚕丝产量占世界产量的70％以上。近年来，蚕丝的研究与应用从传统的纺织领域延伸到高新技术领域，如光电子与生物医用材料，特别是作为生物医用材料已经取得了重要进展。
作为生物医用材料，丝蛋白材料的降解性能及其与组织再生的匹配对其应用有重要影响。结晶结构是决定丝蛋白降解性能的关键因素之一。丝蛋白分无定形结构、丝素I和丝素II结晶三种结构。一般来讲，无定形结构的丝蛋白水溶性高、降解快，目前很难制备出低结晶不溶于水的丝蛋白材料；丝素I结构的丝蛋白材料可以通过自组装或水蒸汽后处理制得，但工艺较为复杂、调控困难；丝素II结构的丝蛋白材料最容易制备，如醇溶液共混、醇溶液后处理。由此看出，目前丝蛋白多孔材料的制备工艺面临无定形结构材料难以制取，丝素I材料制取困难的技术难题；此外，丝蛋白多孔材料还缺少降解快且以无定形结构为主的低结晶丝蛋白多孔支架。CN201710115123.3-公开了一种丝素蛋白纤维支架及其制备方法，采用酸溶液分散天然丝蛋白纤维，进而结合冷冻干燥技术制备丝素蛋白纤维支架，该方法所制备的支架由天然丝蛋白纤维组成，主要为β-折叠结晶结构。
为此，克服现有加工技术与丝蛋白多孔支架结构的上述问题，开发一种快速制备丝蛋白海绵，具有多孔结构均匀且能够调控丝蛋白结晶结构的方法，对丝蛋白在生物医用材料领域的应用及再生医学的临床应用都具有重要的意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种丝蛋白多孔海绵的制备方法，及由该方法制取的丝蛋白多孔海绵，该海绵不溶于水、多孔结构完整均匀、结晶结构易调。
本发明提供的一种制备丝蛋白多孔海绵的制备方法，包括以下步骤：
A)调整新鲜丝蛋白溶液浓度，然后将其置于酸蒸汽中处理；
B)将处理后的丝蛋白溶液进行冷冻得到丝蛋白溶液冷冻体；
C)将丝蛋白溶液冷冻体进行解冻，得到湿态丝蛋白海绵；
D)将湿态丝蛋白海绵进行冻干，得到丝蛋白多孔海绵。
进一步地，步骤A)中，所述丝蛋白水溶液的浓度为0.1～10wt％。优选地，丝素蛋白的水溶液浓度为0.5～5wt％。更优选地，丝素蛋白的水溶液浓度为1～3wt％。
进一步地，步骤A)中，所述酸蒸汽来源于盐酸、甲酸、乙酸、三氟乙酸和碳酸中的一种或几种。优选地，所述酸蒸汽来源于甲酸或乙酸。本发明采用的酸蒸汽预处理，具有两大特点：一是促使丝蛋白分子发生缠绕与纠缠，并于溶液中均匀分布，再经冻-融得到良好孔结构的多孔海绵，避免直接冷冻造成的丝蛋白溶液直接相分离所产生的片层结构；二是诱导丝蛋白构象发生不同程度的转变，调节酸蒸汽处理时间得到不同聚集态结构的丝蛋白海绵，特别是得到新型的低晶丝蛋白海绵。
进一步地，步骤A)中，所述酸蒸汽所使用的酸溶液的浓度为0.1～98wt％。优选地，酸溶液的浓度为10～98wt％。更优选地，酸溶液的浓度为50～98wt％。
进一步地，步骤A)中，所述酸蒸汽处理时间为0.1～1200min。优选地，酸蒸汽处理时间为1～600min。更优选地，酸蒸汽处理时间为1～120min。
当在酸蒸汽中处理1～5min时，得到丝蛋白多孔海绵主要为无定形结构。
当在酸蒸汽中处理5～30min时，得到丝蛋白多孔海绵主要为silkI结构。
当在酸蒸汽中处理高于30～60min时，得到丝蛋白多孔海绵主要为silkI与silkII并存结构。
当在酸蒸汽中处理高于60min时，得到丝蛋白多孔海绵主要为silkII结构。
进一步地，步骤B)中，所述冷冻温度为-4～80℃，冷冻处理时间为1～48h。优选地，冷冻温度为-4～40℃，冷冻处理时间为6～24h。更优选地，冷冻温度为-4～20℃，冷冻处理时间为6～12h。
进一步地，步骤C)中，所述解冻温度为0～60℃。优选地，解冻温度为24～37℃。
进一步地，步骤C)中，在空气或水中进行解冻。优选地，在水中进行解冻。本发明利用冷冻结冰过程促使相分离的发生；再然后将丝蛋白冷冻体解冻，利用冰核的融化，形成结构均匀的三维多孔海绵。
进一步地，步骤C)中，解冻后，在水中漂洗去除酸蒸汽，得到湿态丝蛋白支架。
进一步地，步骤D)中，所述冻干温度为-4～80℃，冻干时间为24～72h。优选地，冻干温度为-40～80℃，冻干时间为48～72h。本发明通过冻干工艺制备出易于保存的干态丝蛋白多孔海绵。
