RO128003A0 - Conductori nervoşi din colagen şi procedeu de obţinere a acestora - Google Patents

Abstract

Invenţia se referă la conductori nervoşi din colagen reticulat, şi la un procedeu pentru obţinerea acestora. Conductorii nervoşi, conform invenţiei, sunt constituiţi din gel de colagen cu o concentraţie de 1,2...2% reticulat cu 0,1...1% glutaraldehidă. Procedeul conform invenţiei constă în prepararea în prealabil a colagenului fibrilar tip I, sub formă de gel, din piele crudă de viţel, reticularea acestuia cu 0,1...1% glutaraldehidă, turnarea gelului de colagen reticulat între doi cilindrii concentrici din polietilenă, la 4°C, şi apoi îngheţarea acestuia la -40°C, timp de 24 h, rezultând un hidrogel sub formă tubulară, care se imersează într-o soluţie tampon fosfat:alcool etilic timp de 24 h, după care hidrogelurile de colagen sub formă tubulară se usucă la etuvă, la 26°C, astfel formându-se conductori nervoşi din colagen transparenţi, cu un diametru intern de 0,5...2,5 mm şi o lungime de 1...10 cm.

Description

CONDUCTORI NERVOȘI DIN COLAGEN ȘI PROCEDEU DE OBȚINERE A ACESTORA

Domeniul tehnic în care poate fi folosită invenția:

Invenția se referă la conductori nervoși biocompatibili din colagen fibrilar tip I reticulat pentru repararea nervilor periferici și la un procedeu de obținere a acestora.

Descrierea stadiului actual:

Leziunile sistemului nervos afectează peste 90.000 de oameni în fiecare an. Defectele nervoase periferice sunt foarte frecvente în practica clinică și adesea duc la invaliditate permanentă. Odată lezat, țesutul nervos este greu de regenerat în special atunci când un defect nervos este fragmentat pe o suprafața întinsa.

Pentru a mări perspectiva regenerării axonilor și recuperarea funcțională au fost utilizate numeroase proceduri de grefare, inclusiv implantarea de autogrefe, alogrefe și xenogrefe. In prezent, tehnica clinică pentru reconstrucția nervilor periferici lezați este utilizarea de grefe nervoase autologe. Totuși, această metodă are și o serie de dezavantaje, incluzând intervențiile chirurgicale extinse, pierderea funcției de donator a nervilor, oferta limitată de nervi a donatorilor etc. Astfel, au fost investigate și alte metode chirurgicale, inclusiv alogrefa, organele sau țesuturile autologe sau autogene, vasele de sânge și mușchii scheletici. Cu toate acestea, ca urmare a respingerii imunologice, au fost realizate numai câteva succese.

Datorită dezvoltării ingineriei tisulare există posibilitatea din ce în ce mai mare de utilizare de conductorilor biodegradabili pentru reconstrucția defectelor nervoase.

Conductorii nervoși sunt structuri tubulare utilizate la acoperirea defectelor nervoase mari, acționând astfel ca ghid pentru regenerarea axonilor și ca barieră împotriva țesutului cu escare.

Există numeroase tehnici de fabricare a polimerilor pentru obținerea conductorilor nervoși. Polimerii naturali utilizați pentru fabricarea conductorilor nervoși includ chitosanul, colagenul, gelatina, acidul hialuronic (HA) și fibre de mătase. Aceși polimeri oferă biocompatibilitate excelentă, reprezintă un suport ideal pentru atașarea și funcționalizarea celulelor, scad frecvența răspunsului imun, furnizează semnale corespunzătoare celulelor fără a necesita factori de creștere și pot fi degradate de enzime naturale. Totuși, polimerii naturali prezintă variații și necesită purificare și caracterizare de la lot la lot. Mai mult, cele mai multe υ- 2 0 1 1 - 0 1 3 3 6-0 7 -12- 2011

Vi nu au rezistență mecanică bună și se degradează in vivo relativ repede. Adesea polimerii naturali necesită modificări chimice și reticulări sau combinații cu alte componente structurale cum ar fi polimerii sintetici cu proprietăți mecanice bune. Datorită temperaturii lor de denaturare scăzute și stabilității termice, polimerii naturali sunt în general fabricați la temperatura camerei prin injectare, imersare și electrofilare din soluții de polimeri.

