CN103225126A - 丝素/海藻酸钠复合纳米纤维支架的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物支架材料的制备及蚕丝蛋白的加工利用领域，特别涉及一种组织工程用丝素/海藻酸钠复合纳米纤维支架材料的制备方法。本发明的基本步骤是将脱胶后的纤维状丝素溶解在浓度为9mol/L的LiBr溶液中，控制温度37℃，时间6h，溶解后经过滤、透析、风干浓缩后获得不同重量浓度的丝素蛋白溶液，将500mg海藻酸钠溶于100ml去离子水中，60℃水浴中溶解1h，再磁力搅拌溶解1h，制成0.5%（w/v）的海藻酸钠溶液等，本发明采用热致相分离法制备丝素/海藻酸钠复合纳米纤维支架材料，制备工艺简单，无需其他复杂设备，条件易控制，成本低廉，可进行规模化批量生产。

Description

丝素/海藻酸钠复合纳米纤维支架的制备方法
技术领域
本发明涉及生物支架材料的制备及蚕丝蛋白的加工利用领域，特别涉及一种组织工程用丝素/海藻酸钠复合纳米纤维支架材料的制备方法。
背景技术
组织工程技术是一项用于治疗组织和器官缺损的新手段，由生物支架、细胞、生长因子等元素组成。其中，生物支架作为细胞生长、增殖以及新组织形成的物理支撑，在组织工程中起着重要作用。目前研究的生物支架材料的内部形态结构主要有片状、多孔状、纳米纤维状等。与片状或多孔材料相比，纳米纤维状支架具有与细胞外基质更接近的结构和功能，更有利于促进细胞的吸附、转移、增殖和分化。
丝素蛋白（SF）具有优良的生物相容性、可降解性、可改良性和机械拉伸性能等。丝素蛋白中含有羟基、氨基、羧基等活性基团，可以与其他高分子聚合物通过氢键、静电作用、螯合效应等相结合，形成性能优越的复合生物支架材料。海藻酸钠(SA)是一种广为存在的生物高分子材料，易形成凝胶，并具有良好的生物相容性和可降解性，是很好的组织工程支架材料。此外，海藻酸钠含有游离的羧基和羟基，性质活泼，容易与其他高分子物质相结合，形成良好的复合材料。将丝素与海藻酸钠复合，可获得综合性能更优的支架材料。虽有采用冷冻法制备丝素/海藻酸钠多孔支架（ Kwang-Gill Lee等 ，Journalof Applied Polymer Science 2004）等报导，但这些支架在内部结构和性能上存在不足。
热致相分离法是制备纳米纤维的方法之一，本发明采用二氧六环作为高分子溶液的非溶剂，诱发丝素/海藻酸钠溶液系统发生相分离，制备直径为20-300nm并同时具有多孔结构的纳米纤维支架。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中存在的不足，提供一种丝素/海藻酸钠复合纳米纤维支架的制备方法，本发明的具体技术方案如下：
一种丝素/海藻酸钠复合纳米纤维支架的制备方法，所述的制备方法包括以下步骤：
（1）将脱胶后的纤维状丝素溶解在浓度为9mol/L的LiBr溶液中，控制温度37℃，时间6h，溶解后经过滤、透析、风干浓缩后获得不同重量浓度的丝素蛋白溶液；
（2）将500mg海藻酸钠溶于100ml去离子水中，60℃水浴中溶解1h，再磁力搅拌溶解1h，制成0.5%（w/v）的海藻酸钠溶液；
（3）取一定量的丝素蛋白溶液，在60℃水浴中，加入一定量的海藻酸钠溶液，搅拌均匀后，加入一定量的二氧六环/水混合溶液，充分搅拌至均相溶液；
（4）将混合液迅速放入-80℃下陈化4h，使溶液发生相分离，取出后，室温(25℃)下静置30min，形成凝胶，然后浸入-20℃过量无水乙醇中24h，固定已形成的凝胶，并置换出二氧六环，倾去乙醇后，用去离子水置换48h，除去残留的溶剂及乙醇，期间不断换水；
（5）倾去去离子水，放入-60℃冷冻干燥器中干燥24h，制得不同丝素蛋白浓度的丝素/海藻酸钠复合纳米纤维支架材料。