本发明的方法原理如下：丝蛋白的分子结构主要为无定形结构、丝素I和丝素II，一般认为无定形结构丝素易溶于水，只有丝素I和丝素II结构的丝蛋白材料才具有应用价值。本发明选用无定形丝蛋白水溶液，然后对该溶液进行酸蒸汽处理，在短时间即可促使丝蛋白分子发生低度聚集缠绕，随着时间延长，丝蛋白分子发生结晶形成丝素I并进一步形成丝素II结晶。因此，通过选择不同的酸蒸汽处理时间，可以轻易制取无定形为主，或丝素I为主，或丝素I和丝素II共存，或丝素II为主的再生丝蛋白多孔支架，由此制备出具有不同结晶度的丝蛋白多孔支架。本发明中，采用酸蒸汽处理丝蛋白溶液可实现本发明的技术目的，但是采用酸溶液与丝蛋白溶液共混的方法难以实现本发明的技术目的，原因是丝蛋白溶液对溶液PH值极为敏感，在酸性条件下极易发生凝胶，因此直接将酸溶液与丝蛋白溶液共混会立即生成凝胶而非形成多孔海绵。
本发明可以通过调节丝蛋白溶液浓度、冷冻温度、酸蒸汽处理时间等工艺参数控制多孔材料的孔径、孔隙率、聚集态结构、力学性能、降解性能等。制备过程无需加入任何交联剂或有机溶剂后处理，仅需微量酸蒸汽的渗透即可实现水不溶丝蛋白多孔海绵的直接获取，制备工艺简单易行。
本发明还提供一种采用上述制备方法所制备的丝蛋白多孔海绵。该海绵不溶于水，具有均匀的多孔结构。孔径为50～1000μm，孔隙率大于80％。该海绵具有可调控的聚集态结构，主要分为以下四种：无定形结构为主、丝素I结构为主、丝素I与丝素II并存结构、丝素II结构为主。本方法制备的丝蛋白海绵具有完整且均匀的多孔结构、较高的孔隙率、良好的可塑性、结构可调，是优异的生物支架。
借由上述方案，本发明至少具有以下优点：
与现有技术相比，本发明应用酸蒸汽对丝蛋白溶液进行蒸汽处理，再经冷冻与解冻处理即可以得到不溶于水的多种丝蛋白多孔支架，重要的是酸蒸汽处理过程中丝蛋白溶液被均匀化处理，经冷冻得到了三维结构均匀的多孔材料，更重要的是酸蒸汽处理可以获得不溶于水的无定形、丝素I丝素II共存、以丝素I或丝素II为主的四种不同分子结构的丝蛋白多孔海绵。由此看出，本发明制备方法不仅简单易于操作、易于量产，而且获得了多孔结构均匀与聚集态结构可调控的丝蛋白多孔海绵，拓宽了不同结构丝蛋白生物材料，为其应用提供了有利技术支撑。
上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合附图详细说明如后。
附图说明
图1为实施例一中丝蛋白水溶液与酸蒸汽处理后丝蛋白水溶液的照片图以及冻干丝蛋白多孔支架的扫描电镜图。
图2为实施例一制得的丝蛋白多孔支架的红外谱图和X-衍射图。
图3为实施例二制得的丝蛋白多孔支架的红外谱图。
图4为实施例三制得的丝蛋白多孔支架的红外谱图。
图5为实施例四制得的丝蛋白多孔支架的红外谱图。
图6为对比例一制得的丝蛋白多孔支架的红外谱图。
图7为对比例二制得的丝蛋白多孔支架的X-衍射图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
以下实施例中，如无特殊说明，“浓度”均为质量百分浓度。
实施例一
将10g左右生丝浸入0.5L0.5％Na2CO3溶液中，搅拌煮沸60分钟后取出，用去离子水洗涤干净。重复以上操作两次后将蚕丝60℃下烘干。
称取上述处理后的脱胶蚕丝5g溶解于30mL浓度为9.8mol/L的LiBr溶液中，60℃下搅拌溶解一个小时。然后用截留分子量为3500的透析袋，用去离子水透析3天，得到浓度为6％的丝蛋白水溶液，进一步调节丝蛋白水溶液浓度为2％。
取上述丝蛋白溶液10mL倒入聚乙烯皿中，并置于98％甲酸蒸汽中处理1分钟，然后放入-20℃下冷冻6小时。将丝蛋白冷冻体放入去离子水中解冻1h，再用去离子水漂洗三次，得到不溶性的丝蛋白多孔支架，再次冷冻干燥即得到无定形为主的丝蛋白多孔支架。
图1A、B分别为实施例一中丝蛋白水溶液与酸蒸汽处理后丝蛋白水溶液的照片图。可以看出，新鲜丝蛋白溶液为透明状，甲酸蒸汽处理后转变为乳白色半透明状。图1C表明，本实施例的方法使得溶液在冷冻干燥后形成多孔结构。
