CN103933613A - 一种丝素软骨复合体义耳及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明属组织工程和医用材料领域，具体涉及一种丝素软骨复合体义耳及其制备方法和在耳廓再造中应用。本发明采用丝素软骨复合体作为支撑材料，以丝素蛋白为涂层，制成丝素软骨复合体义耳。本发明的丝素软骨复合体义耳可进一步用于在小耳畸形的耳廓再造。本发明利用丝素的良好生物相容性和促进成细胞生长的作用，能避免自体取肋骨的伤害，减少并发症，又可以长期或永久有效存活，本发明丝的素软骨复合体义耳解决了在耳廓再造方面其他生物材料造成的排斥问题，同时可以避免自体取肋骨造成的损伤，为临床耳廓再造及应用提供有意义的参考。

Description

一种丝素软骨复合体义耳及其制备方法

技术领域

本发明属组织工程和医用材料领域，具体涉及一种丝素软骨复合体义耳及其制备方法和在耳廓再造中应用。

背景技术

研究显示，先天性小耳畸形是较为常见的头面部畸形，据统计，其发病率为0.4～5.5/10000，其临床主要表现为外耳形态改变，外耳的基本结构消失或部分消失，仅有残余耳软骨及部分耳垂，甚至没有上述结构，而且常伴有外耳道闭锁、中耳畸形和颌面部畸形等症状。耳廓的畸形或缺少严重影响患者的容貌和心理健康。面对小耳畸形造成的压力，很多患者不能较好的适应社会，研究显示，小耳畸形患者的心理问题检出率明显高于健康正常人，因此，治疗小耳畸形的首选方案是进行早期治疗。目前，较好的治疗先天性小耳畸形的方法是耳再造术。耳郭具有复杂的三维解剖结构，理想的耳再造需再现出清晰的耳郭三维立体结构，因此耳再造术成为面部整形外科最困难和最富挑战性的手术之一。

耳支架的选取在耳廓再造术中起着至关重要的作用。自1920年Gilliesz开创全耳再造以来，先后有多种组织材料充当耳支架，如金属支架、硅橡胶支架、聚四氟乙烯支架、同种异体肋软骨、异种软骨、自体软骨、骨以及人造组织代用品等。就目前来看，硅橡胶支架、金属支架因为覆盖组织薄，易出现排斥反应等弊端，已经被淘汰；聚四氟乙烯支架较柔软，仅适合于部分耳缺损少的病例；同种异体肋软骨易吸收变形，致使手术成功率降低，异种肋软骨更易导致手术失败；自体肋软骨仍是目前应用最广泛、最为安全的支架材料，但存在取材痛苦，并发症多等弊端。因此选用更合适的耳廓支架进行耳廓再造是尤为需要的。

在众多的生物材料中，丝素有良好的生物相容性，无毒，无刺激性，在生物医用领域得到了日益广泛的应用，如医用丝素皮肤再生膜、隐形眼镜、细胞培养基及人工脑膜的实验研究等等。但迄今为止，国内外尚无丝素在耳廓再造方面应用的报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种丝素软骨复合体及其在耳廓再造中的应用，尤其涉及提供一种丝素软骨复合体义耳及其制备方法；进一步的，提供丝素蛋白复合体义耳在临床耳廓再造中的应用。

本发明采用丝素软骨复合体作为支撑材料，以丝素蛋白为涂层，制成丝素软骨复合体义耳。本发明利用丝素的良好生物相容性和促进成细胞生长的作用，能避免自体取肋骨的伤害，减少并发症，又可以长期或永久有效存活。

本发明丝素软骨复合体可用作临床小耳畸形耳廓再造，能为探讨丝素软骨复合体在临床重建耳廓提供有意义的参考。

更具体的，本发明的一种丝素软骨复合体义耳，其特征在于，采用丝素复合物作支撑材料，以软骨细胞作为外层，制成丝素软骨复合体义耳，所述的丝素蛋白重量/体积浓度为6-20％；本发明的实施例中，优选所述的丝素蛋白重量/体积浓度为6-12％，更优选的丝素蛋白重量/体积浓度为10％。

本发明中，所述的丝素软骨复合体义耳制成正常耳廓结构。

本发明的丝素软骨复合体义耳通过下述方法制备，其包括步骤：

1)制备丝素蛋白

采用废桑蚕生丝在NaHCO3水溶液中脱胶，将脱胶丝溶于LiBr水溶液中，溶解，过滤，除去杂质，得丝素蛋白盐溶液，用去离子水透析除去溶液中的LiBr，得丝蛋白，再浓缩，PEG透析，丝素蛋白溶液离心去除杂质，留上清液，得重量/体积浓度为6-20％的丝素蛋白，本发明的实施例中优选所述的丝素蛋白重量/体积浓度为6-12％，更优选的丝素蛋白重量/体积浓度为10％；