作为进一步的改进，本发明所述的步骤（1）中当丝素蛋白溶液的重量浓度在3%～7%之间时，步骤（3）中丝素蛋白溶液与海藻酸钠溶液的体积比为1:2。
作为进一步的改进，本发明所述的步骤（1）中当丝素蛋白溶液的重量浓度为5%时，所述步骤（3）中丝素蛋白溶液与海藻酸钠溶液的质量比为5:1～1:1。
作为进一步的改进，本发明所述的步骤（3）中二氧六环/水溶剂体系中两者体积比为9:1。
作为进一步的改进，本发明所述的步骤（3）中丝素蛋白/海藻酸钠混合溶液与二氧六环/水溶剂体系的体积比为3:1。
本发明具有以下优点和效果：本发明所制备的丝素/海藻酸钠复合纳米纤维支架材料，纤维直径分布均匀，基本在100nm左右，支架材料连通性好，且具有较好的力学性能，符合组织工程对支架材料的要求。此外，本发明采用热致相分离法制备丝素/海藻酸钠复合纳米纤维支架材料，制备工艺简单，无需其他复杂设备，条件易控制，成本低廉，可进行规模化批量生产。
附图说明
图1为本发明实施例的丝素蛋白重量浓度为3%的丝素/海藻酸钠复合纳米纤维支架材料的电镜照片；
图2为本发明实施例的丝素蛋白重量浓度为5%的丝素/海藻酸钠复合纳米纤维支架材料的电镜照片；
图3为本发明实施例的丝素蛋白重量浓度为7%的丝素/海藻酸钠复合纳米纤维支架材料的电镜照片；
图4为本发明实施例的SF与SA质量比为3:1的丝素/海藻酸钠复合纳米纤维支架材料的电镜照片；
图5为本发明实施例的SF与SA质量比为1:1的丝素/海藻酸钠复合纳米纤维支架材料的电镜照片。
具体实施方式
下面结合实例来说明本发明的技术方案：
实施例1：
（1）取5ml3%丝素蛋白溶液，在60℃水浴中，加入10ml0.5%的海藻酸钠溶液，用玻璃棒搅拌均匀。
（2）向混合溶液中加入5ml的二氧六环/水混合液，用玻璃棒充分搅拌均匀。
（3）将步骤（2）所得的混合溶液迅速移入-80℃冰箱中陈化4h，使溶液发生相分离。取出后于室温（25℃）下静置30min，形成凝胶。
（4）将凝胶浸入-20℃过量无水乙醇中24h。
（5）倾去无水乙醇，4℃下用去离子水置换48h，期间不断换水。
（6）倾去去离子水，放入-60℃冷冻干燥器中干燥24h，制得丝素/海藻酸钠复合纳米纤维支架材料SF/SA(图1)，其纳米纤维直径为20～300nm。
实施例2：
（1）取5ml5%的丝素蛋白溶液，在60℃水浴中，加入10ml0.5%的海藻酸钠溶液，用玻璃棒搅拌均匀。
（2）向混合溶液中加入5ml的二氧六环/水混合液，用玻璃棒充分搅拌均匀。
（3）将步骤（2）所得的混合溶液迅速移入-80℃冰箱中陈化4h，使溶液发生相分离。取出后于室温（25℃）下静置30min ，形成凝胶。
（4）将凝胶浸入-20℃过量无水乙醇中24h。
（5）倾去无水乙醇，4℃下用去离子水置换48h，期间不断换水。
（6）倾去去离子水，放入-60℃冷冻干燥器中干燥24h，制得丝素/海藻酸钠复合纳米纤维支架材料SF/SA(图2)，其纳米纤维直径为40～200nm。
实施例3：
（1）取5ml7%的丝素蛋白溶液，在60℃水浴中，加入10ml0.5%的海藻酸钠溶液，用玻璃棒搅拌均匀。
（2）向混合溶液中加入5ml二氧六环/水混合液，用玻璃棒充分搅拌均匀。
（3）将步骤（2）所得的混合溶液迅速移入-80℃冰箱中陈化4h，使溶液发生相分离。取出后于室温（25℃）下静置30min ，形成凝胶。
（4）将凝胶浸入-20℃过量无水乙醇中24h。
（5）倾去无水乙醇，4℃下用去离子水置换48h，期间不断换水。
（6）倾去去离子水，放入-60℃冷冻干燥器中干燥24h，制得丝素/海藻酸钠复合纳米纤维支架材料SF/SA(图3)，其纳米纤维直径为30～300nm。
实施例4