对上述丝蛋白多孔支架进行红外和X-射线衍射测试，结果图2A、B所示。从图2中可见，丝蛋白的红外吸收峰位于1638cm-1，这是无定形结构的特征峰，X-衍射图谱显示丝蛋白无明显结晶衍射峰，证实了红外谱图结构，红外与X-衍射结果说明该丝蛋白多孔支架主要为无定形结构。
实施例二
将10g左右生丝浸入0.5L0.5％Na2CO3溶液中，搅拌煮沸60分钟后取出，用去离子水洗涤干净。重复以上操作两次后将蚕丝60℃下烘干。
称取上述处理后的脱胶蚕丝5g溶解于30mL浓度为9.8mol/L的LiBr溶液中，60℃下搅拌溶解一个小时。然后用截留分子量为3500的透析袋，用去离子水透析3天，得到浓度为6％的丝蛋白水溶液，进一步调节丝蛋白水溶液浓度为2％。
取上述丝蛋白溶液10mL倒入聚乙烯皿中，并置于98％甲酸蒸汽中处理30分钟，然后放入-20℃下冷冻6小时。将丝蛋白冷冻体放入去离子水中解冻1h，再用去离子水漂洗三次，得到不溶性的丝蛋白多孔支架，再次冷冻干燥即得到丝素I结构为主的丝蛋白多孔支架。
对上述丝蛋白多孔支架进行红外测试。图3显示实施例二条件下制备的丝蛋白的红外吸收峰位于1652cm-1，这是丝素I结构的特征峰，所以丝蛋白多孔支架主要丝素I结晶结构。
实施例三
将10g左右生丝浸入0.5L0.5％Na2CO3溶液中，搅拌煮沸60分钟后取出，用去离子水洗涤干净。重复以上操作两次后将蚕丝60℃下烘干。
称取上述处理后的脱胶蚕丝5g溶解于30mL浓度为9.8mol/L的LiBr溶液中，60℃下搅拌溶解一个小时。然后用截留分子量为3500的透析袋，用去离子水透析3天，得到浓度为6％的丝蛋白水溶液，进一步调节丝蛋白水溶液浓度为2％。
取上述丝蛋白溶液10mL倒入聚乙烯皿中，并置于98％甲酸蒸汽中处理60分钟，然后放入-20℃下冷冻6小时。将丝蛋白冷冻体放入去离子水中解冻1h，再用去离子水漂洗三次，得到不溶性的丝蛋白多孔支架，再次冷冻干燥即得到丝素I与丝素II结构并存的丝蛋白多孔支架。
对上述丝蛋白多孔支架进行红外测试。图4显示实施例三条件下制备的丝蛋白的红外吸收峰位于1630和1650cm-1，这是丝素II和丝素I结构的特征峰，所以丝蛋白多孔支架为丝素I与丝素II结构并存。
实施例四
将10g左右生丝浸入0.5L0.5％Na2CO3溶液中，搅拌煮沸60分钟后取出，用去离子水洗涤干净。重复以上操作两次后将蚕丝60℃下烘干。
称取上述处理后的脱胶蚕丝5g溶解于30mL浓度为9.8mol/L的LiBr溶液中，60℃下搅拌溶解一个小时。然后用截留分子量为3500的透析袋，用去离子水透析3天，得到浓度为6％的丝蛋白水溶液，进一步调节丝蛋白水溶液浓度为2％。
取上述丝蛋白溶液10mL倒入聚乙烯皿中，并置于98％甲酸蒸汽中处理120分钟，然后放入-20℃下冷冻6小时。将丝蛋白冷冻体放入去离子水中解冻1h，再用去离子水漂洗三次，得到不溶性的丝蛋白多孔支架，再次冷冻干燥即得到丝素II为主的丝蛋白多孔支架。
对上述丝蛋白多孔支架进行红外测试。图5显示实施例三条件下制备的丝蛋白的红外吸收峰位于1620cm-1，这是丝素II结构的特征峰，所以丝蛋白多孔支架主要为丝素II结构。
实施例五
将50g左右生丝浸入2L0.5％Na2CO3溶液中，搅拌煮沸60分钟后取出，用去离子水洗涤干净，自然晾干。
称取上述处理后的脱胶蚕丝15g溶解于100mL浓度为9.8mol/L的LiBr溶液中，60℃下搅拌溶解一个小时。然后用截留分子量为3500的透析袋，用去离子水透析四天，得到浓度为5％的丝蛋白水溶液，进一步调节丝蛋白水溶液浓度为4％。
取上述丝蛋白溶液10mL倒入聚乙烯皿中，并置于20％乙酸蒸汽中处理60分钟，然后放入-20℃下冷冻6小时。将丝蛋白冷冻体放入去离子水中解冻1h，再用去离子水漂洗三次，得到不溶性的丝蛋白多孔支架，再次冷冻干燥即得到丝素I结构为主的丝蛋白多孔支架。
实施例六
将50g左右生丝浸入5L0.2％Na2CO3溶液中，搅拌煮沸60分钟后取出，用去离子水洗涤干净，60℃下烘干。
称取上述处理后的脱胶蚕丝15g溶解于100mL浓度为9.8mol/L的LiBr溶液中，60℃下搅拌溶解一个小时。然后用截留分子量为3500的透析袋，用去离子水透析四天，得到浓度为6％的丝蛋白水溶液。
