JP5226914B2 - 粒状無細胞組織マトリックス - Google Patents

Description

（発明の背景）
ヒト由来、動物由来および合成の材料は現在医療手法において組織の増強または組織損傷の修復または修正に使用されている。最適であるためには、これらの物質は移動してはならず、正常組織の再生を促進し、宿主細胞と共に再配置され、血管新生を促進し、その材料の分解または吸収を生じさせる炎症性応答を引き起こさずに患者自身の組織と統合されなければならない。更に、そのような材料をデリバリーする方法、例えば、外科的方法または注射は、この材料の臨床応用、医者による使用の容易性およびその方法の費用に重要な影響を与えることがある。

注射可能なコラーゲンおよび他の材料は様々な広い病理学的及び美容的応用のために再建外科、皮膚化学、腫瘍学、耳咽喉科学および泌尿器科学の分野において臨床的に使用されてきた。現在、注入可能コラーゲンの最も広く使用されている形態は架橋ウシタイプＩコラーゲンに由来するものである。ヒト臨床応用において、この異種移植片の効果はヒト宿主による吸収である。この異種移植片を受けた患者は動物コラーゲンに対する免疫応答を受けやすく、存在する抗体についての予備スクリーニングを必要とする。そのような材料の例は、米国特許第4,582,640号；第5,104,957号；第5,728,752号および第5,739,176号に見ることができる。

注射し得るヒトコラーゲンが現在入手可能でありAutologen^RおよびDermologen^Rの商標名で売られており、Collagenesisにより製造されている。この材料は典型的には選択的外科手術の際に得られる自家コラーゲンまたは屍体より得られる同種コラーゲンに由来する。出発材料は機械的手段により解離され化学的に処理されてすべての非コラーゲンタンパク質が除去される。コラーゲンは更に化学試薬で処理されて損傷したおよび露出したコラーゲン線維の有害な作用がマスクまたはそれらが架橋される。この技術に関するより詳細な情報は米国特許第4,969,912号および5,332,802号に見られる。

LifeCell社によって製造されているAlloDerm^Rは、結合組織マトリックスの正常な生化学および分子構造を有意に変えることなく表皮および皮膚内の細胞を除去すべく確立された処理技術を用いて、正常ヒト皮膚から製造される無細胞組織マトリックスである。得られた産物は凍結乾燥形態にあり、貯蔵寿命を伸ばすことができ、正常な組織マトリクス成分の分解又は損失無く出荷を容易にすることができる。AlloDerm^Rは、損傷した又は不十分な組織の修復または置き換えに臨床的に使用されている。AlloDerm^Rの報告されている用途には以下が含まれる：全層性熱傷、歯周疾患のために失われた歯茎の置換、失われた組織の置換又は傷による皮膚損傷の正常表面形状の復元を含む再建外科用途、または損失した硬膜を置換するための加齢神経外科用途および、膀胱スリング(sling)のような泌尿器科用途および直腸床再建。

AlloDerm^Rは、移植部位において融和し、正常な宿主細胞環境で迅速に再配置(repopulate)することが報告されている。AlloDerm^Rの報告されている利益は、それらがマトリックスの構造および生化学を維持しており、正常組織の再生を促進することである。研究により、正常軟組織に存在するAlloDerm^Rはデコリン(decorin)、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、ニドゲン（nidogen）、増殖因子および他の生化学的タンパク質を保持することが示された。さらに、AlloDerm^Rは血管の基底膜、エラスチンの配向および出発皮膚組織のコラーゲン線維を含むことが報告されている。この理由により、AlloDerm^Rマトリックスの構造および生化学は組織再生を促進すると考えられている。シートAlloDerm^Rを注射に適するように粒状化することはAlloDerm^Rの有利な特性をいくつかの新規な応用に拡大するであろう。

入手可能な注射可能なコラーゲン材料を製造するために現在使用されている方法には、出発材料を湿潤水和状態で機械的に破壊することが含まれる。しかしながら、そのような処理が無傷の自家移植、同種移植または異種移植組織に大して行われると、マトリックスに対する損傷が起こり、続く移植は、異物性応答および組織マトリクスの迅速な吸収を引き起こす。更に、そのような方法で処理された材料の顕微鏡観察および組織学的観察により、コラーゲン線維の機械的破壊が示される。非低温性温度における乾燥させたヒトおよび動物組織の機械的破戒は、コラーゲン線維の類似の破壊を生じさせると考えられており、これは受容者の異物性応答および材料の吸収作用を生じさせる。
従って、無細胞組織からの無傷の粒状無細胞組織マトリックスを製造する方法に対する未解決の需要が存在している。

