CN105056300B - 一种真皮组织仿生多孔支架的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种真皮组织仿生多孔支架的制备方法，通过将丝蛋白溶液与海藻酸溶液混合后进行水蒸气蒸发成膜，并对蛋白/海藻酸高分子膜采用氯化钙水溶液中孵育，最终经过干燥后制成所述真皮组织仿生多孔支架。本发明真皮组织仿生多孔支架材料可有效促进创面修复和抑制瘢痕形成，烧创伤等开放性伤口有很好的治疗效果。
Description
技术领域
本发明涉及医用仿生材料技术领域，尤其是涉及一种以丝蛋白和海藻酸为原料，制备真皮组织仿生多孔支架的方法。
背景技术
烧创伤等开放性伤口所造成的皮肤缺损是临床常见病和多发病，在皮肤缺损修复过程中，伤口过度愈合会导致病理性瘢痕的发生和发展。病理性瘢痕包括增生性瘢痕和瘢痕疙瘩，会导致瘙痒、毁容、残疾等一系列严重的并发症，有时甚至诱发恶性肿瘤，严重降低患者的生存质量。因此，病理性瘢痕的防治一直是烧伤、整形等外科学领域中亟待解决的医学问题。
近年来，随着创面愈合机制研究的不断深入，人们认识到，瘢痕形成与真皮组织缺失程度具有高度相关性，这一理论在临床实践中得到了佐证，如浅度烧伤创面在愈合后新生组织与正常皮肤类似，而深度烧伤创面在愈合后将形成病理性瘢痕。这一理论提示：真皮组织的存在能够抑制瘢痕形成。因此，发挥真皮组织作用的真皮替代物已被临床用于促进深度皮肤缺损创面的愈合和抑制瘢痕形成。然而，现有真皮替代物仍然未达到抑制病理性瘢痕发生和发展的目标。目前，已上市真皮替代物产品可分为两类：脱细胞真皮基质和体外合成高分子支架。脱细胞真皮基质是由人尸体皮、猪皮、猪小肠粘膜下层经脱细胞处理所得到的成分异质的高分子支架材料，其主要成分为胶原蛋白。体外合成高分子支架是由合成高分子(如polyglactin)或动物源天然高分子(如胶原蛋白和/或糖胺聚糖)等体外合成的高分子支架。
已有仿真皮材料在促进创面修复和抑制瘢痕形成两方面发挥了有效作用，但在临床应用过程中仍然存在不足之处。首先，由于加工工艺难以控制，脱细胞真皮基质类仿生真皮的质量不稳定，各生产批次之间往往存在质量差别，这将影响其作为真皮替代物修复创面的应用效果，并可能造成二次手术等严重后果。其次，脱细胞真皮基质仿生真皮存在生物污染的可能性，由于原料人尸体皮可能携带病毒，并且这些病毒在材料加工过程中未被有效清除，而导致病毒传播。再次，体外合成仿生真皮在创面的降解速度与组织生成的速度不匹配，往往因降解过快而导致其促进伤口修复和抑制瘢痕形成的作用减弱。另外，现有仿生真皮在抑制瘢痕形成方面的作用效果远未达到促进功能性类真皮组织再生的目标。究其原因，仿生真皮在加工过程中结构被破坏和体外合成仿生真皮未实现对真皮组织的仿生是影响仿真皮材料促进真皮组织再生的重要因素。
发明内容
针对现有技术存在的上述问题，本发明提供一种真皮组织仿生多孔支架的制备方法。本发明真皮组织仿生多孔支架材料可有效促进创面修复和抑制瘢痕形成，烧创伤等开放性伤口有很好的治疗效果。
本发明的技术方案如下：
一种真皮组织仿生多孔支架的制备方法，所述真皮组织仿生多空支架所含原料的质量百分数为：丝蛋白50％～90％，海藻酸10％～50％；具体制备步骤为：
(1)将蚕茧置于Na2CO3水溶液中沸煮30min，然后用去离子水润洗3次，制得蚕丝素纤维；然后将蚕丝素纤维置于溴化锂溶液中，37℃条件下溶解，制得丝蛋白溴化锂溶液；最后将所得溶液在截留分子量为3500Da的透析盒中透析3天后，得丝蛋白溶液，调节溶液质量百分浓度为5％；
