JP4970770B2 - 対細胞非接着性材料 - Google Patents

Description

本発明は、蜂（膜翅目昆虫）が生成するタンパク質に関するものであり、更に詳しくは対細胞非接着性材料としての蜂が吐出等により生成するタンパク質に関する。

昆虫類の体内から排出される体液や分泌物にはタンパク質が多く含まれており、そのタンパク質の固有の特性を生かした有用なものがある。
例えば、その一つとして、絹糸より抽出し、成形された絹タンパク質があるが、これは生体適合性を有し、且つ成形が容易な材料であることから、創傷被覆材など医療用素材として注目されている（特許文献１参照）。

しかし、生体環境下で使用する際、殆どの場合、血液、いわゆる血清が介在する状態にある。
絹タンパク質は、このような血清の存在下では、細胞接着性が強くなり生体内で他の細胞組織と強い反応が生じるために、それと接する組織との接着や癒着が惹起される可能性が高い。
そのため、生体環境下で癒着を防止しなければならない場合にはその使用は極めて困難であり、血液中の血清が介在する状況下で癒着を防止する生体材が求められていた。
特開平１１−７０１６０号公報

本発明は、上記の従来の問題点を解決するものである。
すなわち、生体適合性を備え、且つ成形も容易で、更に血清の介在下においても対細胞非接着性を有する材料を提供することである。

本発明者等は、上記のような問題点を解決すべく鋭意研究した結果、蜂が生成するタンパク質を特定の条件下で抽出し、成形することにより、対細胞非接着性を有する生体材を提供することが可能であることを見出し、本発明を完成するに至った。

即ち、本発明は、（１）、蜂の幼虫が吐出するタンパク質よりなる対細胞非接着性材料に存する。

そして、（２）、蜂の幼虫が吐出するタンパク質をハロゲン化有機溶媒中で溶解させ、抽出したものである上記（１）記載の対細胞非接着性材料に存する。

そしてまた、（３）、前記ハロゲン化有機溶媒が、ジクロロ酢酸、トリフロロ酢酸、又はヘキサフロロイソプロパノールである上記（２）記載の対細胞非接着性材料に存する。

そしてまた、（４）、ハロゲン化有機溶媒中で溶解させる温度が４℃以下である上記（１）乃至（３）記載の対細胞非接着性材料に存する。

そしてまた、（５）、フィルム状に形成した上記（１）乃至上記（４）記載の対細胞非接着性材料に存する。

そしてまた、（６）、粒子状に形成した上記（１）乃至上記（４）記載の対細胞非接着性材料に存する。

そしてまた、（７）、繊維状に形成した上記（１）乃至上記（４）記載の対細胞非接着性材料存する。

そしてまた、（８）、ゲル状に形成した上記（１）乃至上記（４）記載の対細胞非接着性材料存する。

そしてまた、（９）、３次元多孔質状に形成した上記（１）乃至上記（４）記載の対細胞非接着性材料存する。

そしてまた、（１０）、癒着防止膜又は人工血管として用いる上記（１）乃至上記（４）記載の対細胞非接着性材料に存する。

そしてまた、（１１）、血清の存在下で使用する（１）乃至上記（１０）いずれかに記載の対細胞非接着性材料に存する。

なお、本発明の目的に添ったものであれば、上記発明を適宜組み合わせた構成も採用可能である。

本発明によれば、蜂が生成するタンパク質よりなる材料であるため、生体適合性を備え、且つ成形も容易で、更に血清の介在下においても、対細胞非接着性を発揮できる。

蜂（特に蜂の幼虫）は、上咽喉腺から蝋物質を吐出し（吐糸）、それに木クズ等を絡ませて巣を形成するが、この吐出した糸状の蝋物に蜜蝋と共に多くの繊維状タンパク質（以下、単に『蜂タンパク質』と言う）が含まれている。
なお、上記『蜂タンパク質』は吐出する以外にも蜂が何らかの方法で生成するタンパク質をも含むものである。

この蜂が生成した蜂タンパク質は、絹タンパク質と比べてアミノ酸組成が大きく異なり、グリシンが１／５以下と少なく、アルギニン、スレオニン、グルタミン酸が約５倍と多く含まれるアミノ酸組成となっているため、ハロゲン化有機溶媒に効率良く溶解する。（図１参照）

因みに、絹タンパク質は、ハロゲン化有機溶媒に直接溶解させることができない。その為、一旦、臭化リチウム水溶液に溶解後に透析するなどして、水溶液とした後に、一旦乾燥して薄膜を生成し、その薄膜をハロゲン化有機溶媒に溶解させ、抽出精製する工程をとる。これに比べて蜂タンパク質は、絹タンパク質に比べ精製工程が簡略化される利点がある。