発明の概要
本発明は一般に無細胞組織マトリックスを処理して粒状無細胞組織マトリックスを生じさせる方法に関する。本発明の方法の一般的な態様は以下の工程を含む：極低温において乾燥無細胞組織マトリックスストリップを極低温破壊すること；および得られた粒子を極低温にてサイズによって分別すること。好ましい実施態様において、本発明の方法は以下を含む：乾燥無細胞組織マトリックスシートを極低温にてストリップに切断すること；極低温にて前記乾燥無細胞組織マトリックスストリップを極低温破壊すること；得られた粒子を極低温にてサイズによって分別すること；および所望のサイズの粒子の画分を凍結乾燥し。吸収されていたかもしれない一切の湿分を除去して乾燥粒状無細胞組織マトリックスを生じさせること。乾燥粒状無細胞組織マトリックスの再水和は使用直前に行ってよい。

一般に、極低温破壊は０℃以下で行うことが好ましく、好ましくは温度は約-50℃より下、より好ましくは約-100℃より下であるべきである。このような温度を達成するため商業的に入手可能な冷却剤を使用することができ、それらにはハロカーボン冷却剤、液体二酸化炭素、液体窒素、液体アルゴン、液体ヘリウムおよび他のよく知られた化学的に非反応性で、従って、不活性かつ非毒性のそのような冷却薬剤が含まれる。得られる粒子の分別も、所望の粒子範囲に大きさを整えた一連の金属メッシュスクリーンを用いて低温にて行われなければならない。好ましい実施態様の一つにおいて、このスクリーンは約１μm〜約900μmのサイズの粒子を単離するように選ばれ、好ましくはスクリーンは約30μm〜約800μmのサイズの粒子を単離するように選ばれる。本発明は上述した処理の産物も包含する。
本発明のこれらの特徴および他の特徴は本発明の例示的実施態様の記載中でより完全に述べられる。その記載は図を参照して示される。

例示的実施態様の記載
無細胞組織マトリックス組織は多段階処理の結果であり、組織がドナーから集められ天然の組織マトリックスを単離するために処理される。好ましい態様では、この処理は、受ける損傷を低減するために安定化溶液で処理すること、細胞および他の抗原性組織成分を除去するための処理溶液で処理すること、凍結防止剤で処理すること、有意な損傷を与える氷結晶形成を回避するために特定の条件下で凍結および保存すること、損傷性の氷再結晶化を防止する条件下で乾燥させること、凍結温度より上で乾燥状態で保存すること、表面張力損傷を最小化しマトリックスの選択的貯蔵を強化するための再水和溶液で特定の条件下で再水和させること、および宿主によって拒絶されないであろう生細胞で再構成することを含む、生物組織を処理する工程を含む。
無細胞皮膚組織マトリックスまたは他の組織マトリックスを製造するための上記で要約した処理は、米国特許第5,336,616号により完全に記載されている。この全内容は引用により本明細書に含まれるものとする。

しかしながら、当業者であれば、他の無細胞組織マトリックス組織が本発明に使用できることを認めるであろう。例えば、異種抗体起源の無細胞組織マトリックス組織は上記で開示したヒト由来組織に加えて使用してよく、血管、心弁、筋膜および神経結合組織は本発明の範囲内で粒状無細胞マトリックスを生成するために使用してよい。従って、本発明の一つの好ましい実施態様において、本明細書に開示された方法は、AlloDerm^Rとも称される無細胞組織マトリックス組織を使用し、これはThe Woodlands,Texas のLifeCell社から商業的に入手可能である。
本発明の方法は化学試薬を使用せず最少の破壊的技術を使用し、これは従来開示されていた湿潤または乾燥処理から生じる剪断線維末端を含むコラーゲン線維に対する破壊を最少化するものである。得られる粒状無細胞組織マトリックスは適切なキャリアー剤に懸濁することができ、それにより皮下注射または噴霧、層状化(layering)、パッキング、ケース内封入またはこれらの方法の組合せを含む適用形態によるデリバリーに適したように作製される。当業者であれば、粒状無細胞マトリックスはシートに再構成することができ、またはゼラチン状形態若しくは他の利用形態に再構成することができることを認めるであろう。