(2)将步骤(1)制得的丝蛋白溶液与质量百分浓度为2％的海藻酸溶液在37℃条件下按体积比4～36:10混合，在速度为50rpm/min的漩涡振荡器上振荡5min，至混合均匀，然后在离心力为1500g下离心3min，除去溶液中的气泡；
(3)将步骤(2)离心后的混合液转移至聚四氟乙烯槽中，溶液的厚度为2mm，然后将此槽放置于37℃、吸风风速为0.3米/秒的通风橱中央，放置时间为24h，形成丝蛋白/海藻酸高分子膜；
(4)将丝蛋白/海藻酸高分子膜浸没于浓度为0.002M的氯化钙水溶液中，37℃下孵育2h，然后将所得高分子膜在300ml去离子水中浸泡30min，重复三次最后将高分子膜在300ml液氮溶液中冷冻10min；
(5)将冷冻的高分子膜在真空冷冻干燥机中冷冻干燥，真空冷冻干燥条件为：冷阱温度-55℃、真空度3～5Pa，时间18h，制得丝蛋白/海藻酸复合材料，即所述真皮组织仿生多孔支架。
步骤(1)中所述Na2CO3水溶液浓度为0.01～1M；所述溴化锂溶液的浓度为1～20M。
本发明有益的技术效果在于：
(1)本发明丝蛋白分子能够发生物理交联，避免了在构建仿生真皮组织的过程中引入有毒的化学交联剂，提高材料的生物相容性，丝蛋白分子结构中约含有85％的甘氨酸、丙氨酸和丝氨酸的重复嵌段，这些重复嵌段之间会形成氢键而使丝蛋白分子内部或丝蛋白分子之间产生疏水结构，这种疏水结构使丝蛋白分子发生物理交联，而避免使用化学交联剂。
(2)本发明通过水蒸气蒸发使丝蛋白分子发生物理交联的方法，能够促进丝蛋白基支架材料对真皮组织结构和力学性能的仿生性能，降低了所制备的丝蛋白/海藻酸多孔支架的硬度，有利于仿生真皮组织抑制瘢痕形成和促进真皮组织再生的功能，这是由于水蒸气蒸发过程能够促进丝蛋白分子自组装形成Silk I结构并抑制Silk II结构的产生，而在甲醇水溶液中丝蛋白分子发生自组装主要形成Silk II结构，即β-sheet结构。当丝蛋白分子的物理交联形式主要为Silk I时，丝蛋白基支架材料在孔结构和力学性能方面优于以Silk II结构为主的相应材料，使其在力学性质方面与真皮组织更加接近。
(3)本发明海藻酸分子的引入能够提高真皮成纤维细胞和微血管内皮细胞在丝蛋白/海藻酸多孔支架中的黏附和增殖活性；对丝蛋白自组装过程具有调控作用；糖胺聚糖通过与细胞外基质中的细胞因子、生长因子等发生相互作用，提高这些蛋白质信号分子的生物利用度，从而提高细胞的生物活性；海藻酸的分子结构与脱细胞真皮基质中的糖胺聚糖结构类似，能够发挥与糖胺聚糖类似的生物学作用，因而，在丝蛋白支架中引入海藻酸能够促进真皮成纤维细胞和微血管内皮细胞的黏附性和增殖活性。
(4)本发明采用钙离子对丝蛋白/海藻酸多孔支架进行交联处理，此化学交联法能够将海藻酸分子固定于丝蛋白交联网络中，形成互穿网络，从而阻碍酶在支架网络中的扩散和活性，减慢丝蛋白/海藻酸的生物降解速度。
(5)本发明采用真空冷冻干燥处理获得丝蛋白/海藻酸多孔支架，能够材料在干态下保持其多孔结构和力学特性。
(6)本发明通过水蒸气蒸发法使多孔支架中的丝蛋白分子发生物理交联，改善了丝蛋白基多孔支架材料的微结构，增强了材料的多孔性能；并且，通过此制备方法，丝蛋白基支架材料的硬度降低，接近正常皮肤的弹性；本发明所涉及的多孔支架为完全互穿网络结构，离子交联的海藻酸网络能够提高材料的生物相容性，促进真皮组织所含细胞对支架的黏附性和在支架中的增殖活性；海藻酸是细胞外基质所含糖胺聚糖的拟似物，糖胺聚糖有利于提高细胞的活性。
