JP6893910B2 - 構造記憶特性を有する細胞増殖用足場 - Google Patents

Description

本発明は材料科学、組織工学及び再生医療の分野に適用される細胞増殖用足場に関し、具体的には構造記憶特性を有する細胞増殖用足場に関する。

病変、創傷又は外科手術によって人体の軟組織の欠損を引き起こすことが多く、人体自体の再生に所要の軟組織は現代医学が解決しなければならない難題である。国内外では様々な軟組織欠損修復用の充填材とドレッシングが開発されており、人工合成高分子材料と天然バイオマテリアルで製造されたヒドロゲル及び多孔質スポンジ類充填材を含む。動物組織を原料として、酸処理又は酵素処理して精製されたコラーゲンは、コラーゲンヒドロゲルに製造され、化学架橋処理を適宜に行うことによってヒドロゲル製剤におけるコラーゲンの安定性を高め、人体内で分解しにくくなる。コラーゲン懸濁液又はヒドロゲルを凍結乾燥して多孔質コラーゲンスポンジ材料に製造し、更なる化学架橋固定処理によって、スポンジ材料におけるコラーゲンの安定性を向上させるだけでなく、コラーゲンスポンジ材料の多孔質構造特性を保持することもできる。多孔質コラーゲンスポンジ材料は臨床医学において創傷の止血、組織欠損部位の充填、及び薬物担体等に広く用いられている。

中国特許文献ＣＮ１２３５９４７Ｃ、ＣＮ１０１５４９１７１Ｂはそれぞれ、このようなコラーゲンスポンジ材料を製造する具体的な方法を提案している。特許文献ＣＮ１２３５９４７Ｃには、常温で、塩酸又は酢酸溶液で豊富なコラーゲンを含有する動物組織（皮膚、軟骨、靭帯、腱等）を浸漬させ、酵素分解して動物組織細胞外コラーゲンフレームワークを得て、研磨しホモジェナイズ処理してコラーゲン懸濁液を得て、コラーゲン懸濁液を金型に注入し、加圧成形し、凍結乾燥してコラーゲンスポンジ充填剤を得て、凍結乾燥前又は凍結乾燥後に化学架橋剤で処理するという技術案が提案されている。特許文献ＣＮ１０１５４９１７１Ｂには、高純度のＩＩ型コラーゲン溶液を抽出した後、ポリエチレングリコールでＩＩ型コラーゲン溶液を濃縮し、次にカルボジイミド及びＮ−ヒドロキシスクシンイミドを架橋剤として濃縮後のＩＩ型コラーゲンを架橋し、凍結乾燥してコラーゲンスポンジを得るという技術案が提案されている。

上記の技術案はいずれも化学架橋によってコラーゲンスポンジを得るが、欠陥も明らかであり、即ち、酸性化及び酵素分解により製造されたコラーゲンスポンジは安定性が劣り、生物学的活性が不足し分解速度が速すぎる等の欠点がある。

また、技術分野では、コラーゲンスポンジの製造過程でヒアルロン酸ナトリウム、キトサン、キチン、コンドロイチン硫酸等のほかの生体高分子材料を添加することによって複合スポンジ材料を製造し、且つコラーゲンスポンジの生物学的特性を向上させるという手法もある。例えば、中国特許文献ＣＮ１０１８６２４７５Ｂには、コラーゲン溶液にヒアルロン酸ナトリウムを添加し、化学架橋によって複合したコラーゲン材料を得るという技術案が提案されている。中国特許文献ＣＮ１０３００７３３６Ａには、魚皮コラーゲンにキトサンを添加し、凍結乾燥して架橋を行い、さらに二次凍結乾燥して魚皮コラーゲンベース複合スポンジを製造するという技術案が提案されている。化学架橋処理によってコラーゲンスポンジの安定性を高め、ヒアルロン酸やキトサン等のほかの生体高分子を含有するコラーゲンスポンジ複合材が生物学的活性に優れているが、放射線滅菌後に、これらのスポンジ材料の安定性が著しく低下し、大面積の軟組織充填又は創傷修復時に深刻な炎症が生じやすくなってしまう。

上記技術案は、化学架橋処理によってコラーゲンスポンジの安定性を高め、且つヒアルロン酸やキトサン等のほかの生体高分子を含有するコラーゲンスポンジ複合材が生物学的活性に優れている。それにも関わらず、実際に、放射線滅菌後にこれらのスポンジ材料の安定性が著しく低下し、特に大面積の軟組織充填又は創傷修復時に深刻な炎症が生じやすい問題がある。