2)制备丝素蛋白支架

用制得的丝素蛋白溶液与正丁醇混合，搅拌后，放入-20℃冰箱24小时，室温条件下，制得丝素蛋白多孔支架；去离子水清洗去除残存正丁醇，制得不同孔径尺寸的多孔丝素蛋白多孔支架；

3)软骨细胞分离和细胞培养

采用获得的无菌成年雄性SD大鼠关节软骨(由复旦大学动物实验中心提供)，先后采用胰蛋白酶EDTA消化(GIBCO，0.25％trypsin)，用II型胶原酶消化后，过滤，离心，重悬细胞，最后接种于悬浮瓶中培养(GIBCO，高糖DMEM+15％胎牛血清)，隔天换液；

4)软骨细胞增殖和转染

传代软骨细胞进行慢病毒转染(6enechem公司，效价：2E+8TU/ml，pGC-FU-GFP-3FLAG)；

5)丝素蛋白膜和软骨细胞体外培养

转染后，软骨细胞进行培养和传代，然后种植在多孔丝素蛋白上，将丝素蛋白膜与软骨细胞体外培养4周；制得丝素软骨复合体义耳材料。

经检测，结果显示：

1)软骨细胞形态学特点

关节软骨消化后，获得的软骨细胞在悬浮培养瓶中培养，6小时后，部分细胞附着；24小时后，大量细胞附着；5天后，细胞间相互接触；平均爬满时间为7天；附着软骨细胞的形态特点是拉伸成伪足多边形形状、鹅卵石般均匀爬满培养瓶底部(如图2a所示)，由于软骨细胞内具有II型胶原蛋白，因此在特定的折射率材料中能被观察到(如图2b所示)；

通常情况下，根据细胞质内的II型胶原蛋白蛋白抗原特点，通过免疫荧光组织化学检测可检测到细胞质内的II型胶原蛋白蛋白(红色荧光标记II型胶原蛋白，如图3所示)，通过甲苯胺蓝染色，细胞浆也可着色(蓝色)，此即II类型胶原着色(如图4所示)；

2)检测转染效率

收集两种转染细胞，即80000细胞在24孔板，或者300000细胞在6孔板中，72小时后利用GFP(绿色荧光蛋白)检测转染情况，荧光倒置显微镜观察GFP表达情况，所述的GFP代表细胞在不同浓度的慢病毒中的转染效率(如图5所示)；

3)免疫荧光组织化学分析丝素软骨复合体生物材料

选用免疫荧光组织化学分析丝素软骨复合体生物材料，细胞表面均匀分布在丝素支架上，软骨细胞优先种植在丝素支架的表面区域，然后才是中心区域(如图6所示)，4周后，支架的毛孔内布满结缔组织及细胞外基质(ECM)，经免疫荧光组织化学分析表明，II型胶原蛋白在各组均有表示，GFP表达于部分软骨细胞(图7显示了软骨细胞与周围组织联系紧密)，大量的软骨细胞渗透并存活于丝素材料中(如图7A，B，C，D所示)；

4)激光共聚焦显微镜检测丝素软骨复合体材料

激光共聚焦显微镜立体显示生物材料复合体，即丝素软骨复合体，细胞表面均匀分布在丝素支架上，软骨细胞优先种植在丝素支架的表面区域，然后才是中心区域(如图6所示)，4周后，支架的毛孔内布满结缔组织及细胞外基质(ECM)，GFP表达于部分软骨细胞(如图8，9所示)，不同的激光共聚焦可以部分显示软骨细胞附着与丝素支架上(如图10所示)。

本发明的丝素软骨复合体义耳材料经检测，结果显示，软骨细胞可以在丝素支架上附着、生长，其中，丝素表面生长的软骨细胞优先种植在丝素支架的表面区域，然后才是中心区域，且具有一定的极性、层次和厚度，但是在不同部位和不同面积的丝素表面厚度完全不同。