Datorită biocompatibilității și biodegradabilității excelente, structurii bine definite, caracteristicilor biologice și modului în care interacționează cu organismul, colagenul reprezintă unul dintre cele mai utilizate biomateriale. Extras sub formă de soluție apoasă sau gel, colagenul fibrilar tip I poate fi modelat în diferite forme: dispozitive medicale, implanturi artificiale, tuburi, suporturi pentru cedarea medicamentelor și schelete (scaffold) pentru regenerare tisulară, cu rol important în prezent în medicină.

Polimer natural, colagenul este constituit din 20 de aminoacizi, aranjați în secvențe caracteristice, ce formează o structură conformațională unică de triplu helix. Colagenul tip I este cel mai abundent, reprezentând cca 80% din totalul țesuturilor conjunctive. Acesta este tipul pe baza căruia s-au obținut cele mai multe informații legate de structura proteinelor colagenice. Datorită proprietăților hidrofile date de structura moleculară, caracterizată prin conținutul mare de aminoacizi diaminici și dicarboxilici, conferă o interfață adecvată pentru adeziunea și migrarea celulară.

In general, un conductor nervos ideal trebuie să fie ne-citotoxic, foarte permeabil, suficient de flexibil, cu o viteză de degradare corespunzătoare ca să poată furniza regenerarea axonilor și să prezinte răspunsuri inflamatorii minime.

Pe plan mondial realizarea conductorilor nervoși este un subiect foarte cercetat. In continuare sunt prezentate invenții referitioare la realizarea conductorilor nervoși care au la baza colagenul, ca polimer natural.

Brevetul KR nr. 0018214 se refera la tuburi de colagen cu un perete format dintr-o succesiune de filme de colagen cilindrice, continue, coaxiale. Aceste tuburi pot fi utilizate in chirurgie, in special pentru regenerarea nervoasa. Brevetul RO nr. 123177 descrie compoziția unui material biocompatibil si procesarea lui. Compoziția revendicata este un amestec de poliuretan si colagen; poliuretan, colagen si elastina; poliuretan, colagen, elastina si acid hialuronic; colagen, elatina si condroitin sulfat cu o buna capacitate de extrudere si o buna biocompatibilitate pentru dispozitive medicale (tuburi pentru pompe peristaltice). Acest brevet revendica introducerea polimerilor solizi intr-o soluție de poliuretan in dimetil formaldehida la 60-70°C cu îndepărtarea solventului. Brevetul US nr. 170664 prezintă un tub de colagen tip I de origine porcina si tip IV in raport de 1:1 format din membrana de colagen ₍2 Ο 1 1 - Ο 1 3 5 ΰ - - '/

Ο 7 -12- 2011 ^L<*

BioBrane. Tuburile realizate in acest brevet au diametru 0.5 - 5 mm si 10-100 mm lungime. Invenția EP nr. 0906764 descrie formarea unui tub de colagen prin înghețarea unei suspensii urmata de liofilizare sau uscare cu solvent intr-o succesiune de alcool izopropilic anhidru. Suspensia este turnata intr-un tub cu ambele capete deschise, iar partea centrala va fi îndepărtata. Suspensia de colagen este preparata din colagen liofilizat si ajustata la 1% si pH=3, iar tuburile sunt solubile in apa. Brevetul US nr. 5292802 prezintă tuburi din colagen conjugat la polietilen glicol obținute prin extrudere sau turnare urmata de deshidratare. Brevetul US nr. 4863668 descrie o metoda de formare a nervilor periferici dintr-un material fibrina-colagen reticulate cu o soluție stock 25% glutaraldehida si 37.5% formaldehida. Materialul este multistratificat conținând straturi alternate de fibrina si colagen. Brevetul US nr. 4814120 se refera la procesul de obținere a nervilor periferici prin extruderea unui gel acid de colagen de concentrație 1.5% urmata de coagularea pereților interni si externi intr-o baie de coagulare de 70% acetona si 30% amoniac urmata de uscare si in final reticulare. Brevetul WO nr. 004971 descrie un conductor nervos format dintr-un material polimeric care este acoperit pe suprafața interioara cu colagen si factori de creștere si este echipat cu un dispozitiv de stimulare electrica. Invenția CN nr. 101138656 relateaza realizarea unui nerv de colagen cu chitosan in forma acid in volume corespunzătoare. Brevetul US nr. 2019087 se refera la realizarea nervilor periferici multistrat utilizând laminina si colagen tip I. Deși au fost dezvoltați multi conductori nervoși pe bază de colagen pentru a fi utilizați in repararea nervilor periferici, aceștia au fost extrudati intr-o baie de solvent sau uscati liber prin evaporarea solventului, ceea ce poate implica citotoxicitate, pentru prepararea lor au fost utlizate combinații de polimeri sintetici, majoritatea sunt degradabili in apa, au compoziții cu pH acid. Avantajul invenției noastre este că conductorii nervoși din colagen sunt naturali, fiind realizați doar din colagen reticulat, se degradează in timp, au o porozitate bine determinata, iar metoda de obținere combina mai multe tehnici, ca turnarea, înghețarea, imersarea in soluție si uscarea la o anumita temperatura, ceea ce conferă conductorului realizat stabilitate fizico-chimica si mecanica si mențin suplețea colagenului fibros.