附图说明
图1为本发明实施例1所得真皮组织仿生多孔支架的扫描电镜图。
图2为本发明对比例1所得纯丝蛋白膜的扫描电镜图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例，对本发明进行具体描述。
实施例1
一种真皮组织仿生多孔支架的制备方法，具体制备步骤为：
(1)将10g蚕茧置于500ml的0.02M Na2CO3水溶液中沸煮30min，然后用去离子水润洗3次，制得蚕丝素纤维；然后将蚕丝素纤维置于10ml的10M溴化锂溶液中，37℃条件下溶解，制得丝蛋白溴化锂溶液；最后将所得溶液在截留分子量为3500Da的透析盒中透析3天后，得丝蛋白溶液，调节溶液质量百分浓度为5％；
(2)将步骤(1)制得的丝蛋白溶液与质量百分浓度为2％的海藻酸溶液在37℃条件下按体积比10:10混合，在速度为50rpm/min的漩涡振荡器上振荡5min，至混合均匀，然后在离心力为1500g下离心3min，除去溶液中的气泡；
(3)将步骤(2)离心后的混合液转移至聚四氟乙烯槽中，溶液的厚度为2mm，然后将此槽放置于37℃、吸风风速为0.3米/秒的通风橱中央，放置时间为24h，形成丝蛋白/海藻酸高分子膜；
(4)将丝蛋白/海藻酸高分子膜浸没于浓度为0.002M的氯化钙水溶液中，37℃下孵育2h，然后将所得高分子膜在300ml去离子水中浸泡30min，重复三次最后将高分子膜在300ml液氮溶液中冷冻10min；
(5)将冷冻的高分子膜在真空冷冻干燥机中冷冻干燥，真空冷冻干燥条件为：冷阱温度-55℃、真空度3～5Pa，时间18h，制得丝蛋白/海藻酸复合材料，即所述真皮组织仿生多孔支架。其中，丝蛋白的质量百分含量为72％，海藻酸的质量百分含量为28％。
通过扫描电子显微镜观察实施例1所述的真皮组织仿生多孔支架的微观结构，如图1所示。由图1可以看出，由水蒸气蒸发处理所得的真皮组织仿生多孔支架，其内部微观结构为联通的多孔结构。
实施例2
一种真皮组织仿生多孔支架的制备方法，具体制备步骤为：
(1)将10g蚕茧置于500ml的0.05M Na2CO3水溶液中沸煮30min，然后用去离子水润洗3次，制得蚕丝素纤维；然后将蚕丝素纤维置于10ml的20M溴化锂溶液中，37℃条件下溶解，制得丝蛋白溴化锂溶液；最后将所得溶液在截留分子量为3500Da的透析盒中透析3天后，得丝蛋白溶液，调节溶液质量百分浓度为5％；
(2)将步骤(1)制得的丝蛋白溶液与质量百分浓度为2％的海藻酸溶液在37℃条件下按体积比36:10混合，在速度为50rpm/min的漩涡振荡器上振荡5min，至混合均匀，然后在离心力为1500g下离心3min，除去溶液中的气泡；
(3)将步骤(2)离心后的混合液转移至聚四氟乙烯槽中，溶液的厚度为2mm，然后将此槽放置于37℃、吸风风速为0.3米/秒的通风橱中央，放置时间为24h，形成丝蛋白/海藻酸高分子膜；
(4)将丝蛋白/海藻酸高分子膜浸没于浓度为0.002M的氯化钙水溶液中，37℃下孵育2h，然后将所得高分子膜在300ml去离子水中浸泡30min，重复三次最后将高分子膜在300ml液氮溶液中冷冻10min；
(5)将冷冻的高分子膜在真空冷冻干燥机中冷冻干燥，真空冷冻干燥条件为：冷阱温度-55℃、真空度3～5Pa，时间18h，制得丝蛋白/海藻酸复合材料，即所述真皮组织仿生多孔支架。其中，丝蛋白的质量百分含量为90％，海藻酸的质量百分含量为10％。