一般に、本発明の方法は以下の工程を含む：乾燥無細胞組織マトリックスストリップを低温にて極低温破壊すること；および、得られる粒子を極低温でそのサイズによって分別すること。好ましい実施態様においては、本発明の方法は以下を含む：乾燥無細胞組織マトリックスストリップを極低温にて極低温破壊すること；得られる粒子を極低温でそのサイズによって分別すること；および所望のサイズの粒子の画分を乾燥させて吸収していたかもしれない一切の湿分を除去して乾燥無細胞組織マトリックスを生じさせること。より好ましい実施態様において、本発明の方法は以下を含む：乾燥無細胞組織マトリックスのシートをストリップに切断すること；その乾燥無細胞組織マトリックスストリップを極低温にて極低温破壊すること；得られる粒子を極低温でそのサイズによって分別すること；および所望のサイズの粒子の画分を乾燥させて吸収していたかもしれない一切の湿分を除去して乾燥無細胞組織マトリックスを生じさせること；および、その乾燥粒状無細胞組織マトリックスを再水和させること。

好ましくは、乾燥無細胞組織マトリックスは、この材料の極低温破壊、粉砕又は製粉が可能な温度に極低温冷却される。本発明のひとつの実施態様において、液体温度まで冷却された滅菌ホモゲナイザーが使用される。得られる極低温破壊された材料は次に所望の範囲の粒状無細胞組織マトリックス材料を単離するために一連の粒子サイズ排除スクリーンを通される。一旦単離されると、粒状無細胞材料は、上記処理の間に吸収していたかもしれない一切の湿分を除去するために凍結乾燥してよい。
一般に、この粒状組織マトリックスは無傷の組織を粒状形態にするときに受ける機械的な損傷の量を最少にするような方法で製造される。図１に示すように、本発明によるこのコラーゲン線維の低温破壊はコラーゲン線維の「綺麗な」破壊を生じさせる。これは、従来技術における慣行であるコラーゲン組織の室温断片化から生じる、すり切れた末端および実質的に損傷したコラーゲン線維と対照的である。コラーゲン線維束の機械的断片化によって生じた損傷、特にコラーゲン線維の末端は図２に例示した。上記の図解は処理した材料の顕微鏡観察に基づいており、コラーゲンベース組織に存在するコラーゲン線維束の末端を表している。

本発明の方法の開発において、得られる粒状無細胞マトリックスの新規で予想外の特性にいくつかの因子が重要であることが分かった。そのような因子のひとつは、AlloDerm^Rのような乾燥無細胞マトリックスのホモゲナイゼーションまたは低温破戒時の温度である。本明細書において、ホモゲナイゼーションおよび極低温破壊の語は互換的に使用され、シート様出発材料から粒状材料を作り出す操作を意味する。極低温破壊を行う温度は、コラーゲン線維が極低温破壊され断片化または裂かれないように室温より充分に低くなければならないことが分かっている。一般には、この温度は０℃以下であるべきであり、好ましくは温度は約-50℃以下であるべきであり、より好ましくは約-100℃以下であるべきである。そのような温度を達成するために商業的に入手可能な冷却剤を使用することができ、そのような冷却剤にはハロカーボン冷却剤、液体二酸化炭素、液体窒素、液体アルゴン、液体ヘリウムおよび、よく知られた化学的に反応性の無い，従って不活性かつ非毒性の他の類似の冷却剤が含まれる。

本発明を行う際に重要であることが分かった他の因子は粒状無細胞組織マトリックス材料のサイズである。所望の範囲の粒子を選抜するために、極低温冷却ホモゲナイザー塔を使用する。極低温冷却ホモゲナイザー塔の役割は所望のサイズの粒子から小さすぎる又は大きすぎる粒子を分別することである。ひとつの実施態様において、液体窒素は大きすぎる粒子を排除するために第１の金属スクリーンと組み合わせて使用される。第2の金属スクリーンは、適切な最小サイズの粒子を捕獲し、小さすぎる粒子が除去されるように液体窒素と共に使用される。一つの好ましい実施態様において、第１のスクリーンは約0.0762cm（0.03インチ）の金属スクリーンであり、第２のスクリーンは約0.00381cm（0.0015インチ）金属スクリーンである。別の実施態様において、スクリーンは約１μm〜約900μmのサイズを有する粒子を単離するように選ばれ、好ましくは、スクリーンは約30μm〜約800μmのサイズを有する粒子を単離するように選ばれる。