米国特許文献ＵＳ２０１２／０２６３７６３Ａ１には、繊維化後の脱細胞化に基づく組織マトリックススポンジ材料が記載されている。該材料の製造方法は、豚の皮を原料として、脂肪除去、凍結超薄切片、脱細胞化と脱抗原化、洗浄、繊維化ホモジェナイズ、ウイルス不活性化、滅菌を行い、脱細胞化マトリックス懸濁液を凍結乾燥して組織マトリックススポンジ材料を製造し、凍結乾燥したスポンジ材料をエチレンオキシド又は放射線で滅菌することである。該方法の積極的な効果については、化学架橋を行わずに、該細胞外組織マトリックス材料の元の組織マトリックスの基本構造特徴を良好に保持し、コラーゲン成分に加えて、ほかの重要な細胞外組織マトリックス成分、例えばエラスチン、フィブリン、プロテオグリカン等をさらに含み、製造プロセスには酸処理、酵素分解処理が不要になり、該スポンジ材料は生体適合性に優れ、宿主細胞の急速な成長をサポートし、コラーゲンの安定性が高く、炎症反応を低減させる。しかしながら、この方法によって得られる該スポンジ材料は構造強度が劣り、弾性が低く、加圧された場合に崩れやすく変形しやすく、元の材料の構造を保持不能であり、元の形状が回復不能であるという問題がある。

上記文献に開示された技術的方法をまとめたところ、顕著な問題については、酸分解又は酵素分解して精製されたコラーゲンヒドロゲルで多孔質コラーゲンスポンジ材料を製造する場合であっても、脱細胞化してホモジェナイズされた組織マトリックス材料懸濁液で多孔質コラーゲンスポンジ材料を製造する場合であっても、従来の技術では、ヒドロゲル又は懸濁液を凍結乾燥し、更なる化学架橋処理によって材料の機械的強度とスポンジ材料におけるコラーゲンの安定性を向上させ、化学架橋処理によって、組織マトリックス材料は元々多孔細胞増殖用足場として持つ多くの優れた天然特性を失ってしまう。

ＣＮ１２３５９４７Ｃ ＣＮ１０１５４９１７１Ｂ ＣＮ１２３５９４７Ｃ ＣＮ１０１５４９１７１Ｂ ＣＮ１０１８６２４７５Ｂ ＣＮ１０３００７３３６Ａ ＵＳ２０１２／０２６３７６３Ａ１

本発明が解決しようとする技術的問題は、優れた生体適合性及び完全な生分解性を有するとともに、細胞増殖、インビボ及びインビトロでの組織や臓器の成長をサポートする構造記憶特性を有する細胞増殖用足場を提供することである。

従って、本発明が前記問題を解決する技術的解決手段は以下のとおりである。

細胞増殖用のマトリックス材料を含む構造記憶特性を有する細胞増殖用足場であって、前記足場は繊維直径が２〜２５０ミクロン、長さが１００〜３０００ミクロンの微繊維状又は絮状の脱細胞化組織マトリックス材料と、粒子直径が２〜１５０ミクロンの酸性化処理されたヒドロゲル状の脱細胞化組織マトリックス材料とを、それぞれ乾燥重量比で混合した後、金型注入、凍結押し出し、再交絡、放射工程を行うことによって構成され、細胞増殖用のマトリックス材料は前記細胞増殖用足場のマトリックス材料であり、マトリックス材料は脱細胞化組織マトリックス材料の総含有量が１０〜１００ｍｇ／ｃｍ^３であり、細胞増殖用足場の全ギャップ率が９０〜９９％であり、口径の２５ミクロンより大きいギャップ率が８０〜９８％であることを特徴とする。

好適には、前記足場は微繊維状又は絮状の脱細胞化組織マトリックス材料が乾燥重量比（dry weight mass proportion）で６０％〜９０％であり、前記酸性化処理されたヒドロゲル状の脱細胞化組織マトリックス材料が乾燥重量比で４０％〜１０％である。

好適には、前記金型注入工程では、微繊維状又は絮状の脱細胞化組織マトリックス材料と酸性化処理されたヒドロゲル状の脱細胞化組織マトリックス材料を均一に混合して懸濁液を形成して金型に注入する。

