RO128003B1 - Procedeu de obţinere a conductorilor pentru ghidare nervoasă şi conductorii obţinuţi cu acesta - Google Patents

Description

Invenția se referă la conductori nervoși biocompatibili, din colagen fibrilar tip I reticulat, pentru repararea nervilor periferici, și la un procedeu de obținere a acestora.

Leziunile sistemului nervos afectează peste 90000 de oameni în fiecare an. Defectele nervoase periferice sunt foarte frecvente în practica clinică și, adesea, duc la invaliditate permanentă. Odată lezat, țesutul nervos este greu de regenerat, în special atunci când un defect nervos este fragmentat pe o suprafață întinsă.

Pentru a mări perspectiva regenerării axonilor și recuperarea funcțională, au fost utilizate numeroase proceduri de grefare, inclusiv implantarea de autogrefe, alogrefe și xenogrefe. în prezent, tehnica clinică pentru reconstrucția nervilor periferici lezați este utilizarea de grefe nervoase autologe. Totuși, această metodă are și o serie de dezavantaje, incluzând intervențiile chirurgicale extinse, pierderea funcției de donator a nervilor, oferta limitată de nervi a donatorilor etc. Astfel, au fost investigate și alte metode chirurgicale, inclusiv alogrefa, organele sau țesuturile autologe sau autogene, vasele de sânge și mușchii scheletici. Cu toate acestea, ca urmare a respingerii imunologice, au fost realizate numai câteva succese. Datorită dezvoltării ingineriei tisulare, există posibilitatea din ce în ce mai mare de utilizare de conductori biodegradabili pentru reconstrucția defectelor nervoase.

Conductorii nervoși sunt structuri tubulare utilizate la acoperirea defectelor nervoase mari, acționând astfel ca ghid pentru regenerarea axonilor, și ca barieră împotriva țesutului cu escare.

Există numeroase tehnici de fabricare a polimerilor pentru obținerea conductorilor nervoși. Polimerii naturali utilizați pentru fabricarea conductorilor nervoși includ chitosanul, colagenul, gelatina, acidul hialuronic (HA) și fibrele de mătase. Acești polimeri oferă biocompatibilitate excelentă, reprezintă un suport ideal pentru atașarea și funcționalizarea celulelor, scad frecvența răspunsului imun, furnizează semnale corespunzătoare celulelor, fără a necesita factori de creștere, și pot fi degradați de enzime naturale. Totuși, polimerii naturali prezintă variații și necesită purificare și caracterizare de la lot la lot. Mai mult, cei mai mulți nu au rezistență mecanică bună, și se degradează in vivo relativ repede. Adesea polimerii naturali necesită modificări chimice și reticulări sau combinații cu alte componente structurale, cum arfi polimerii sintetici cu proprietăți mecanice bune. Datorită temperaturii lor de denaturare scăzute și stabilității termice, polimerii naturali sunt în general fabricați la temperatura camerei, prin injectare, imersare și electrofilare din soluții de polimeri.

Datorită biocompatibilității și biodegradabilității excelente, structurii bine definite, caracteristicilor biologice și modului în care interacționează cu organismul, colagenul reprezintă unul dintre cele mai utilizate biomateriale. Extras sub formă de soluție apoasă sau gel, colagenul fibrilar tip I poate fi modelat în diferite forme: dispozitive medicale, implanturi artificiale, tuburi, suporturi pentru cedarea medicamentelor și schelete (scaffold) pentru regenerare tisulară, cu rol important în prezent în medicină.

Polimer natural, colagenul este constituit din 20 de aminoacizi, aranjați în secvențe caracteristice, care formează o structură conformațională unică de triplu helix. Colagenul tip I este cel mai abundent, reprezentând circa 80% din totalul țesuturilor conjunctive. Acesta este tipul pe baza căruia s-au obținut cele mai multe informații legate de structura proteinelor colagenice. Datorită proprietăților hidrofile date de structura moleculară, caracterizată prin conținutul mare de aminoacizi diaminici și dicarboxilici, conferă o interfață adecvată pentru adeziunea și migrarea celulară.

în general, un conductor nervos ideal trebuie să fie ne-citotoxic, foarte permeabil, suficient de flexibil, cu o viteză de degradare corespunzătoare, ca să poată furniza regenerarea axonilor, și să prezinte răspunsuri inflamatorii minime.