得られる粒状無細胞組織マトリックスは粒子をどのような適切な水性溶液、好ましくは通常の生理食塩水および局所麻酔剤に懸濁することによっても再水和させてよい。所望であれば、再水和粒状無細胞組織マトリックスは粒子を遠心によってペレット化し、上清をデカンテーションすることによって単離してよい。次に粒状無細胞組織マトリックスは適切な生理的に共存できる担体、例えば通常の生理食塩水および局所麻酔剤のような担体中に適切な濃度で懸濁してよく、あるいは所望であれば、医薬担体に懸濁してよい。生理学的担体または再水和生理食塩水溶液のいずれも抗生物質または他の薬剤、細胞または細胞抽出物、抗炎症剤、プロテオグリカン、鎮痛剤、止血剤、上皮成長因子、線維芽細胞成長因子、神経成長因子、ケラチン細胞成長因子、血小板由来成長因子、血管作動性小腸ペプチド、幹細胞因子、骨形成タンパク質、軟骨細胞成長因子、および他の類似のそのような成分および注射部位に望まれる他の成分を含んでよい。

一旦再水和すると、この粒状無細胞組織マトリックスは、宿主への移植に先立ち又は移植の際に幹細胞または前駆細胞と合わされる。これらの幹細胞は移植部位に本来的なものであってよいが、その性質ゆえにそうである必要はない。当業者であれば、分裂に際して幹細胞は複製し、また更に１以上の特化した細胞に分化する細胞を生じさせることを理解し、それが正しいことを認めるであろう。そのような幹細胞には、間充組織幹細胞、上皮幹細胞、軟骨組織幹細胞、造血幹細胞および他の類似の細胞が含まれる。

本発明の一つの例示的実施態様において、無細胞組織マトリックスを処理して注射可能なサイズ粒子を生成する方法は以下を含む：乾燥無細胞組織マトリックスルを改変した切断装置またはメッシュ装置を用いてストリップに切断すること；極低温にて前記乾燥無細胞組織マトリックスストリップをホモゲナイズすること；得られる粒子を極低温でサイズによって分別すること；および、所望の粒子画分を凍結乾燥させ、ホモゲナイズの際に吸収していたかもしれない一切の湿分を除去すること。
本発明の他の例示的実施態様は、ヒトドナーから由来する無細胞組織例えばAlloDerm^Rを処理して注射可能なサイズの粒子を作製することを含み；乾燥無細胞組織マトリックスのシートを改変切断装置またはメッシュ装置を用いてストリップに切断し；ホモゲナイズ装置を液体窒素温度に平衡化すること；液体窒素に前記乾燥無細胞組織マトリックスストリップを加えること；得られる粒子を液体窒素温度でサイズによって分別すること；および、所望の粒子画分を凍結乾燥してホモゲナイズの際に吸収していたかもしれない一切の湿分を除去すること。

本明細書に開示される粒状無細胞組織マトリックスの潜在的用途は以下のものと含み得る：ざ瘡の傷修復、疾病又は事故によって失われた皮膚の置換のような皮膚科学用途；失禁および膀胱尿管逆流の軽減のような泌尿器学用途；声帯位置調整を含む耳鼻咽喉科；癌手術または他の組織の除去を伴う外科的手段のために失われた組織を置換するための再建外科用途；組織の置換、再建または強化手順のような美容外科手順；胃腸灌流の矯正手順；および当業者の認める他の用途。例示的例として、米国特許第5,712,252号を参照せよ。この内容は引用により本明細書に取り込まれるものとする。
以下の実施例は、本発明の好ましい実施態様を示すために入れられたものである。当業者は以下の実施例に開示された技術が本発明者らによって発見された技術を代表し、本発明の実施において良好に機能することを認めるであろうし、従って、本実施例に開示された技術は本発明の実施のための好ましい態様であると理解することができるであろう。しかしながら、当業者は、本開示に照らして、開示された特定の態様において多数の変更が可能であり、本発明の範囲を逸脱することなく同様なまたは類似の結果を得ることを認めるであろう。

（実施例）
無細胞組織マトリックスの調製
以下の手順は、無細胞皮膚又は他の組織にマトリックスを製造するための方法の教示に従って行われ、これは米国特許番号5,336,616号に完全に開示され（この全内容は引用により本明細書に含まれるとする）、および共係属中の米国特許出願09/029,179、1988年8月22日出願（この内容は引用により本明細書に含まれるとする）の主題である。この材料はLifeCell社、The Woodlands Texasから商業的に入手可能である。
ドナーの皮膚はデルマトームにより無菌条件下で集められ、更なる処理に先立ちペニシリンおよびストレプトマイシン溶液を含むRPMI 1640組織培養培地中4℃にて７日間以内維持される。LifeCell組織処理センターへの輸送は一晩輸送であり、同じ培地中で氷中で行われる。処理センターに到着すると、組織容器の温度が少なくとも４℃であることを確認し、そうでなければその皮膚は破棄する。容器温度、ドナー同定とテストスクリーニングデータの確認に続いて皮膚を更なる処理のために層流フードに移す。