好適には、前記凍結工程では、−２０℃の条件下で金型内における混合懸濁液を氷結し、氷晶を押し出して再交絡させてγ線放射処理を行う。

好適には、前記押し出し、再交絡工程では、氷晶を押し出し懸濁液における微繊維状又は絮状の脱細胞化組織マトリックス材料と酸性化処理されたヒドロゲル状の脱細胞化組織マトリックス粒子材料を再交絡させて、安定した三次元構造及び構造記憶特徴を有する多孔質細胞増殖用足場材料を製造する。

好適には、前記足場モデリング工程では、安定した三次元構造及び構造記憶特徴を有する多孔質細胞増殖用足場材料を、様々な形態の足場製品に製造する。

好適には、前記凍結工程では、金型内における混合懸濁液に対して凍結−融解過程を少なくとも２回以上行う。

従来技術に比べて、本発明の積極積な効果は明らかであり、該細胞増殖用足場は化学架橋が不要で、生物学的活性を有し、安定した三次元構造及び構造記憶特徴を有する多孔質細胞増殖用足場であり、繊維又は絮状の組織材料と酸性化されたヒドロゲル材料とを所定比率で混合して、凍結／融解押し出し及び放射工程を行ってなる特殊特性を有する多孔質材料である。該足場は優れた生体適合性及び完全な生分解性を有するとともに、細胞増殖、インビボ及びインビトロでの組織や臓器の成長をサポートし、人体の軟組織創傷と欠損の修復に適する。

図１は本発明の一実施例の構造模式図である。 図２は図１に示される足場製品の示差走査熱量計（ＤＳＣ）のサーモグラムである。 図３は足場製品を構成する２種類の材料の安定性と粒子直径との関係の曲線を 示したものである。 図４は図１に示される足場製品の示差走査熱量計のサーモ グラムである。

本発明は構造記憶特性を有する細胞増殖用足場に関し、以下の実施例では、前記細胞増殖用足場の構造特徴を説明する。

例えば図１に示すのは、本発明に係る一部の製品の形態構造及び説明であり、図中では、（Ａ）は円板状と円筒状の細胞増殖用足場を示し、（Ｂ）は直径が１．８センチ、高さが３．０センチの柱状細胞増殖用足場の（指で握られる）加圧作用での収縮形態を示し、（Ｃ）は（指で握られる）加圧解除後に足場が元の安定した三次元構造と形状に完全に回復することを示す。

例えば図２に示すように、０．５％のデオキシコール酸ナトリウム溶液で脱細胞化された組織マトリックス材料の示差走査熱量計（ＤＳＣ）のサーモグラムであり、図中では、（Ａ）は微繊維状又は絮状の脱細胞化組織マトリックス材料を示し、（Ｂ）は５０ｍＭの酢酸溶液で処理された脱細胞化組織マトリックスヒドロゲル状粒子を示し、（Ｃ）は７０％の微繊維状の脱細胞化組織マトリックス材料と３０％の酸性化処理されたヒドロゲル状の粒子で製造してなる細胞増殖用足場を示す。

例えば図３に示すように、０．５％のデオキシコール酸ナトリウム溶液で脱細胞化処理され、５０ｍＭの酢酸で処理された脱細胞化組織マトリックスヒドロゲル状粒子の安定性と粒子直径との関係を示した曲線である。

例えば図４に示すように、０．５％のドデシル硫酸ナトリウム溶液で脱細胞化された組織マトリックス材料の示差走査熱量計（ＤＳＣ）のサーモグラムであり、図中では、（Ａ）は微繊維状又は絮状の脱細胞化組織マトリックス材料を示し、（Ｂ）は５０ｍＭの酢酸溶液で処理された脱細胞化組織マトリックスヒドロゲル状粒子を示し、（Ｃ）は８０％の微繊維状の脱細胞化組織マトリックス材料と２０％の酸性化処理されたヒドロゲル状の粒子で製造してなる細胞増殖用足場を示す。

上記図面は、一般外科、整形外科、形成外科、組織工学及び再生医療等の分野に広く用いられている構造記憶特性を有する細胞増殖用足場を説明する。

細胞増殖用のマトリックス材料とは、性質が異なる２種類の脱細胞化組織マトリックス材料を所定比率で構成される材料であり、具体的には、脱細胞化組織マトリックス材料は人体又は動物の皮膚、軟骨、血管、半月板、胃、小腸、大腸、隔膜、腱、靭帯、神経組織、膀胱、及び尿道等由来ものを含むが、それらに限定されない。豊富なコラーゲンを含有した組織を切断して分離し、１〜２０ミリメートルの小塊又は小片に切断して入手する。