Problema tehnică

Problema tehnică pe care o rezolvă invenția constă în combinarea metodelor de reticulare și condiționare a colagenului astfel încât să rezulte conductori nervoși în formă tubulară de diferite dimensiuni și grosimi care să fie resorbabili și să regenereze țesutul într-o perioadă de timp stablită.

Λ2 01 1-01336-0 7 -12- 2011

Soluția tehnică

Conductorii nervoși conform invenției înlătură dezavantajele menționate prin aceea că sunt constituite din un polimer natural, colagen fibrilar tip I, obținut din derma pielii de vițel, sub formă de gel, cu structură nativă triplu helicoidală, după un procedeu special. Pentru prepararea gelului de colagen s-a utilizat piele crudă de vițel. Pielea a fost depilată mecanic, îndepărtându-se părul, apoi s-a îndepărtat epiderma și grăsimea după cum urmeaza: pentru a obține dermă pretratată, pielea crudă de vițel a fost supusă în prealabil tratamentului acid cu acid acetic 0,2 ... IM timp de 2 ... 10 zile (în funcție de vârsta animalului). în urma acestui tratament pielea a suferit un proces de umflare și cele trei straturi ale sale: epiderma, derma și hipoderma s-au delimitat foarte clar. S-a reținut doar derma, care s-a spălat cu apă din abundență până când flota de spălare a ajuns la un pH de 5 ... 8. Derma pretratată s-a supus apoi unui tratament alcalin (pH =10) constituită din NaOH 8...14% și sulfat de sodiu 1...3M timp de 24 ore, la temperaturi cuprinse între 15 și 25°C. Pentru îndepărtarea urmelor de grăsime și a proteinelor digerate de tratamentul bazic pielea a fost spălată timp de 2 zile până când flota a ajuns la pH-ul 6-7. Aceste operații de spălare-neutralizare sunt necesare în vederea dizolvării acide, deoarece o trecere bruscă a colagenului din mediul bazic în mediul acid ar fi împiedicat dizolvarea datorită precipitării sărurilor pe fibrele de colagen, îndepărtarea alcaliilor s-a verificat prin tratarea flotei cu o soluție de clorură de bariu 1... 5%. Acestea se tratează mai departe cu o soluție de acid clorhidric IN la temperatura de 22°C. După 24 h se formează un gel consistent, care se trece printr-o sită pentru reținerea eventualelor porțiuni negelifiate. Gelul de colagen obținut s-a omogenizat cu un agitator cu paletă, s-a lăsat la maturare timp de 24 h la 4°C. Gelul de colagen cu o concentrație de 1 ... 3% colagen (substanță uscată) a fost reticulat cu o soluție 0.1 ... 1% glutaraldehida in apa distilata. Procedeul de obținere a conductorilor nervoși constă în aceea că, în prealabil, gelul de colagen reticulat este turnat la o temperatura de 4°C intre 2 tuburi concentrice (de dimensiuni diferite) din polietilena cu ambele capete deschise. După turnare acestea se ingheata la 0 ... -40°C timp de 2 ... 24 ore. După dezghețare se formează un hidrogel sub forma tubulara. Acesta este imersat intr-o soluție tampon fosfat pentru îndepărtarea glutaraldehidei nereactionate si alcool etilic pentru o reticulare si sterilizare suplimentara timp de 1 ... 24 ore. După imersare hidrogelurile de colagen sub forma tubulara sunt uscate intr-o etuva la 24 ... 36°C. Se formează conductori nervoși de colagen transparent!, cu o dimensiune a diametrului intern de 0.5 ... 2.5 mm si 1 ... 10 cm lungime (Figura 1), cu structura poroasa, cu pori de 5-20 pm (Figura 2 a - secțiune si Figura 2b - suprafața), si biocompatibili cu celulele astrocite si neuroni.