ドナー皮膚は輸送容器から取り出され、その網状側を下にして低密度ポリエチレンであるサイジング支持体片上に置く。皮膚の上皮側に適当なサイズのガーゼ片を置き、次にこれをできるだけ大きな、10.16ｘ10.16cm（4x4インチ）四方を越えず、5.08x7.62cm（2x3インチ）より小さくない四角形に切断する。次にこの皮膚を網状側を下にしてペトリ皿中に置き、50mlの1M NaClからなる脱表皮溶液(De-epidermizing Solution)を加える。次にペトリ皿をインキュベーターに移し、37±２℃にてヒト皮膚については18〜32時間、ブタ皮膚については33〜55時間インキュベーションする。

インキュベーション後、皮膚を入れたペトリ皿を脱上皮のために層流フードに入れる。最初にガーゼを取り除き廃棄する。次に上皮を監視でそっと掴み真皮からシートとして引きはがす。次に過剰の脱上皮溶液を吸引する。次に、上および下表面を明らかにするためにおよそ１cmの長さのスリットを真皮の左下隅に作製する。
次に、滅菌ハンクス平衡塩溶液からなる50mlの組織洗浄溶液（Tissue Wash Solution）を加えることによって同じペトリ皿中で真皮をリンスする。次にペトリ皿をローテーターに、40±5 RPMにて室温（20℃〜26℃）にて５分間置く。次にペトリ皿を層流フード内に戻し、蓋をそのペトリ皿から外して組織洗浄溶液を吸引する。この操作を更に２回繰り返す。

次に、真皮を50mlの脱細胞(De-cellularizing)溶液で処理し、ペトリ皿を室温（20℃〜26℃）、40±５ＲＰＭにてローテーター上に１時間置く。ヒト皮膚用の脱細胞溶液はハンクスの平衡塩溶液中0.5％のドデシル硫酸ナトリウムからなり、ブタ皮膚用は1mMエチレンジアミン四酢酸(EDTA)ニナトリウムからなる。脱細胞溶液を吸引によって除去する。次に真皮を50mlの組織洗浄溶液で洗浄する。次にペトリ皿を室温（20℃〜26℃）、40±５RPMにてローテーター上に５分間置く。組織洗浄溶液を吸引によって除去する。洗浄手順を２回繰り返す。真皮を合計３回洗浄後、50mlの前凍結溶液(Pre-freezing Solution)をペトリ皿に加えた。ヒト皮膚用の前凍結溶液はハンクスの平衡塩溶液中の７％デキストラン（70,000MWT）、６％シュークロース、６％ラフィノースおよび1mMエチレンジアミン四酢酸二ナトリウムからなっている。ブタ皮膚用の前凍結溶液は、ハンクスの平衡塩溶液中で作製された7.5％、デキストラン（70,000MWT）、６％シュークロース、7.5％ポリビニルピロリドン(MWT40,000)、1.25％ラフィノースおよび1mMエチレンジアミン四酢酸二ナトリウムからなる。

次に新しいガーゼ片を真皮の乳頭側(papillary side)上に置き、真皮を網状側が上になるようにひつくり返す。真皮片の網状側からの裏打ちをバイオハザードゴミ溶液へ廃棄する。次におよそ0.5〜1.0cmの広さの裏打ちおよび真皮のストリップをもとのサンプルから切り取る。このストリップを次に２つの付随片（それぞれおよそ1.0cmの長さ）に切断する。微生物分析および構造解析を含む全ての品質保証は最終的にこれらの付随サンプルについて行う。
組織を次に個々のTYVEKバッグに移す。組織をこのバッグ中に裏打ち側を上にし白色のベント側を下にして位置づける。次にこのTYVEKバッグをシールする。
シールした凍結乾燥バッグを、最低シェルフ温度が-70℃、最低冷却器温度が-85℃である凍結乾燥機に移す。次に組織をこの凍結乾燥機シェルフ上でシェルフ温度を-2.５℃／分の速度で-35℃まで傾斜させ、少なくとも10分間保持する。