RO 128003 Β1

Pe plan mondial, realizarea conductorilor nervoși este un subiect foarte cercetat. în 1 continuare sunt prezentate invenții referitoare la realizarea conductorilor nervoși care au la bază colagenul, ca polimer natural. 3

Brevetul KR 0018214 se referă la tuburi de colagen cu un perete format dintr-o succesiune de filme de colagen cilindrice, continue, coaxiale. Aceste tuburi pot fi utilizate în 5 chirurgie, în special pentru regenerarea nervoasă. Brevetul RO 123177 descrie compoziția unui material biocompatibil și procesarea acestuia. Compoziția revendicată este un amestec 7 de: poliuretan și colagen; poliuretan, colagen și elastină; poliuretan, colagen, elastină și acid hialuronic; colagen, elastină și condroitin sulfat, cu o bună capacitate de extrudere, și o bună 9 biocompatibilitate pentru dispozitive medicale (tuburi pentru pompe peristaltice). Acest brevet revendică introducerea polimerilor solizi într-o soluție de poliuretan în dimetil formaldehidă 11 la 6O...7O°C, cu îndepărtarea solventului. Brevetul US 170664 prezintă un tub de colagen tip I, de origine porcină, și tip IV, în raport de 1:1, format din membrană de colagen BioBrane. 13 Tuburile realizate în acest brevet au diametru 0,5...5 mm și 10...100 mm lungime. Invenția EP 0906764 descrie formarea unui tub de colagen prin înghețarea unei suspensii, urmată 15 de liofilizare sau uscare cu solvent într-o succesiune de alcool izopropilic anhidru. Suspensia este turnată într-un tub cu ambele capete deschise, iar partea centrală va fi îndepărtată. 17 Suspensia de colagen este preparată din colagen liofilizat, și ajustată la 1% și pH = 3, iar tuburile sunt solubile în apă. Brevetul US 5292802 prezintă tuburi din colagen conjugat la 19 polietilen glicol, obținute prin extrudere sau turnare, urmată de deshidratare. Brevetul US 4863668 descrie o metodă de formare a nervilor periferici dintr-un material fibrină- 21 colagen reticulate cu o soluție stock 25% glutaraldehidă și 37,5% formaldehidă. Materialul este multistratificat, conținând straturi alternate de fibrină și colagen. Brevetul US 4814120 23 se referă la procesul de obținere a nervilor periferici prin extruderea unui gel acid de colagen de concentrație 1,5%, urmată de coagularea pereților interni și externi într-o baie de 25 coagulare de 70% acetonă și 30% amoniac, urmată de uscare și, în final, reticulare. Brevetul WO 004971 descrie un conductor nervos format dintr-un material polimeric ce este acoperit 27 pe suprafața interioară cu colagen și factori de creștere, și este echipat cu un dispozitiv de stimulare electrică. Invenția CN 101138656 relatează realizarea unui nerv de colagen cu 29 chitosan în forma acid în volume corespunzătoare. Brevetul US 2019087 se referă la realizarea nervilor periferici multistrat, utilizând laminină și colagen tip I. Deși au fost 31 dezvoltați mulți conductori nervoși pe bază de colagen, pentru a fi utilizați în repararea nervilor periferici, aceștia au fost extrudați într-o baie de solvent sau uscați liber, prin 33 evaporarea solventului, ceea ce poate implica citotoxicitate; pentru prepararea lor au fost utilizate combinații de polimeri sintetici; majoritatea sunt degradabili în apă, au compoziții cu 35 pH acid. RO 127812 B1 se referă un biocompozit pentru conducte nervoase, pe bază de alcool polivinilic și colagen, necesar regenerării nervilor periferici, și la un procedeu pentru 37 obținerea acestuia. Conform invenției, conductele nervoase se prezintă sub formă de membrane tubulare, cu o grosime a peretelui de la 0,1 până la 0,3 mm sau de 0,05 până 39 la 0,2 mm, în funcție de tipul de colagen utilizat, și de raportul de asociere a componentelor. Procedeul de obținere a biocompozitului constă în prepararea și condiționarea membranelor 41 de biocompozit dintr-o soluție 10% de alcool polivinilic și colagen nedenaturat, în raport de 1:1, sau o soluție 10% de alcool polivinilic și o soluție 10% de colagen hidrolizat, după care 43 membranele se reticulează, se spală succesiv cu soluție de clorură de sodiu și apă, membranele se taie în bucăți, se umectează, se rulează pe bare de teflon, se usucă la etuvă 45 și se sterilizează cu radiații UV, iar US 7084082 B1 se referă la realizarea unui material de colagen cu proprietăți fizice într-o măsură care să permită suturare păstrând în același timp 47

RO 128003 Β1 proprietățile biochimice inerente pe care le are colagenul; acesta își reține forma pentru o anumită perioadă de timp, chiar și după utilizarea lui în corp; la procesul de producere și la un material medical pe care se bazează, exemple care includ un tub artificial pentru nervi, tub artificial pentru măduva spinării, esofag artificial, trahee artificială, vas de sânge artificial, valvă artificială sau membrane medicale alternative, cum arfi endocraniu artificial, ligamente artificiale, tendoane artificiale, suturi chirurgicale, proteze chirurgicale, armare chirurgicală, materiale de protecție a rănii, piele artificială și cornee artificială, caracterizate prin umplerea sau având în interior o substanță ce are biocompatibilitate, care poate fi degradată și absorbită în organism într-o matrice cu structură multi-element non-țesătură a fibrelor de colagen având fibre ultrafine de colagen, ca unitate de bază.