性質が異なる２種類の脱細胞化組織マトリックス材料を入手した後、構造記憶特性を有する細胞増殖用足場を製造できる。例えば、まず、生体細胞増殖用足場の組織構造問題を解決し、本例に係る足場は、繊維直径が２〜２５０ミクロン、長さが１００〜３０００ミクロンの微繊維状又は絮状の脱細胞化組織マトリックス材料と粒子直径が２〜１５０ミクロンの酸性化処理されたヒドロゲル状の脱細胞化組織マトリックス材料とを、それぞれ乾燥重量比で混合した後、金型注入、凍結、押し出し、放射、再交絡工程を行うことによって構成され、ここで、細胞増殖用のマトリックス材料は細胞増殖用足場のマトリックス材料であり、マトリックス材料は脱細胞化組織マトリックス材料の総含有量を１０〜１００ｍｇ／ｃｍ^３とし、細胞増殖用足場の全ギャップ率を９０〜９９％範囲内に、口径の２５ミクロンより大きいギャップ率を８０〜９８％範囲内に限定すべきである。細胞増殖用足場の製造過程では、好適には、足場における微繊維状又は絮状の脱細胞化組織マトリックス材料は乾燥重量比で６０％〜９０％であり、酸性化処理されたヒドロゲル状の脱細胞化組織マトリックス材料は乾燥重量比で４０％〜１０％であり、金型注入工程では、微繊維状又は絮状の脱細胞化組織マトリックス材料と酸性化処理されたヒドロゲル状の脱細胞化組織マトリックス材料とを均一に混合して懸濁液を形成して金型に注入し、凍結工程では、−２０℃の条件下でγ線放射処理を行い、金型内における混合懸濁液を氷晶にし、又は少なくとも２回以上の凍結−融解過程によって金型内における混合懸濁液に対して凍結工程を行い、押し出し、再交絡工程では、氷晶を押し出し懸濁液における微繊維状又は絮状の脱細胞化組織マトリックス材料と酸性化処理されたヒドロゲル状の脱細胞化組織マトリックス粒子材料を再交絡させて、安定した三次元構造及び構造記憶特徴を有する多孔質細胞増殖用足場材料を製造する。上記工程を行って、安定した三次元構造及び構造記憶特徴を有する多孔質細胞増殖用足場材料を、様々な形態の足場製品に製造する。

Claims (2)

1. 多孔質細胞増殖用足場の製造方法であって、
   ａ 豊富なコラーゲンを含有する組織の１〜２０ミリメートルの小片をデオキシコール酸ナトリウム溶液で脱細胞化及び微細繊維化して、繊維直径が２〜２５０ミクロン、長さが１００〜３０００ミクロンの微繊維状又は絮状の脱細胞化組織マトリックス材料を調製する工程、
   ｂ 微繊維状又は絮状の脱細胞化組織マトリックス材料を酢酸溶液で酸性化処理して、粒子直径が２〜１５０ミクロンのヒドロゲル状の脱細胞化組織マトリックス材料を調製する工程、
   ｃ 工程ａで得られた微繊維状又は絮状の脱細胞化組織マトリックス材料、及び工程ｂで得られたヒドロゲル状の脱細胞化組織マトリックス材料に対してそれぞれ懸濁液を調製し、そしてその調製した懸濁液を混合し、ここにおけるその混合は、工程ａで得られた微繊維状又は絮状の脱細胞化組織マトリックス材料と、工程ｂで得られたヒドロゲル状の脱細胞化組織マトリックス材料とを乾燥重量比６０：４０〜９０：１０で混合する、というものである工程、
   ｄ 金型内の混合懸濁液を−２０℃以下の条件下で凍結し、氷結時に氷晶が微繊維状又は絮状の脱細胞化組織マトリックス材料とヒドロゲル状の脱細胞化組織マトリックス粒子材料を押圧することによって再交絡させる工程、
   ｅ 凍結の状態でγ線放射処理を行う工程、
   を含む工程からなり、
   多孔質細胞増殖用足場における脱細胞化組織マトリックス材料の総含有量が１０〜１００ｍｇ／ｃｍ^３であり、多孔質細胞増殖用足場の全ギャップ率が９０〜９９％であり、口径の２５ミクロンより大きいギャップ率が８０〜９８％であり、安定した三次元構造および記憶特性構造を有する、
   上記製造方法。
2. 前記ｄ工程は、金型内における混合懸濁液に対して少なくとも２回以上の凍結過程を行うことを含むことを特徴とする請求項１に記載の製造方法。

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