ハロゲン化有機溶媒としては、ジクロロ酢酸、トリフロロ酢酸、ヘキサフロロイソプロパノール、又はヘキサフロロアセトン等の溶媒が使用可能である。

一方、巣を構成する木くず等の不純物（これらにより巣の骨格や表皮が形成される）及び蜂タンパク質と同様に蜂より生成される蜜蝋は、上記のハロゲン化有機溶媒には不溶である。
従って、蜂の巣をこれらのハロゲン化有機溶媒を含む処理液に加えて（すなわち浸して）攪拌し、可溶成分である蜂タンパク質とそれ以外の不溶成分とに分離することで、蜂の巣に含まれる蜂タンパク質のみを抽出することが出来る。

蜂タンパク質は、ハロゲン化有機溶媒の種類により、溶媒中で分解する恐れがある。その場合には、４℃以下にまで冷やして分解を防ぐことが可能である。
何故なら４℃以下では分解が殆ど生じなく、また０℃より温度を下げてマイナス温度とすると溶解速度が低下するようになるからである。
そのため、簡単な具体的な操作としては、例えばトリフロロ酢酸等への溶解においては、氷冷して分解を防ぐ方法を採用することが好ましい。

可溶成分（蜂タンパク質）と不溶成分（不純物）を分離するのは、処理液をフィルターに通すことによって行う方法又は、処理液を遠心分離機で分離する方法等がある。

蜂タンパク質としては、その使用態様により種々の形態を持たせることが必要であり、例えば、その形態としては次に示すように、フィルム状、粒子状、繊維状、ゲル状、多孔質状（いわゆるスポンジ状）等の形態がある。
次にその形態の形成法の概略を述べる。
〔フィルム状形成法〕
本発明において蜂タンパク質をフィルム状に薄膜化するためには、上述したような不純物を除去した後の高濃度のタンパク質を含むハロゲン化有機溶液を平板上に流延し、固化した蜂タンパク質のフィルムを常温下で風乾、又は常温減圧下で乾燥することによって可能となる。

〔粉体状形成法〕
本発明で蜂タンパク質を粉体状に形成するには、不純物を除去した後の高濃度の蜂タンパク質を含むハロゲン化有機溶媒に、蜂タンパク質の溶解性を低下させるための沈殿剤を加えて蜂タンパク質を不溶化（凝固）させた後、フィルターを通して回収後、乾燥することによって可能となる。
沈殿剤としては、メタノール、エタノールなどのアルコール系溶剤や、エーテル等が採用される。
乾燥方法としては、常温下で風乾する方法、又は常温減圧下で乾燥する方法、又は凍結乾燥し、粉砕により形成する方法がある。
或いは、粉体状形成の他の法として、後述するゲル状形成法と同様な方法で作製したゲルを凍結乾燥し、粉砕することによっても得ることができる。

〔繊維状形成法〕
本発明で蜂タンパク質を繊維状に形成するには、不純物を除去した後の高濃度の蜂タンパク質を含むハロゲン化有機溶媒を、ノズルから凝固浴に射出して糸状にし、強度を上げるために延伸と熱処理を加えることにより可能となる。
なお、凝固浴にはメタノール、エタノールなどのアルコール系溶剤やアセトンが用いられる。

〔ゲル状形成法〕
本発明で蜂タンパク質をゲル状物質に形成するには、ハロゲン化有機溶媒により抽出生成した蜂タンパク質を、Ｌｉ−Ｂｒ等よりなる中性塩水溶液に再溶解し、蒸留水中で放置（透析）することにより、ゲル化させる方法がある。

〔３次元多孔質状形成法〕
本発明で蜂タンパク質を３次元多孔質状（いわゆるスポンジ状）に形成するには、ハロゲン化有機溶媒により抽出精製した蜂タンパク質を、Ｌｉ−Ｂｒ等よりなる中性塩水溶液に再溶解し、蒸留水中で放置（透析）する。
そして放置することにより生成されるゲル化状物質を、今度は凍結し、その後、融解することにより３次元多孔質状物質を得る。

本発明による蜂タンパク質を、癒着防止膜として用いるには、先述したフィルム状に形成した薄膜をそのまま用いる。
或いは繊維状に形成した蜂タンパク質を編成又は織成して布物質を作成し、それを用いる。

更にまた、本発明による蜂タンパク質を人工血管として用いるには、蜂タンパク質を含むハロゲン化有機溶液を、蜂タンパク質以外の生体材よりなる、パイプ状の編み物やチューブに塗布乾燥することにより、表面に蜂タンパク質よりなる対細胞非接着性を有する膜を形成して、それを用いる。