Problema tehnică pe care o rezolvă invenția constă în prezentarea unui procedeu de reticulare și condiționare a colagenului, astfel încât să rezulte conductori nervoși în formă tubulară, de diferite dimensiuni și grosimi, care să fie resorbabili și să regenereze țesutul întro perioadă de timp stabilită.

Procedeul conform invenției înlătură dezavantajele de mai sus prin aceea că pielea crudă de vițel se supune gonflării prin tratament cu acid acetic 0,5M, timp de 5...7 zile, se depilează mecanic, se îndepărtează epiderma și grăsimea, reținându-se doar derma, care se supune unui tratament cu NaOH 10% la pH alcalin și sulfat de sodiu 1M, timp de 24 h, la temperaturi de 15...25°C, apoi unui tratament cu acid clorhidric 1N la temperaturi de 22°C, timp de 24 h, când se formează un gel consistent care se filtrează, se omogenizează și se maturează 24 h la 4°C, gelul de colagen astfel obținut, având o concentrație de 1,2...2%, se reticulează cu glutaraldehidă 0,1 ...1%, obținându-se un colagen reticulat care se toarnă în 2 cilindri concentrici de polietilenă, deschiși la ambele capete, se îngheață la -40°C, pentru a forma un hidrogel poros care se imersează într-o soluție de tampon, în raport de 80:20 de fosfat:alcool etilic, și se usucă la 26°C, obținându-se conductori poroși transparenți.

Prin aplicarea invenției se obțin următoarele avantaje:

- conductorii nervoși din colagen sunt naturali, fiind realizați doar din colagen reticulat;

- conductorii se degradează în timp;

- conductorii au o porozitate bine determinată;

- metoda de obținere combină mai multe tehnici, ca turnarea, înghețarea, imersarea în soluție și uscarea la o anumită temperatură, ceea ce conferă conductorului realizat stabilitate fizico-chimică și mecanică, și se menține suplețea colagenului fibros;

- reducerea efectului toxic al polimerilor sintetici, prin utilizarea unui polimer natural, colagen recunoscut de organism ca un constituent al său, și nu ca un material străin;

- obținerea unor conductori nervoși, printr-o combinație de procedee simple și într-un timp scurt (3 zile), care atrage costuri mult sub cele aflate pe piață în acest moment;

- regenerarea regiunilor nervoase, prin aplicarea conductorilor nervoși în chirurgia plastică și reparatorie, scade numărul cazurilor de invaliditate într-un timp scurt, și redă capacitatea socio-profesională a pacienților.

Conductorii nervoși, conform invenției, înlătură dezavantajele menționate prin aceea că sunt constituiți dintr-un polimer natural, colagen fibrilar tip I, obținut din derma pielii de vițel, sub formă de gel, cu structură nativă triplu helicoidală, după un procedeu special. Pentru prepararea gelului de colagen s-a utilizat piele crudă de vițel. Pielea a fost depilată mecanic, îndepărtându-se părul, apoi s-a îndepărtat epiderma și grăsimea după cum urmează: pentru a obține dermă pretratată, pielea crudă de vițel a fost supusă în prealabil tratamentului acid cu acid acetic 0,2...1 M, timp de 2...10 zile (în funcție de vârsta animalului), în urma acestui tratament pielea a suferit un proces de umflare, și cele trei straturi ale sale: epiderma, derma și hipoderma, s-au delimitat foarte clar. S-a reținut doar derma, care s-a spălat cu apă din abundență, până când flota de spălare a ajuns la un pH de 5...8.

RO 128003 Β1

Derma pretratată s-a supus apoi unui tratament alcalin (pH = 10), constituit din NaOH 1 8...14% și sulfat de sodiu 1...3M, timp de 24 h, la temperaturi cuprinse între 15 și 25°C.