本发明采用丝素复合体义耳材料作为支撑材料，既可以利用丝素的良好生物相容性和促进细胞生长的作用，能避免自体取肋骨的伤害，减少并发症，又可以长期或永久有效存活。

本发明的丝素软骨复合体义耳可进一步用于在小耳畸形的耳廓再造。

本发明采用丝素软骨复合体义耳用于耳廓再造，解决了在耳廓再造方面其他生物材料造成的排斥问题，同时可以避免自体取肋骨造成的损伤；其中的丝素尤其具有如下优点：可以促进上皮爬行，避免术后植入体排除，预期可获得满意的效果，具有理想气管替代物的五个标准，包括：具有高度生物相容性的合成材料；血管适宜在移植物内生长；具上皮组织或适宜于上皮组织生长；有充分的长度以满足不同程度的缺损修复；具有足够硬度以对抗负压。

为了便于理解，以下将通过具体的附图和实施例对本发明的一种丝素软骨复合体义耳及其制备方法进行详细地描述。需要特别指出的是，具体实例和附图仅是为了说明，显然本领域的普通技术人员可以根据本文说明，在本发明的范围内对本发明做出各种各样的修正和改变，这些修正和改变也纳入本发明的范围内。

附图说明

图1：不同孔隙大小的多孔丝素膜，

其中的A，B，C，D，分别显示不同孔隙大小的多孔丝素膜，标度为100μm。

图2：显示了经过7天的培养，软骨细胞在培养瓶中形成伪多边形的形状，径向拉伸，鹅卵石均匀地分布在底部的(A，B)，可以看出在细胞内某些具有折光性的物质(B)，荧光倒置显微照相表明部分软骨细胞表达GFP(C，D)。

图3：显示了免疫组织化学检测细胞质内II型胶原蛋白表达阳性(荧光标记的II型胶原蛋白)，部分软骨细胞表达GFP。

图4：显示了甲苯胺蓝染色，细胞的细胞质中被染色，即是II型胶原蛋白的着色。

图5：显示了在多孔丝素膜内的活细胞GFP表达。

图6：免疫组织化学分析显示，在细胞接种4周后，软骨细胞上在表面区域比中心区域更丰富，DAPI染色结果显示多孔丝素蛋白支架(在一个不规则的网状浅色)，核仁(圆形或椭圆形，A图)，大多数毛孔都充满了组织，孔隙内填充细胞外基质，II型胶原蛋白表达(C图)，部分的软骨细胞中发现GFP的表达(B图)，图A，B，C合并为D。

图7：高倍视野观察免疫组织化学分析图像，

DAPI染色结果显示多孔丝素蛋白支架(在一个不规则的网状浅色)，核仁(圆形或椭圆形，A图)，孔隙内填充细胞外基质，II型胶原蛋白表达(C图)，部分的软骨细胞中发现GFP的表达(B图)，图A，B，C合并为D。

图8：激光共聚焦扫描三维成像显示共培养软骨细胞紧紧地与周围组织相连(前视图)，

DAPI染色结果显示多孔丝素蛋白支架(不规则的网格状淡色)和核仁(圆形或椭圆形，A图)，软骨细胞渗透生长入材料中并且存活(图C，D)，在丝素支架上所有软骨细胞表达功能性蛋白II型胶原。

图9：激光共聚焦扫描三维成像显示共培养软骨细胞紧紧地与周围材料组织(丝素支架)相连(斜侧视图)。

图10：共焦激光扫描部分显示软骨细胞的功能性蛋白(胶原II型)的表达，和与丝素蛋白细胞支架的关系，部分软骨细胞中发现GFP表达(B图)，图A，B，C合并为D。

图11：用人耳廓取模制得的耳廓型丝素义耳。

具体实施方式

实施例1

1)制备丝素蛋白

采用废桑蚕生丝在NaHCO3(0.5wt％)水溶液中脱胶，将脱胶丝溶于9.3mol/L的LiBr水溶液中，搅拌至蚕丝完全溶解，过滤，除去未溶解的蚕丝及杂质，得丝素蛋白盐溶液，用去离子水透析除去溶液中的LiBr，得浓度为4％的丝蛋白，再浓缩，PEG透析，所得丝素蛋白溶液离心去除杂质，留上清液，所得的丝素蛋白浓度为10％，置4℃冰箱保存备用；

2)制备丝素蛋白支架

用制得的丝素蛋白溶液与正丁醇1∶1混合，搅拌5分钟(25℃)，放入一个5cm×5cm聚苯乙烯磁盘，然后放入-20℃冰箱24小时，室温条件下，丝素蛋白多孔支架制备完成；然后用去离子水清洗去除残存正丁醇，最后丝素蛋白多孔支架被切割成所需的大小(1cm×1cm×1mm)，图1A，B，C，D显示了本发明构建的不同孔径尺寸的多孔丝素蛋白膜；