实施例3
一种真皮组织仿生多孔支架的制备方法，具体制备步骤为：
(1)将10g蚕茧置于500ml的1M Na2CO3水溶液中沸煮30min，然后用去离子水润洗3次，制得蚕丝素纤维；然后将蚕丝素纤维置于10ml的1M溴化锂溶液中，37℃条件下溶解，制得丝蛋白溴化锂溶液；最后将所得溶液在截留分子量为3500Da的透析盒中透析3天后，得丝蛋白溶液，调节溶液质量百分浓度为5％；
(2)将步骤(1)制得的丝蛋白溶液与质量百分浓度为2％的海藻酸溶液在37℃条件下按体积比4:10混合，在速度为50rpm/min的漩涡振荡器上振荡5min，至混合均匀，然后在离心力为1500g下离心3min，除去溶液中的气泡；
(3)将步骤(2)离心后的混合液转移至聚四氟乙烯槽中，溶液的厚度为2mm，然后将此槽放置于37℃、吸风风速为0.3米/秒的通风橱中央，放置时间为24h，形成丝蛋白/海藻酸高分子膜；
(4)将丝蛋白/海藻酸高分子膜浸没于浓度为0.002M的氯化钙水溶液中，37℃下孵育2h，然后将所得高分子膜在300ml去离子水中浸泡30min，重复三次最后将高分子膜在300ml液氮溶液中冷冻10min；
(5)将冷冻的高分子膜在真空冷冻干燥机中冷冻干燥，真空冷冻干燥条件为：冷阱温度-55℃、真空度3～5Pa，时间18h，制得丝蛋白/海藻酸复合材料，即所述真皮组织仿生多孔支架。其中，丝蛋白的质量百分含量为50％，海藻酸的质量百分含量为50％。
对比例1
(1)将10g蚕茧置于500ml的0.02M Na2CO3水溶液中沸煮30min，然后用去离子水润洗3次，制得蚕丝素纤维；然后将蚕丝素纤维置于10ml 9.3M的溴化锂溶液中，37℃条件下溶解，制得丝蛋白溴化锂溶液；最后将所得溶液在截留分子量为3500Da的透析盒中透析3天后，得丝蛋白水溶液，调节溶液质量百分浓度为5％；
(2)将步骤(1)制得的溶液转移至聚四氟乙烯槽中，溶液的厚度为2mm，然后将此槽放置于37℃、吸风风速为0.3米/秒的通风橱中央，放置时间为24h，形成丝蛋白高分子膜；
(3)步骤(2)制得的高分子膜在300ml去离子水中浸泡30min，然后在液氮溶液中冷冻10min；
(4)将冷冻的高分子膜在真空冷冻干燥机中冷冻干燥，真空冷冻干燥条件为：冷阱温度-55℃、真空度5Pa，时间18h，制得纯丝蛋白膜。
通过扫描电子显微镜观察对比例所得纯丝蛋白膜的微观结构，如图2所示。由图2可以看出，纯丝蛋白膜内部微观结构含大量的板层结构，无显著多孔结构。
对比例2
(1)将10g蚕茧在500ml的0.02M Na2CO3水溶液中沸煮30min，然后用去离子水润洗3次，制得蚕丝素纤维；然后将蚕丝素纤维置于溴化锂溶液中，37℃条件下溶解，制得丝蛋白溴化锂溶液；最后将所得溶液在截留分子量为3500Da的透析盒中透析3天后，得丝蛋白溶液，调节溶液质量百分浓度为5％；
(2)将所得丝蛋白溶液与质量百分浓度为2％的海藻酸溶液在37℃条件下按体积比10:10混合，在速度为50rpm/min的漩涡振荡器上振荡5min，至混合均匀，然后在离心力为1500g下离心3min，除去溶液中的气泡；
(3)将步骤(2)离心后的混合液转移至聚四氟乙烯槽中，溶液的厚度为2mm，在300ml液氮溶液中冷冻10min后，在真空冷冻干燥机中冷冻干燥，冷阱温度-55℃、真空度3～5Pa，时间18h，得丝蛋白/海藻酸高分子膜；