本発明の蜂タンパク質の特徴である生体適合性と対細胞非接着性を併せ持つ生体材の使用用途としては、癒着防止膜、人工血管の他に、血液系（白血球など）細胞等の非付着性細胞用の細胞培養基材、創傷被覆材等が考えられる。
或いは、耐細胞接着性を有する他の生体材と組み合わせることにより、細胞の配向・成長を制御した材料創製のための基礎材料として利用等が考えられる。

本発明による蜂タンパク質が、生体適合性を有し、且つ対細胞非接着性を有することを以下の方法で確認した。

〔生体適合性の確認〕
蜂タンパク質より強制的に抽出した水溶液と、絹タンパク質より同一条件下で抽出した水溶液を用い、水溶液濃度を変化させながら細胞の増殖量比較を行ったところ、細胞は蜂タンパク質の水溶液及び絹タンパク質水溶液の濃度とは無関係にほぼ一定の増殖量を示し、かつ蜂タンパク質水溶液と、絹タンパク質水溶液双方に明確な差が発生しなかった。
すなわち、蜂タンパク質の細胞に対する毒性は、絹タンパク質の細胞に対する毒性と同程度であり、蜂タンパク質は絹タンパク質と同じく生体適合性を有する（詳細については、実施例１参照）。

〔対細胞非接着性の確認〕
蜂タンパク質及び絹タンパク質を、細胞溶液内で静置した後、および血清を含む細胞溶液内で静置した後の、タンパク質表面に付着した細胞の数を比較した。
細胞溶液内で静置した後の蜂タンパク質、及び絹タンパク質表面に付着した細胞数に差は無く、蜂タンパク質は、絹タンパク質と同レベルの対細胞接着性を示す。
また、血清を含む細胞溶液内で静置した絹タンパク質表面への付着細胞数は、細胞溶液のみで静置した付着細胞数に比べ大幅に増加し、血清介在下で対細胞接着性が増加する。
これに比較して、血清を含む細胞溶液内で静置した蜂タンパク質表面への付着細胞数は、細胞溶液のみで静置した付着細胞数に比べ、大幅に減少する。
すなわち、蜂タンパク質は血清介在下では、高い対細胞非接着性を示す（詳細については、実施例１参照）。

本発明により生成される蜂タンパク質は、その特性として、絹タンパク質に比べ対細胞非接着性に優れることについて記載したが、絹タンパク質のアミノ酸組成に比べ異なった構成を有するため、そのことに由来する他の利点も有していることが推測される。

次に本発明を実施例により説明するが、本発明は実施例にのみ限定されるものではないことは当然である。

〔実施例１〕
〔蜂タンパク質フィルムの生成〕
まずヘキサフロロイソプロパノール(HFIP)の水和物を調製した。
このHFIPの水和物にスズメバチの幼虫が吐糸した繭を加え、室温にて一昼夜攪拌し、蜂タンパク質を溶解させた（２００ｍｇの巣を１０ｍｌのHFIPの水和物に溶解した）。

得られた蜂タンパク質の溶解物をフィルターで吸引濾過して、不溶成分を取りのぞき、蜂タンパク質のHFIP溶液を得た。
上記で得た蜂タンパク質のHFIP溶液をシャーレに流延し、室温にて１日間静置して溶媒を蒸発させることで、蜂タンパク質フィルム（１）が得られた。

〔絹タンパク質フィルムの調整〕
精錬済みの家蚕絹糸（絹タンパク質）１ｇを濃度９mol/L の臭化リチウム水溶液１５ｍｌに４０℃で半日間攪拌して溶解した。
溶解後、吸引濾過により不溶成分を取り除き、更にまた蒸留水中で透析後臭化リチウムを取り除くことにより、２wt％絹タンパク質水溶液を得た。
この水溶液を４倍に希釈した後シャーレに流延し、４０℃にて２日間静置して乾燥させ、絹タンパク質のフィルムを得た。
このフィルムを水に対して不溶性にするため、メタノール中に１時間浸漬し、その後風乾することにより絹タンパク質フィルム（１）を得た。
因みに、絹タンパク質は蜂タンパク質に比べアミノ酸組成が異なるため、生体材として使用する為には多くの工程が必要であり、蜂タンパク質の成形容易性が確認される。

〔生体適合性の確認〕
上記のようにして得られた蜂タンパク質フィルム（１）と絹タンパク質フィルム（２）を１２１℃の熱水中に１時間浸漬して、抽出して得た蜂タンパク質水溶液（１）、及び絹タンパク質水溶液（２）について、水で希釈することにより濃度を変化させ、それぞれの溶液の濃度での繊維芽細胞による細胞増殖の評価を行った。
なお、生体適合性が無い（すなわち細胞毒性を有する）ことが知られているヒドロキシ尿素溶液(HU)も併せて、比較対照とした。