3)软骨细胞分离和细胞培养

采用成年雄性SD大鼠(200-250克)(由复旦大学动物实验中心提供)，常规处理获得无菌关节软骨，先用胰蛋白酶EDTA消化30分钟(GIBCO，0.25％trypsin)，接着用II型胶原酶消化8小时(Invitrogen)，然后过滤，离心，重悬细胞，最后接种于悬浮瓶中培养(GIBCO，高糖DMEM+15％胎牛血清)，隔天换液；

4)软骨细胞增殖和转染

当软骨细胞爬满瓶底，添加5毫升PBS，轻摇，吸出PBS。添加2ml胰蛋白酶EDTA，消化5分钟，终止消化，再次接种于悬浮瓶中培养，传代软骨细胞进行慢病毒转染(Genechem公司，效价：2E+8TU/ml，pGC-FU-GFP-3FLAG)；具体转染方法即用转染80000细胞放入24孔版或300000细胞放入6孔板，慢病毒加入高糖有血清培养基培养24小时，72小时后用GFP荧光评价转染效率；

5)丝素蛋白膜和软骨细胞体外培养

转染后，软骨细胞进行培养和传代，然后被种植在多孔丝素蛋白上，将丝素蛋白膜与软骨细胞体外培养4周；制得丝素软骨复合体义耳材料。

制得丝素软骨复合体义耳材料进行检测，结果显色，细胞表面均匀分布在丝素支架上，软骨细胞优先种植在丝素支架的表面区域，然后才是中心区域(如图6所示)，4周后，支架的毛孔内布满结缔组织及细胞外基质(ECM)，免疫荧光组织化学分析表明，II型胶原蛋白在各组均有表示，GFP表达于部分软骨细胞软骨细胞与周围组织联系紧密(如图7所示)，大量的软骨细胞渗透并存活于丝素材料中；进一步，本发明中使用人耳廓取模制备得到耳廓型丝素义耳(如图11所示)。

Claims (9)

1.一种丝素软骨复合体义耳，其特征在于，采用丝素复合物作支撑材料，以软骨细胞作为外层，制成丝素软骨复合体义耳，所述的丝素蛋白重量/体积浓度为6-20％。

2.按权利要求1所述的丝素软骨复合体义耳，其特征在于，所述的丝素蛋白重量/体积浓度为6-12％。

3.按权利要求1所述的丝素软骨复合体义耳，其特征在于，所述的丝素蛋白重量/体积浓度为10％。

4.按权利要求1所述的丝素软骨复合体义耳，其特征在于，所述的丝素软骨复合体义耳是正常耳廓结构。

5.权利要求1所述的丝素软骨复合体义耳的制备方法，其特征在于，其包括步骤：

1)制备丝素蛋白

采用废桑蚕生丝在NaHCO3水溶液中脱胶，将脱胶丝溶于LiBr水溶液中，溶解，过滤，除去杂质，得丝素蛋白盐溶液，用去离子水透析除去溶液中的LiBr，得丝蛋白，再浓缩，PEG透析，丝素蛋白溶液离心去除杂质，留上清液，得重量/体积浓度为6-20％的丝素蛋白；

2)制备丝素蛋白支架

用制得的丝素蛋白溶液与正丁醇混合，搅拌后，放入-20℃冰箱24小时，室温条件下，制得丝素蛋白多孔支架；去离子水清洗去除残存正丁醇，制得不同孔径尺寸的多孔丝素蛋白多孔支架；

3)软骨细胞分离和细胞培养

采用获得的无菌成年雄性SD大鼠关节软骨，先后采用胰蛋白酶EDTA消化(GIBCO，0.25％trypsin)，用II型胶原酶消化后，过滤，离心，重悬细胞，最后接种于悬浮瓶中培养，隔天换液；

4)软骨细胞增殖和转染

传代软骨细胞进行慢病毒转染；

5)丝素蛋白膜和软骨细胞体外培养

转染后，软骨细胞进行培养和传代，然后种植在多孔丝素蛋白上，将丝素蛋白膜与软骨细胞体外培养4周；制得丝素软骨复合体义耳材料。

6.按权利要求5所述的方法，其特征在于，所属步骤1)的NaHCO3为0.5wt％；所述LiBr水溶液为9.3mol/L。

7.按权利要求5所述的方法，其特征在于，所属步骤2)的丝素蛋白溶液与正丁醇以1∶1混合。

8.按权利要求5所述的方法，其特征在于，所属步骤3)的悬浮瓶中培养成分含有高糖DMEM+15％胎牛血清。

9.权利要求1所述的丝素软骨复合体义耳在制备小耳畸形的耳廓再造材料中的应用。