乾燥サイクルは最終的に残存するサンプルの含水量が６％未満、最適には２％未満であるようなサイクルである。本実施例においては、凍結真皮は以下のプログラムにしたがって乾燥する：
１．シェルフ温度を真空設定2000mT（266Pa）で、-2.5℃／分で-35℃まで傾斜させ、１０分間維持する。
２．次にシェルフ温度を真空設定2000mT（266Pa）で1.5℃／分の速度で-23℃まで傾斜させる。
３．次に温度を1.5℃／分の速度にてシェルフ温度-15℃まで傾斜させ、真空設定2000mT（266Pa）で180分間維持する。
４．次に温度を1.5℃／分の速度にてシェルフ温度-5℃まで傾斜させ、真空設定2000mT（266Pa）で180分間維持する。
５．最終的に温度を1.5℃／分の速度にてシェルフ温度20℃まで傾斜させ、真空設定0mT（０Pa）で180分間維持する。

乾燥に続いて、乾燥真皮を含む凍結乾燥バッグを乾燥窒素ガス雰囲気下で取り外し、第2の予め乾燥させた不透水性の袋に入れて熱シールする。
処理手順の際、凍結乾燥のためのシールに先立ち、付随サンプルを主サンプルから切り取り、更に主サンプルと同一の条件下で処理する。移植の際、主サンプルの使用に先立ち、微生物分析および構造解析を含む全ての必要な品質保証をこの付随サンプルについて行う。
乾燥に続いて、サンプルを凍結温度よりも高い温度、最適には４℃にて光保護環境において保存する。

粒状無細胞組織マトリックスの調製
以下の手順はAlloDerm^R、裏打ち物質無しにパッケージングされた無細胞組織マトリックスを使用する。その調製は上述した。AlloDerm^RはLifeCellsha社、The Woodlands Texasから商業的にできる。パッケージから取り出した後、乾燥無細胞組織マトリックスを非-中断「連続」切断回転刃を取りつけたZimmerメッシャーを用いてストリップに切断する。得られる長い無細胞組織マトリックスのストリップを約１〜約２cmの長さに切断する。
OMNI International, Warrenton VAから入手可能なLabTeck Macroホモゲナイザーのようなホモゲナイザーと滅菌ホモゲナイザープローブを組立て、このホモゲナイザー塔に無菌液体窒素を注いで極低温に冷却する。ホモゲナイザーが極低温に達したならば、上述のようにストリップに調製しておいた無細胞組織マトリックスを無菌液体窒素を含むこのホモゲナイザー塔に入れる。次に、このホモゲナイザーの作動させ無細胞組織マトリックスのストリップを低温破壊する。極低温破壊工程の時間および継続期間は使用するホモゲナイザーの、モホゲナイズチャンバーの大きさ、ホモゲナイザーが操作される速度および時間に依存し、これらは所望の結果をえるためのパラメータの単純な変動によって当業者が決定することができる。

極低温破壊された粒状無細胞組織マトリックス材料を、ホモゲナイズ産物を液体窒素により予め冷却しておいた一連の金属スクリーンを通過させて液体窒素で洗浄することにより、粒子サイズによってソーティングする。われわれは上述した型のホモゲナイザーとスクリーンの組合せ（粒子が洗浄され、最初に大きすぎる粒子を排除し、次に望ましくない粒子を排除するためにソーティングする）が特に有用であることを見いだした。
単離されたならば、粒状無細胞組織マトリックスを取り出し、バイアルに入れ液体窒素を蒸発させた後に凍結乾燥する。この最後の工程は上記手順の際に吸収されていたかもしれない一切の残存湿分の除去を確かなものにするためである。
最終産物は約１μm〜約900μm、好ましくは約30μm〜約750μmの粒子サイズを有する白色の粉末である。好ましくは、粒子は約150〜300μmの平均に分布する。この材料は通常の生理食塩水または他の類似の適切な再水和剤に懸濁することにより容易に再水和できる。再水和無細胞組織マトリックスは通常の生理食塩水または他のいかなる適切な医薬的に共存可能な担体中に懸濁してもよい。

粒状無細胞組織マトリックスの注射：上記の方法にしたがって作製した乾燥凍結破壊粒状無細胞組織マトリックスを再水和し、１mlあたり約50mgの粒状材料の濃度でリン酸緩衝生理食塩水に再懸濁した。この懸濁液を1mlのツベルクリン注射器に吸い込んだ。サンプルを、試験動物に注射するために独立の研究所に４℃にて一晩デリバリーによって送った。サンプルをラットの背中側の皮下平面または（耳の後ろの）耳下のいずれかに注射した。動物を３日間観察し、注射領域の周辺およびその部分を含む皮膚のサンプルをその時点で評価のために切り取った。組織学的評価によりラットの皮下筋層のすぐ上のヒト真皮の粒子が明らかになった。切り出した組織の顕微鏡観察により、宿主動物による重篤な急性炎症性応答の徴候は全く無しに粒状無細胞組織マトリックスは再配置していたことが明らかになった。