(4)将步骤(3)制得的丝蛋白/海藻酸高分子膜在甲醇水溶液(V甲醇:V水＝1:1)中浸泡1h，得甲醇水溶液处理的丝蛋白/海藻酸膜；
(5)将经过步骤(4)处理的丝蛋白/海藻酸膜在300ml液氮溶液中冷冻10min；然后在真空冷冻干燥机中冷冻干燥，真空冷冻干燥条件为：冷阱温度-55℃、真空度5Pa，时间18h，制得丝蛋白/海藻酸复合材料。
测试例：
(1)通过观察真皮成纤维细胞和微血管内皮细胞在实施例1～3及对比例1所得材料中的黏附和增殖，考察其生物相容性及其作为伤口修复材料的性能。真皮成纤维细胞的接种密度为5×104/cm2，内皮细胞的接种密度为1×104/cm2，以DNA含量测定法定量测定两种细胞在材料中接种1天的黏附率和培养3天后的增殖率。测试结果见表1所示。
(2)按GB/T1040.3-2006测试实施例1～3及对比例2所得材料的力学性质。测试结果见表1所示。
(3)按GB/T16886.13-2001对实施例1～3及对比例2所得材料进行降解试验，选择的温度为37℃，试验溶液中胰酶浓度定为0.2IU/ml，降解时间为7天。测试结果见表1所示。
表1
通过表中所列数据可以看出，与对比例1相比，实施例所获得的多孔支架能够有效地促进真皮成纤维细胞、微血管内皮细胞的黏附和增殖；与对比例2相比，实施例所获得的多孔支架的降解速度减慢，其材料硬度降低。因此，以这些多孔支架作为真皮替代物有利于促进创面修复，其降解速度能够与真皮组织生成速度相匹配，更有效地发挥其作为真皮替代物的功能。材料的力学性质与真皮组织相似，有利于抑制瘢痕形成和促进功能性真皮组织再生，有望解决病理性瘢痕这一医学难题。
Claims (2)
1.一种真皮组织仿生多孔支架的制备方法，其特征在于所述真皮组织仿生多孔支架所含原料的质量百分数为：丝蛋白50％～90％，海藻酸10％～50％；具体制备步骤为：
(1)将蚕茧置于Na2CO3水溶液中沸煮30min，然后用去离子水润洗3次，制得蚕丝素纤维；然后将蚕丝素纤维置于溴化锂溶液中，37℃条件下溶解，制得丝蛋白溴化锂溶液；最后将所得溶液在截留分子量为3500Da的透析盒中透析3天后，得丝蛋白溶液，调节溶液质量百分浓度为5％；
(2)将步骤(1)制得的丝蛋白溶液与质量百分浓度为2％的海藻酸溶液在37℃条件下按体积比4～36:10混合，在速度为50rpm的漩涡振荡器上振荡5min，至混合均匀，然后在离心力为1500g下离心3min，除去溶液中的气泡；
(3)将步骤(2)离心后的混合液转移至聚四氟乙烯槽中，溶液的厚度为2mm，然后将此槽放置于37℃、吸风风速为0.3米/秒的通风橱中央，放置时间为24h，形成丝蛋白/海藻酸高分子膜；
(4)将丝蛋白/海藻酸高分子膜浸没于浓度为0.002M的氯化钙水溶液中，37℃下孵育2h，然后将所得高分子膜在300ml去离子水中浸泡30min，重复三次最后将高分子膜在300ml液氮溶液中冷冻10min；
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2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤(1)中所述Na2CO3水溶液浓度为0.01～1M；所述溴化锂溶液的浓度为1～20M。
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |