JP2002518319A5

JP2002518319A5 -

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Publication number: JP2002518319A5
Application number: JP2000554350A
Authority: JP
Filing date: 1999-06-18
Publication date: 2010-08-05
Anticipated expiration: 2019-06-18

Description

【特許請求の範囲】
【請求項１】皮膚無細胞組織マトリックスを選択すること；
前記無細胞組織マトリックスを乾燥させること；
前記無細胞組織マトリックスを極低温に冷却すること；
前記無細胞組織マトリックスを-50℃以下に維持された極低温にて破壊し、すり切れた末端を有しない粒子を生成すること、
を含む、
無細胞組織マトリックスを処理して粒状組織マトリックスを生じさせる方法。
【請求項２】粒状組織マトリックスが動物において有意な異物性応答および実質的な組織マトリックスの吸収を起さないものである、請求項1に記載の方法。
【請求項３】無細胞組織マトリックスを処理して粒状無細胞組織マトリックスを生じさせる方法であって、
皮膚無細胞組織マトリックスを選択すること；
前記無細胞組織マトリックスを乾燥させること；
前記無細胞組織マトリックスを-50℃以下に維持された極低温にて破壊し、すり切れた末端を有しない粒子を生成すること；および、
得られる粒子を極低温にてサイズにより分別して粒状無細胞組織マトリックスを生じさせること、
を含む、前記方法。
【請求項４】無細胞組織マトリックスを処理して粒状無細胞組織マトリックスを生じさせる方法であって、
皮膚無細胞組織マトリックスを選択すること；
前記無細胞組織マトリックスを乾燥させること；
前記無細胞組織マトリックスを-50℃以下に維持された極低温にて破壊し、すり切れた末端を有しない粒子を生成すること；および、
得られる粒子を極低温にてサイズにより分別すること；および
所望のサイズの粒子画分を凍結乾燥して、吸収していたかもしれない一切の湿分を除去して乾燥粒状無細胞組織マトリックスを製造すること、
を含む、前記方法。
【請求項５】無細胞組織マトリックスを処理して粒状無細胞組織マトリックスを生じさせる方法であって、
乾燥皮膚無細胞組織マトリックスのシートをストリップに切断すること；
前記乾燥皮膚無細胞組織マトリックスストリップを-50℃以下に維持された極低温にて破壊し、すり切れた末端を有しない粒子を生成すること；
得られる粒子を-50℃以下に維持された極低温にてサイズにより分別すること；
所望のサイズの粒子画分を凍結乾燥して、吸収していたかもしれない一切の湿分を除去して乾燥粒状無細胞組織マトリックスを生じさせること；および、
前記乾燥無細胞組織マトリックスを再水和すること、
を含む、前記方法。
【請求項６】請求項１，２、３、４または５に記載の方法の産物。
【請求項７】上皮成長因子、線維芽細胞成長因子、神経最長因子、ケラチン細胞成長因子、血小板由来成長因子、血管作動性小腸ペプチド、幹細胞因子、骨形成タンパク質、軟骨細胞成長因子およびそれらの組合せから選ばれる成長剤および刺激剤を更に含む請求項６に記載の産物。
【請求項８】間充組織幹細胞、上皮幹細胞、軟骨組織幹細胞、造血幹細胞およびそれらの組合せから選ばれる幹細胞を更に含む請求項７に記載の産物。
【請求項９】更に鎮痛剤を含む、請求項７に記載の産物。
【請求項１０】更に止血剤を含む、請求項７に記載の産物。
【請求項１１】更に抗生物薬を含む、請求項７に記載の産物。
【請求項１２】乾燥粒状無細胞組織マトリックスが１μm〜900μmの粒子サイズを含む、請求項７に記載の産物。
【請求項１３】更に、粒状無細胞組織を非ヒト動物のレシピエント部に適用することを含む請求項１、２、３、４または５に記載の方法であって、前記適用方法が注射、噴霧、層状化、パッキング、ケーシングまたはこれらの組合せから選ばれる前記方法。
【請求項１４】請求項６〜１２のいずれか1項記載の無細胞組織マトリックスまたは産物の使用であって、前記無細胞組織が、ざ瘡の傷、失禁、膀胱尿管逆流、損失組織、および胃腸灌流からなる群より選ばれる疾患の治療用に（ａ）注射可能、（ｂ）噴霧可能、（ｃ）層状化可能、（ｄ）パッキング可能、（ｅ）ケース内封入可能および（ｆ）これらの組合せである投与可能形態からなる群より選ばれる形態である、前記使用。
【請求項１５】損失組織が皮膚である、請求項１４記載の使用。
【請求項１６】損失組織が組織の除去を伴う外科手術による組織損失による、請求項１４または１５記載の使用。
【請求項１７】すり切れていない末端を有する乾燥皮膚無細胞組織の乾燥粒子を含む無細胞組織マトリックス。

発明の概要
本発明は一般に無細胞組織マトリックスを処理して粒状無細胞組織マトリックスを生じさせる方法に関する。本発明の方法の一般的な態様は以下の工程を含む：極低温において乾燥無細胞組織マトリックスストリップを極低温破壊すること；および得られた粒子を極低温にてサイズによって分別すること。好ましい実施態様において、本発明の方法は以下を含む：乾燥無細胞組織マトリックスシートを極低温にてストリップに切断すること；極低温にて前記乾燥無細胞組織マトリックスストリップを極低温破壊すること；得られた粒子を極低温にてサイズによって分別すること；および所望のサイズの粒子の画分を凍結乾燥し。吸収されていたかもしれない一切の湿分を除去して乾燥粒状無細胞組織マトリックスを生じさせること。乾燥粒状無細胞組織マトリックスの再水和は使用直前に行ってよい。

一般に、極低温破壊は０℃以下で行うことが好ましく、好ましくは温度は約-50℃より下、より好ましくは約-100℃より下であるべきである。このような温度を達成するため商業的に入手可能な冷却剤を使用することができ、それらにはハロカーボン冷却剤、液体二酸化炭素、液体窒素、液体アルゴン、液体ヘリウムおよび他のよく知られた化学的に非反応性で、従って、不活性かつ非毒性のそのような冷却薬剤が含まれる。得られる粒子の分別も、所望の粒子範囲に大きさを整えた一連の金属メッシュスクリーンを用いて低温にて行われなければならない。好ましい実施態様の一つにおいて、このスクリーンは約１μm〜約900μmのサイズの粒子を単離するように選ばれ、好ましくはスクリーンは約30μm〜約800μmのサイズの粒子を単離するように選ばれる。本発明は上述した処理の産物も包含する。
本発明のこれらの特徴および他の特徴は本発明の例示的実施態様の記載中でより完全に述べられる。その記載は図を参照して示される。

一般に、本発明の方法は以下の工程を含む：乾燥無細胞組織マトリックスストリップを低温にて極低温破壊すること；および、得られる粒子を極低温でそのサイズによって分別すること。好ましい実施態様においては、本発明の方法は以下を含む：乾燥無細胞組織マトリックスストリップを極低温にて極低温破壊すること；得られる粒子を極低温でそのサイズによって分別すること；および所望のサイズの粒子の画分を乾燥させて吸収していたかもしれない一切の湿分を除去して乾燥無細胞組織マトリックスを生じさせること。より好ましい実施態様において、本発明の方法は以下を含む：乾燥無細胞組織マトリックスのシートをストリップに切断すること；その乾燥無細胞組織マトリックスストリップを極低温にて極低温破壊すること；得られる粒子を極低温でそのサイズによって分別すること；および所望のサイズの粒子の画分を乾燥させて吸収していたかもしれない一切の湿分を除去して乾燥無細胞組織マトリックスを生じさせること；および、その乾燥粒状無細胞組織マトリックスを再水和させること。