Pentru îndepărtarea urmelor de grăsime și a proteinelor digerate de tratamentul bazic, pielea 3 a fost spălată timp de 2 zile, până când flota a ajuns la pH-ul 6...7. Aceste operații de spălare-neutralizare sunt necesare în vederea dizolvării acide, deoarece o trecere bruscă 5 a colagenului din mediul bazicîn mediul acid arfi împiedicat dizolvarea din cauza precipitării sărurilor pe fibrele de colagen. îndepărtarea alcaliilor s-a verificat prin tratarea flotei cu o 7 soluție de clorură de bariu 1...5%. Acestea se tratează mai departe cu o soluție de acid clorhidric 1N la temperatura de 22°C. După 24 h se formează un gel consistent, care se trece 9 printr-o sită, pentru reținerea eventualelor porțiuni negelifiate. Gelul de colagen obținut s-a omogenizat cu un agitator cu paletă, s-a lăsat la maturare timp de 24 h la 4°C. Gelul de 11 colagen cu o concentrație de 1...3% colagen (substanță uscată) a fost reticulat cu o soluție 0,1... 1 % glutaraldehidă în apă distilată. Procedeul de obținere a conductorilor nervoși constă 13 în aceea că, în prealabil, gelul de colagen reticulat este turnat la o temperatură de 4°C între 2 tuburi concentrice (de dimensiuni diferite), din polietilenă, cu ambele capete deschise. 15 După turnare, acestea se îngheață la O...-4O°C, timp de 2...24 h. După dezghețare se formează un hidrogel sub formă tubulară. Acesta este imersat într-o soluție tampon fosfat, 17 pentru îndepărtarea glutaraldehidei nereacționate, și alcool etilic, pentru o reticulare și sterilizare suplimentară, timp de 1...24 h. După imersare, hidrogelurile de colagen sub formă 19 tubulară sunt uscate într-o etuvă la 24...36°C. Se formează conductori nervoși de colagen transparenți, cu o dimensiune a diametrului intern de 0,5...2,5 mm și 1 ...10 cm lungime 21 (fig. 1), cu structura poroasă, cu pori de 5...20 pm (fig. 2a - secțiune, și fig. 2b - suprafață), și biocompatibili cu celulele astrocite și neuroni. 23

Colagenul fibrilar tip I, sub formă de gel, s-a preparat din piele crudă de vițel (vârsta 1 an), după cum urmează: pielea crudă de vițel a fost supusă în prealabil tratamentului acid 25 cu acid acetic 0,5 M, timp de 5...7 zile (în funcție de vârsta animalului). După gonflare, pielea a fost depilată mecanic, îndepărtându-se părul, apoi s-a îndepărtat epiderma și grăsimea. 27 Derma reținută a fost spălată cu apă din abundență, până când flota de spălare a ajuns la un pH de 7. Derma pretratată s-a supus apoi unui tratament alcalin (pH = 10), constituit din 29 NaOH 10% și sulfat de sodiu 1M, timp de 24 h, la temperaturi cuprinse între 15 și 25°C.

Pentru îndepărtarea urmelor de grăsime și a proteinelor digerate de tratamentul bazic, pielea 31 a fost spălată timp de 2 zile, până când flota a ajuns la pH-ul 6...7. Acestea se tratează mai departe cu o soluție de acid clorhidric 1N la temperatura de 22°C. După 24 h se formează 33 un gel consistent, care se trece printr-o sită, pentru reținerea eventualelor porțiuni negelifiate.

Gelul de colagen obținut s-a omogenizat cu un agitator cu paletă, s-a lăsat la maturare timp 35 de 24 h la 4°C.

Invenția va fi explicată mai în detaliu prin următoarele 8 exemple în legătură cu 37 figurile ce reprezintă:

- fig. 1, conductorii nervoși obținuți la diferite dimensiuni; 39

- fig. 2, imagini de microscopie electronică a conductorului nervos.

Exemplul 1 41 în această invenție a fost utilizat gelul de colagen fibrilar tip I obținut ca în descrierea de mai sus, având o concentrație gravimetrică de 1,2%, 98,55% apă distilată și pH-ul 2,5, 43 pH-ul gelului de colagen a fost ajustat la 7,4 cu 1M hidroxid de sodium, și apoi a fost reticulat cu 0,25% glutaraldehidă. Gelul reticulat a fost turnat la o temperatură de 4°C între 2 tuburi 45 concentrice (de dimensiuni între 0,5 și 2,5 mm), din polietilenă, cu ambele capete deschise.

RO 128003 Β1

După turnare, acestea se îngheață la -40°C timp de 24 h. După dezghețare se formează un hidrogel sub formă tubulară. Acesta este imersat într-o soluție tampon fosfatalcool etilic (50:50), timp de 24 h. După imersare, hidrogelurile de colagen sub forma tubulară sunt uscate într-o etuvă la 26°C. Se formează conductori nervoși de colagen, transparenți, cu o dimensiune a diametrului intern de 0,5...2,5 mm și 1...10 cm lungime.