ヒドロキシ尿素溶液中の繊維芽細胞は、ヒドロキシ尿素溶液濃度の上昇に伴って細胞増殖量が減少した。
ヒドロキシ尿素が有する細胞毒性により、細胞増殖が抑制されることが確認された。
これに対して、生体適合性を有する絹タンパク質水溶液（２）は、水溶液濃度にかかわらず、ほぼ一定の細胞増殖量を示し、細胞毒性がないことが確認された。
一方、蜂タンパク質水溶液（１）も、水溶液濃度にかかわらず、ほぼ一定の細胞増殖量を示し、絹タンパク質と同様に細胞毒性がないことが確認された。
蜂タンパク質は絹タンパク質と同様生体適合性を有する（図２参照）。

〔対細胞非接着性効果の確認〕
蜂タンパク質と絹タンパク質の、対細胞非接着性、及び血清介在下での対細胞非接着性の効果を確認した。
細胞溶液として、
溶液（１）：１×１０^５cells/mlの繊維芽細胞溶液
溶液（２）：１０％の血清を含む１×１０^５cells/mlの繊維芽細胞溶液
を使用した。

４８穴細胞培養シャーレ中で乾燥、作製した蜂タンパク質フィルム（１）、及び絹タンパク質フィルム（２）表面に、上記の溶液（１）（繊維芽細胞溶液）、及び溶液（２）（血清を含む繊維芽細胞溶液）０．５ｍｌを滴下、接触させた。
そして３７℃で２時間静置後、フィルム表面を生理的緩衝溶液で洗浄して未付着細胞を除去し、フィルム表面に接着した細胞の数を計測した。

溶液（１）（繊維芽細胞溶液）の接触部では、蜂タンパク質フィルム（１）及び絹タンパク質フィルム（２）の表面に接着した細胞数に明確な差は無かった。
このように血清が存在しない状態では、蜂タンパク質は、絹タンパク質と同程度の対細胞接着性を有することが確認された。

絹タンパク質フィルム（２）における溶液（２）（血清を含む繊維芽細胞溶液）の接触部では、溶液（１）（繊維芽細胞溶液のみ）接触部に比べ、表面に接着した細胞の数は、約３倍に増加した。
このように、絹タンパク質は、血清介在下では対細胞非接着性が低下することが確認された。

一方、蜂タンパク質フィルム（１）における溶液（２）（血清を含む繊維芽細胞溶液）の接触部では、溶液（１）（繊維芽細胞溶液のみ）接触部に比べ、表面に接着した細胞の数は、約１／５ に減少した。
このように、蜂タンパク質は、血清介在下では、対細胞非接着性がさらに向上することが確認された（図３参照）。

本発明は、蜂の巣に含まれる繊維状タンパク質が生体適合性と、対細胞非接着性を有することを見いだした。
繊維状タンパク質の持つ特有の性質を利用して、人工血管等血清が介在する使用生体材への適用が可能であり、且つ成形も容易であることから、コスト的に有利であり産業上の利用価値も極めて大である。

図１は、蜂により生成されるタンパク質と絹タンパク質におけるアミノ酸組成を示す。 図２は、蜂タンパク質フィルム抽出液の細胞毒性評価（縦軸は、細胞増殖に対応）を示す。 図３は、蜂タンパク質および絹タンパク質の繊維芽細胞及び１０％の血清を含む繊維芽細胞の接着試験の結果写真を示す。

Claims (11)

1. 蜂の幼虫が吐出するタンパク質よりなる対細胞非接着性材料。
2. 蜂の幼虫が吐出するタンパク質をハロゲン化有機溶媒中で溶解させ、抽出したものであることを特徴とする請求項１記載の対細胞非接着性材料。
3. 前記ハロゲン化有機溶媒が、ジクロロ酢酸、トリフロロ酢酸、又はヘキサフロロイソプロパノールであることを特徴とする請求項２記載の対細胞非接着性材料。
4. ハロゲン化有機溶媒中で溶解させる温度が４℃以下であることを特徴とする請求項１乃至３記載の対細胞非接着性材料。
5. フィルム状に形成したことを特徴とする請求項１乃至請求項４記載の対細胞非接着性材料。
6. 粒子状に形成したことを特徴とする請求項１乃至請求項４記載の対細胞非接着性材料。
7. 繊維状に形成したことを特徴とする請求項１乃至請求項４記載の対細胞非接着性材料。
8. ゲル状に形成したことを特徴とする請求項１乃至請求項４記載の対細胞非接着性材料。
9. ３次元多孔質状に形成したことを特徴とする請求項１乃至請求項４記載の対細胞非接着性材料。
10. 癒着防止膜又は人工血管として用いることを特徴とする請求項１乃至請求項４記載の対細胞非接着性材料。
11. 血清の存在下で使用することを特徴とする請求項１乃至請求項１０記載の対細胞非接着性材料。

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