湿潤処理無細胞組織マトリックスと凍結破壊無細胞組織マトリックスの比較：
湿潤処理（室温）した粒状無細胞組織マトリックスと凍結破壊（液体窒素温度）した粒状無細胞組織マトリックスの両方を以下のようにして調製した：初めにAlloDerm^Rのサンプルを再水和し、その再水和無細胞組織マトリックスをストリップに切断し、それらのストリップをリン酸緩衝生理食塩水中で室温にてホモゲナイズすることによって湿潤処理粒状無細胞組織マトリックスを作製した。極低温破壊粒状無細胞組織マトリックスは本明細書中で上述した本発明の方法に従って調製した。使用に先立ち、凍結破壊粒状無細胞組織マトリックスをリン酸緩衝生理食塩水で再水和し、遠心によりペレット化した。

得られた粒状無細胞組織マトリックス材料の各サンプルを1mlあたり約50mgの粒状材料の濃度でリン酸緩衝生理食塩水に懸濁した。この懸濁液を1mlのツベルクリン注射器に吸い込んだ。サンプルを、試験動物に注射するために独立の研究所に４℃にて一晩デリバリーによって送った。サンプルをラットの背中側の皮下平面または耳下のいずれかに注射した。動物を３日間観察し、その後、注射領域の周辺およびその部分を含む皮膚のサンプルを評価のために切り出した。サンプルの目視および顕微鏡観察によって以下が明らかになった：
湿潤処理 極低温破壊
目視 1/15^* 12/15^*
顕微鏡 6/30^* 24/30^*
＊ 粒状AlloDerm^Rの残留を示したサンプル数／サンプルの総数

上記を検討すれば、当業者は本発明によって処理したサンプルが湿潤処理材料よりもおよそ４倍の残留率を有することを理解し認めるであろう。このことより、当業者は湿潤処理粒状無細胞組織マトリックスは無細胞組織マトリックスの生理学的特性に基本的な変化を生じさせ、宿主動物によるより迅速な分解または吸収を生じさせることと結論するに違いない。

長期間の動物解析：
本発明の方法による凍結破壊粒状無細胞ブタ組織マトリックスをブタモデル動物に皮下および真皮下注射した。1mlの生理食塩水あたり150mgの粒状マトリックス濃度をこの研究に使用した。注射後３か月および６か月に注射部位のバイオプシーを得た。これらのバイオプシーにより、急性炎症のなんらの徴候も無く６か月後において粒状マトリックスの残留が明らかにされた。さらに、粒状マトリックスはブタ線維芽細胞とともに再配置し、粒状マトリックスの血管再生の証拠を示した。
上記の開示に鑑み，当業者は本発明のひとつの例示的実施態様が無細胞組織マトリックスを処理して粒状無細胞組織マトリックスを生じさせることを含み、その方法が以下を含むことを理解し認めるであろう：乾燥無細胞組織マトリックスストリップを極温にて極低温破壊すること；および得られる粒子を極低温にてサイズにより分別し、粒状無細胞組織マトリックスを生成すること。

本発明の他の例示的実施態様には、無細胞組織マトリックスを処理して粒状無細胞組織マトリックスを生じさせることを含み、その方法の例は以下を含む：乾燥無細胞組織マトリックスストリップを極低温にて極低温破壊すること；得られる粒子を極低温にてサイズにより分別すること；および、所望のサイズの粒子画分を凍結乾燥させ、吸収していたかもしれない一切の湿分を除去して粒状無細胞組織マトリックスを生成すること。
更に、本発明の他の例示的実施態様には、無細胞組織マトリックスを処理して粒状無細胞組織マトリックスを生じさせることを含み、その方法の例は以下を含む：乾燥無細胞組織マトリックスのシートをストリップに切断すること；その乾燥無細胞組織マトリックスストリップを低温にて低温破壊すること；得られる粒子を低温にてサイズにより分別すること；所望のサイズの粒子画分を凍結乾燥させ、吸収していたかもしれない一切の湿分を除去して乾燥粒状無細胞組織マトリックスを生成すること；および、その乾燥無細胞組織マトリックスを再水和すること。