Exemplul 2

Gelul de colagen a fost obținut prin procesul descris în exemplul 1, exceptând cantitatea de colagen, care a fost 2% (substanță uscată). Procesele de turnare, înghețare, imersare și uscare au fost similare cu cele descrise în exemplul 1. S-au obținut conductori nervoși cu o dimensiune a diametrului intern de 0,5...2,5 mm și 1...10 cm lungime.

Exemplul 3

Gelul de colagen a fost obținut ca în procedeul descris în exemplul 2, cu excepția faptului că glutaraldehida a fost în cantitate de 0,5%. Procesele de turnare, înghețare, imersare și uscare au fost similare cu cele descrise în exemplul 2. S-au obținut conductori nervoși cu o dimensiune a diametrului intern de 0,5...2,5 mm și 1...10 cm lungime.

Exemplul 4

Gelul de colagen a fost obținut ca în procedeul descris în exemplul 3, cu excepția faptului că a fost 2,5% colagen (substanță uscată). Procesele de turnare, înghețare, imersare și uscare au fost similare cu cele descrise în exemplul 3. S-au obținut conductori nervoși cu o dimensiune a diametrului intern de 0,5...2,5 mm și 1...10 cm lungime.

Exemplul 5

Gelul de colagen a fost obținut ca în procedeul descris în exemplul 4, cu excepția faptului că a fost 1% glutaraldehidă. Procesele de turnare, înghețare, imersare și uscare au fost similare cu cele descrise în exemplul 4. S-au obținut conductori nervoși cu o dimensiune a diametrului intern de 0,5...2,5 mm și 1 ...10 cm lungime.

Exemplul 6

Gelul de colagen a fost obținut și reticulat. Procesele de turnare, înghețare și uscare au fost aceleași cu cele descrise în exemplul 5, cu excepția soluției de imersare, care a fost soluție tampon fosfat:alcool etilic (100:0). S-au obținut conductori nervoși cu o dimensiune a diametrului intern de 0,5...2,5 mm și 1 ...10 cm lungime.

Exemplul 7

Gelul de colagen a fost obținut și reticulat. Procesele de turnare, înghețare și uscare au fost aceleași cu cele descrise în exemplul 6, cu excepția soluției de imersare care a fost soluție tampon fosfat:alcool etilic (0:100). S-au obținut conductori nervoși cu o dimensiune a diametrului intern de 0,5...2,5 mm și 1 ...10 cm lungime.

Exemplul 8

Gelul de colagen a fost obținut și reticulat. Procesele de turnare, înghețare și uscare au fost aceleași cu cele descrise în exemplul 7, cu excepția soluției de imersare care a fost soluție tampon fosfat:alcool etilic (80:20). S-au obținut conductori nervoși cu o dimensiune a diametrului intern de 0,5...2,5 mm și 1 ...10 cm lungime.

Conductorii nervoși obținuți în această invenție reprezintă biomateriale pentru ingineria tisulară de regenerare nervoasă, și sunt utilizați în chirurgia plastică și reparatorie.

Claims (2)

1. Revendicări 1

   1. Procedeu de obținere a conductorilor pentru ghidare nervoasă, caracterizat prin 3 aceea că pielea crudă de vițel se supune gonflării prin tratament cu acid acetic 0,5M, timp de 5...7 zile, se depilează mecanic, se îndepărtează epiderma și grăsimea, reținându-se doar 5 derma, care se supune unui tratament cu NaOH 10% la pH alcalin și sulfat de sodiu 1M, timp de 24 h, la temperaturi de 15...25°C, apoi unui tratament cu acid clorhidric 1N, la temperaturi 7 de 22°C, timp de 24 h, când se formează un gel consistent, care se filtrează, se omogenizează și se maturează 24 h la 4°C, gelul de colagen astfel obținut, având o concentrație 9 de 1,2...2%, se reticulează cu glutaraldehidă 0,1 ...1 %, obținându-se un colagen reticulat care se toarnă în 2 cilindri concentrici de polietilenă, deschiși la ambele capete, se îngheață la 11 - 40°C, pentru a forma un hidrogel poros care se imersează într-o soluție de tampon, în raport de 80:20 de fosfat:alcool etilic, și se usucă la 26°C, obținându-se conductori poroși 13 transparenți.
2. 2. Conductori pentru ghidare nervoasă, direct obținuți prin procedeul definit în 15 revendicarea 1.