'-2 C 1 1-01336-0 7 -12- 2011

Scurtă descriere a desenelor

Fig. 1. prezintă conductorii nervoși obținuți la diferite dimensiuni

Fig. 2. prezintă imagini de microscopie electronică a conductorului nervos

Avantajele invenției în raport cu stadiul tehnicii

Aplicarea invenției conduce la următoarele avantaje:

- reducerea efectului toxic al polimerilor sintetici prin utilizarea unui polimer natural, colagen recunoscut de organism ca un constituent al sau si nu ca un material străin;

- obținerea unor conductori nervoși printr-o combinație de procedee simple si intr-un timp scurt (3 zile) care atrage costuri mult sub cele aflate pe piața in acest moment;

- regenerarea regiunilor nervoase prin aplicarea conductorilor nervoși in chirurgia plastica si reparatorie scad numărul cazurilor de invaliditate intr-un timp scurt si redau capacitatea socioprofesionala a pacientilor;

Descrierea detaliată a invenției:

Colagen fibrilar tip I sub forma de gel s-a preparat din piele crudă de vițel (varsta 1 an) după cum urmeaza: pielea crudă de vițel a fost supusă în prealabil tratamentului acid cu acid acetic 0.5 M timp de 5-7 zile (în funcție de vârsta animalului). După gonflare pielea a fost depilată mecanic, îndepărtându-se părul, apoi s-a îndepărtat epiderma și grăsimea. Derma reținuta a spălata cu apă din abundență până când flota de spălare a ajuns la un pH de 7. Derma pretratată s-a supus apoi unui tratament alcalin (pH = 10) constituită din NaOH 10% și sulfat de sodiu 1 M timp de 24 ore, la temperaturi cuprinse între 15 și 25°C. Pentru îndepărtarea urmelor de grăsime și a proteinelor digerate de tratamentul bazic pielea a fost spălată timp de 2 zile până când flota a ajuns la pH-ul 6-7. Acestea se tratează mai departe cu o soluție de acid clorhidric IN la temperatura de 22°C. După 24 h se formează un gel consistent, care se trece printr-o sită pentru reținerea eventualelor porțiuni negelifiate. Gelul de colagen obținut s-a omogenizat cu un agitator cu paletă, s-a lăsat la maturare timp de 24 h la 4°C.

Invenția va fi explicată mai în detaliu prin următoarele exemple:

Exemplul 1

In această invenție a fost utilizat gelul de colagen fibrilar tip I obtinut ca in descrierea de mai sus, avand o concentrație gravimetrică de 1.2%, 98.55% apă distilata și pH-ul 2.5. pH-ul gelului de colagen a fost ajustat la 7,4 cu IM hidroxid de sodium și apoi a fost reticulat cu 0.25% glutaraldehidă. Gelul reticulat a fost turnat la o temperatura de 4°C intre 2 tuburi ^-2 Ο 1 1 - Ο 1 3 5 ο - 0 1 -12- 2011 '' concentrice (de dimensiuni intre 0.5 si 2.5 mm) din polietilena cu ambele capete deschise. După turnare acestea se ingheata la -40°C timp de 24 ore. După dezghețare se formează un hidrogel sub forma tubulara. Acesta este imersat intr-o soluție tampon fosfatalcool etilic (50:50) timp de 24 ore. După imersare hidrogelurile de colagen sub forma tubulara sunt uscate intr-o etuva la 26°C. Se formează conductori nervoși de colagen transparenti, cu o dimensiune a diametrului intern de 0.5 ... 2.5 mm si 1 ... 10 cm lungime.

Exemplul 2

Gelul de colagen a fost obținută prin procesul descris în Examplul 1 exceptând procentul de colagen, care a fost 2% (substanță uscată). Procesul de turnare, înghețare, imersare si uscare au fost similare cu cele descrise in Exemplul 1. S-au obtinut conductori nervoși cu o dimensiune a diametrului intern de 0.5 ... 2.5 mm si 1 ... 10 cm lungime.