取上述丝蛋白溶液10mL倒入聚乙烯皿中，并置于50％三氟乙酸蒸汽中处理10分钟，然后放入-20℃下冷冻6小时。将丝蛋白冷冻体放入去离子水中解冻1h，再用去离子水漂洗三次，得到不溶性的丝蛋白多孔支架，再次冷冻干燥即得到无定形的丝蛋白多孔支架。
对比例一
将10g左右生丝浸入0.5L0.5％Na2CO3溶液中，搅拌煮沸60分钟后取出，用去离子水洗涤干净。重复以上操作两次后将蚕丝60℃下烘干。
称取上述处理后的脱胶蚕丝5g溶解于30mL浓度为9.8mol/L的LiBr溶液中，60℃下搅拌溶解一个小时。然后用截留分子量为3500的透析袋，用去离子水透析3天，得到浓度为6％的丝蛋白水溶液，进一步调节丝蛋白水溶液浓度为2％。
取上述丝蛋白溶液10mL，并向溶液中加入1％甲酸1mL。观察可见甲酸溶液加入后，即可形成白色絮状物，并发生沉淀。甲酸注入完成后，几分钟可见丝蛋白溶液形成不均匀凝胶。经冷冻干燥后形成脆性海绵，红外测试表明该海绵主要为丝素II结晶结构(图6)。
对比例二
将50g左右生丝浸入2L0.5％Na2CO3溶液中，搅拌煮沸60分钟后取出，用去离子水洗涤干净，自然晾干。
称取上述处理后的脱胶蚕丝15g溶解于100mL浓度为9.8mol/L的LiBr溶液中，60℃下搅拌溶解一个小时。然后用截留分子量为3500的透析袋，用去离子水透析四天，得到浓度为5％的丝蛋白水溶液，进一步调节丝蛋白水溶液浓度为4％。
取上述丝蛋白溶液10mL，然后向溶液中加入90％甲酸1mL。观察可见甲酸溶液加入后，丝蛋白溶液快速形成凝胶。经冷冻干燥后形成脆性海绵，X-射线衍射测试表明该海绵主要为丝素II结晶结构(图7)。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，并不用于限制本发明，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变型，这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种丝蛋白多孔海绵的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
A)将丝蛋白水溶液置于酸蒸汽中处理；所述酸蒸汽来源于盐酸、甲酸、乙酸和三氟乙酸中的一种或几种；
B)将处理后的丝蛋白水溶液进行冷冻得到丝蛋白水溶液冷冻体；
C)将所述丝蛋白水溶液冷冻体进行解冻，得到湿态丝蛋白海绵；
D)将所述湿态丝蛋白海绵进行冻干，得到丝蛋白多孔海绵。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤A)中，所述丝蛋白水溶液的浓度为0.1～10wt％。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤A)中，所述酸蒸汽所使用的酸溶液的浓度为0.1～98wt％。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤A)中，所述酸蒸汽处理时间为0.1～1200min。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤B)中，所述冷冻温度为-4～80℃，冷冻处理时间为1～48h。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤C)中，所述解冻温度为0-60℃。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤C)中，在空气或水中进行解冻。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤D)中，所述冻干温度为-4～80℃，冻干时间为24～72h。
9.一种权利要求1～8中任一项所述的制备方法所制备的丝蛋白多孔海绵，其特征在于，所述丝蛋白海绵具有均匀的多孔结构，孔径为50～1000μm，孔隙率大于80％。
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