（1）取5ml5%的丝素蛋白溶液，在60℃水浴中，加入16ml0.5%的海藻酸钠溶液，用玻璃棒搅拌均匀。
（2）向混合溶液中加入7ml二氧六环/水混合液，用玻璃棒充分搅拌均匀。
（3）将步骤（2）所得的混合溶液迅速移入-80℃冰箱中陈化4h，使溶液发生相分离。取出后于室温（25℃）下静置30min ，形成凝胶。
（4）将凝胶浸入-20℃过量无水乙醇中24h。
（5）倾去无水乙醇，4℃下用去离子水置换48h，期间不断换水。
（6）倾去去离子水，放入-60℃冷冻干燥器中干燥24h，制得丝素/海藻酸钠复合纳米纤维支架材料SF/SA(图4)，其纳米纤维直径为40～200nm。
实施例5
（1）取5ml5%的丝素蛋白溶液，在60℃水浴中，加入50ml0.5%的海藻酸钠溶液，用玻璃棒搅拌均匀。
（2）向混合溶液中加入18ml二氧六环/水混合液，用玻璃棒充分搅拌均匀。
（3）将步骤（2）所得的混合溶液迅速移入-80℃冰箱中陈化4h，使溶液发生相分离。取出后于室温（25℃）下静置30min ，形成凝胶。
（4）将凝胶浸入-20℃过量无水乙醇中24h。
（5）倾去无水乙醇，4℃下用去离子水置换48h，期间不断换水。
（6）倾去去离子水，放入-60℃冷冻干燥器中干燥24h，制得丝素/海藻酸钠复合纳米纤维支架材料SF/SA(图5)，其纳米纤维直径为40～300nm。
最后还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的具体实施例。显然本发明不限于以上实施例子，还可以制备出各种不同浓度、不同比例、不同组分等的复合纳米纤维支架材料。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

Claims (5)

1.一种丝素/海藻酸钠复合纳米纤维支架的制备方法，其特征在于，所述的制备方法包括以下步骤：
（1）将脱胶后的纤维状丝素溶解在浓度为9mol/L的LiBr溶液中，控制温度37℃，时间6h，溶解后经过滤、透析、风干浓缩后获得不同重量浓度的丝素蛋白溶液；
（2）将500mg海藻酸钠溶于100ml去离子水中，60℃水浴中溶解1h，再磁力搅拌溶解1h，制成0.5%（w/v）的海藻酸钠溶液；
（3）取一定量的丝素蛋白溶液，在60℃水浴中，加入一定量的海藻酸钠溶液，搅拌均匀后，加入一定量的二氧六环/水混合溶液，充分搅拌至均相溶液；
（4）将混合液迅速放入-80℃下陈化4h，使溶液发生相分离，取出后，室温(25℃)下静置30min，形成凝胶，然后浸入-20℃过量无水乙醇中24h，固定已形成的凝胶，并置换出二氧六环，倾去乙醇后，用去离子水置换48h，除去残留的溶剂及乙醇，期间不断换水；
（5）倾去去离子水，放入-60℃冷冻干燥器中干燥24h，制得不同丝素蛋白浓度的丝素/海藻酸钠复合纳米纤维支架材料。
2.根据权利要求1所述的丝素/海藻酸钠复合纳米纤维支架的制备方法，其特征在于，所述的步骤（1）中当丝素蛋白溶液的重量浓度在3%～7%之间时，所述步骤（3）中丝素蛋白溶液与海藻酸钠溶液的体积比为1:2。
3.根据权利要求1或2所述的丝素/海藻酸钠复合纳米纤维支架的制备方法，其特征在于，所述的步骤（1）中当丝素蛋白溶液的重量浓度为5%时，所述步骤（3）中丝素蛋白溶液与海藻酸钠溶液的质量比为5:1～1:1。
4.根据权利要求3所述的丝素/海藻酸钠复合纳米纤维支架的制备方法，其特征在于，所述的步骤（3）中二氧六环/水溶剂体系中两者体积比为9:1。
5.根据权利要求4所述的丝素/海藻酸钠复合纳米纤维支架的制备方法，其特征在于，所述的步骤（3）中丝素蛋白/海藻酸钠混合溶液与二氧六环/水溶剂体系的体积比为3:1。
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