Exemplul 3

Gelul de colagen a fost obtinut ca in procedeul descris în Exemplul 2, cu excepția că glutaraldehida a fost in procent de 0.5%. Procesul de turnare, înghețare, imersare și uscare au fost similare cu cele descrise in Exemplul 2. S-au obtinut conductori nervoși cu o dimensiune a diametrului intern de 0.5 ... 2.5 mm si 1 ... 10 cm lungime.

Exemplul 4

Gelul de colagen a fost obtinut ca in procedeul descris în Exemplul 3, cu excepția că colagenul a fost in procent de 2.5% (substanța uscata). Procesul de turnare, înghețare, imersare și uscare au fost similare cu cele descrise in Exemplul 3. S-au obtinut conductori nervoși cu o dimensiune a diametrului intern de 0.5 ... 2.5 mm si 1 ... 10 cm lungime.

Exemplul 5

Gelul de colagen a fost obtinut ca in procedeul descris în Exemplul 4, cu excepția că procentul de glutaraldehida a fost de 1%. Procesul de turnare, înghețare, imersare si uscare au fost similare cu cele descrise in Exemplul 4. S-au obtinut conductori nervoși cu o dimensiune a diametrului intern de 0.5 ... 2.5 mm si 1 ... 10 cm lungime.

Exemplul 6

Gelul de colagen obtinut si reticulat, procesul de turnare, înghețare si uscare au fost aceleași cu cele descrise in Exemplul 5, cu soluției de imersare care a fost soluție tampon fosfat : alcool etilic (100:0). S-au obtinut conductori nervoși cu o dimensiune a diametrului intern de 0.5 ... 2.5 mm si 1 ... 10 cm lungime.

Exemplul 7

V- 2 Ο 1 1 - Ο 1 3 3 6 - - .2// ο 7 -12- 2011

Gelul de colagen obtinut si reticulat, procesul de turnare, înghețare si uscare au fost aceleași cu cele descrise in Exemplul 6, cu soluției de imersare care a fost soluție tampon fosfat : alcool etilic (0:100). S-au obtinut conductori nervoși cu o dimensiune a diametrului intern de 0.5 ... 2.5 mm si 1 ... 10 cm lungime.

Exemplul 8

Gelul de colagen obtinut si reticulat, procesul de turnare, înghețare si uscare au fost aceleași cu cele descrise in Exemplul 7, cu soluției de imersare care a fost soluție tampon fosfat : alcool etilic (80:20). S-au obtinut conductori nervoși cu o dimensiune a diametrului intern de 0.5 ... 2.5 mm si 1 ... 10 cm lungime.

Conductorii nervosa obținuți în această invenție reprezintă biomateriale pentru ingineria tisulara de regererare nervoasa si sunt utilizați in chirurgie plastica si reparatorie.

Claims (3)

1. Conductori nervoși caracterizați prin aceea ca au fost obținuți din gel de colagen preparat din piele cruda de vitei supusă în prealabil tratamentului acid cu acid acetic 0.5 M timp de 5-7 zile (în funcție de vârsta animalului). După gonflare pielea a fost depilată mecanic, îndepărtându-se părul, apoi s-a îndepărtat epiderma și grăsimea. Derma pretratată s-a supus apoi unui tratament alcalin (pH = 10) constituită dinNaOH 10% și sulfat de sodiu 1 M timp de 24 ore, la temperaturi cuprinse între 15 și 25°C urmat de unul acid cu o soluție de acid clorhidric IN la temperatura de 22°C. După 24 h se formează un gel consistent, care se filtrează, omogenizează si se matureaza la 24 h si 4°C.

2. Conductori nervoși caracterizați prin aceea ca sunt constituiti dintr-o compoziție de gel de colagen conform revendicării 1, cu o concentrație de 1.2 ... 2% si reticulat cu 0.1 ... 1 % glutaraldehida.

3. Procedeul de obținerea a conductorilor nervoși care au compoziția definita ca in revendicarea 2, caracterizat prin aceea ca, in prealabil, gelul de colagen reticulat este turnat intre 2 cilindrii concentrici din polietilena deschiși la ambele capete, înghețat la -40°C pentru a se forma un hidrolgel poros, care apoi este imersat intr-o soluție tampon fosfatalcool eticlic (80:20). După imersare hidrogelul este uscat la 26°C si se obțin conductori porosi transparent! din colagen de diferite dimensiuni.