上記の方法に加えて、本発明はまた上述した方法の産物にも関する。一つの例示的態様においては、本産物は、本明細書に開示される方法の産物と共に、上皮成長因子、線維芽細胞成長因子、神経成長因子、ケラチン細胞成長因子、血小板由来成長因子、血管作動性小腸ペプチド、幹細胞因子、骨形成タンパク質、軟骨細胞因子およびそれらの組合せから選ばれる成長剤および刺激剤も含む。本発明の他の実施態様には、間充組織幹細胞、上皮幹細胞、軟骨組織幹細胞造血幹細胞およびこれらの組合せから選ばれる幹細胞と組み合わされた本発明の産物が含まれる。本発明の産物は更に鎮痛薬または止血剤または抗生物薬またはこれらの組合せを含んでよい。

本発明の組成物および方法は好ましい実施態様を参照して記載してきたが、本発明の概念および範囲を逸脱することなく本明細書に記載の方法に様々な改変を行い得ることは当業者には明らかである。そのような当業者に明らかな類似の置換および改変は本発明の範囲および概念のうちであると考えるべきである。

図１は、本発明によって極低温破壊されたコラーゲン線維の束である。 図２は室温でホモゲナイズしたコラーゲン線維の束の図解である。

Claims (10)

1. 無細胞組織マトリックスを処理して粒状無細胞組織マトリックスを生じさせる方法であって、
   皮膚無細胞組織マトリックスを選択すること；
   前記無細胞組織マトリックスを乾燥させること；
   前記無細胞組織マトリックスを-100℃以下に維持された極低温にて破壊し、すり切れた末端を有しない粒子を生成すること；および、
   得られる粒子を-100℃以下に維持された極低温にて粒子サイズが１μm〜900μmとなるようにサイズにより分別して粒状無細胞組織マトリックスを生じさせること、
   を含む、前記方法。
   
2. 無細胞組織マトリックスを処理して粒状無細胞組織マトリックスを生じさせる方法であって、
   皮膚無細胞組織マトリックスを選択すること；
   前記無細胞組織マトリックスを乾燥させること；
   前記無細胞組織マトリックスを-100℃以下に維持された極低温にて破壊し、すり切れた末端を有しない粒子を生成すること；および、
   得られる粒子を-100℃以下に維持された極低温にて粒子サイズが１μm〜900μmとなるようにサイズにより分別すること；および
   所望のサイズの粒子画分を凍結乾燥して、吸収していたかもしれない一切の湿分を除去して乾燥粒状無細胞組織マトリックスを製造すること、
   を含む、前記方法。
   
3. 無細胞組織マトリックスを処理して粒状無細胞組織マトリックスを生じさせる方法であって、
   乾燥皮膚無細胞組織マトリックスのシートをストリップに切断すること；
   前記乾燥皮膚無細胞組織マトリックスストリップを-100℃以下に維持された極低温にて破壊し、すり切れた末端を有しない粒子を生成すること；
   得られる粒子を-100℃以下に維持された極低温にて粒子サイズが１μm〜900μmとなるようにサイズにより分別すること；
   所望のサイズの粒子画分を凍結乾燥して、吸収していたかもしれない一切の湿分を除去して乾燥粒状無細胞組織マトリックスを生じさせること；および、
   前記乾燥無細胞組織マトリックスを再水和すること、
   を含む、前記方法。
   
4. 請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法の産物。
   
5. 上皮成長因子、線維芽細胞成長因子、神経最長因子、ケラチン細胞成長因子、血小板由来成長因子、血管作動性小腸ペプチド、幹細胞因子、骨形成タンパク質、軟骨細胞成長因子およびそれらの組合せから選ばれる成長剤および刺激剤を更に含む請求項４に記載の産物。
   
6. 間充組織幹細胞、上皮幹細胞、軟骨組織幹細胞、造血幹細胞およびそれらの組合せから選ばれる幹細胞を更に含む請求項５に記載の産物。
   
7. 更に鎮痛剤を含む、請求項５に記載の産物。
   
8. 更に止血剤を含む、請求項５に記載の産物。
   
9. 更に抗生物薬を含む、請求項５に記載の産物。
   
10. 更に、粒状無細胞組織を非ヒト動物のレシピエント部に適用することを含む請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法であって、前記適用方法が注射、噴霧、層状化、パッキング、ケーシングまたはこれらの組合せから選ばれる前記方法。

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