好ましくは、乾燥無細胞組織マトリックスは、この材料の極低温破壊、粉砕又は製粉が可能な温度に極低温冷却される。本発明のひとつの実施態様において、液体温度まで冷却された滅菌ホモゲナイザーが使用される。得られる極低温破壊された材料は次に所望の範囲の粒状無細胞組織マトリックス材料を単離するために一連の粒子サイズ排除スクリーンを通される。一旦単離されると、粒状無細胞材料は、上記処理の間に吸収していたかもしれない一切の湿分を除去するために凍結乾燥してよい。
一般に、この粒状組織マトリックスは無傷の組織を粒状形態にするときに受ける機械的な損傷の量を最少にするような方法で製造される。図１に示すように、本発明によるこのコラーゲン線維の低温破壊はコラーゲン線維の「綺麗な」破壊を生じさせる。これは、従来技術における慣行であるコラーゲン組織の室温断片化から生じる、すり切れた末端および実質的に損傷したコラーゲン線維と対照的である。コラーゲン線維束の機械的断片化によって生じた損傷、特にコラーゲン線維の末端は図２に例示した。上記の図解は処理した材料の顕微鏡観察に基づいており、コラーゲンベース組織に存在するコラーゲン線維束の末端を表している。

本発明の方法の開発において、得られる粒状無細胞マトリックスの新規で予想外の特性にいくつかの因子が重要であることが分かった。そのような因子のひとつは、AlloDerm^Rのような乾燥無細胞マトリックスのホモゲナイゼーションまたは低温破戒時の温度である。本明細書において、ホモゲナイゼーションおよび極低温破壊の語は互換的に使用され、シート様出発材料から粒状材料を作り出す操作を意味する。極低温破壊を行う温度は、コラーゲン線維が極低温破壊され断片化または裂かれないように室温より充分に低くなければならないことが分かっている。一般には、この温度は０℃以下であるべきであり、好ましくは温度は約-50℃以下であるべきであり、より好ましくは約-100℃以下であるべきである。そのような温度を達成するために商業的に入手可能な冷却剤を使用することができ、そのような冷却剤にはハロカーボン冷却剤、液体二酸化炭素、液体窒素、液体アルゴン、液体ヘリウムおよび、よく知られた化学的に反応性の無い，従って不活性かつ非毒性の他の類似の冷却剤が含まれる。

本発明を行う際に重要であることが分かった他の因子は粒状無細胞組織マトリックス材料のサイズである。所望の範囲の粒子を選抜するために、極低温冷却ホモゲナイザー塔を使用する。極低温冷却ホモゲナイザー塔の役割は所望のサイズの粒子から小さすぎる又は大きすぎる粒子を分別することである。ひとつの実施態様において、液体窒素は大きすぎる粒子を排除するために第１の金属スクリーンと組み合わせて使用される。第2の金属スクリーンは、適切な最小サイズの粒子を捕獲し、小さすぎる粒子が除去されるように液体窒素と共に使用される。一つの好ましい実施態様において、第１のスクリーンは約0.0762cm（0.03インチ）の金属スクリーンであり、第２のスクリーンは約0.00381cm（0.0015インチ）金属スクリーンである。別の実施態様において、スクリーンは約１μm〜約900μmのサイズを有する粒子を単離するように選ばれ、好ましくは、スクリーンは約30μm〜約800μmのサイズを有する粒子を単離するように選ばれる。

本発明の一つの例示的実施態様において、無細胞組織マトリックスを処理して注射可能なサイズ粒子を生成する方法は以下を含む：乾燥無細胞組織マトリックスルを改変した切断装置またはメッシュ装置を用いてストリップに切断すること；極低温にて前記乾燥無細胞組織マトリックスストリップをホモゲナイズすること；得られる粒子を極低温でサイズによって分別すること；および、所望の粒子画分を凍結乾燥させ、ホモゲナイズの際に吸収していたかもしれない一切の湿分を除去すること。
本発明の他の例示的実施態様は、ヒトドナーから由来する無細胞組織例えばAlloDerm^Rを処理して注射可能なサイズの粒子を作製することを含み；乾燥無細胞組織マトリックスのシートを改変切断装置またはメッシュ装置を用いてストリップに切断し；ホモゲナイズ装置を液体窒素温度に平衡化すること；液体窒素に前記乾燥無細胞組織マトリックスストリップを加えること；得られる粒子を液体窒素温度でサイズによって分別すること；および、所望の粒子画分を凍結乾燥してホモゲナイズの際に吸収していたかもしれない一切の湿分を除去すること。

粒状無細胞組織マトリックスの調製
以下の手順はAlloDerm^R、裏打ち物質無しにパッケージングされた無細胞組織マトリックスを使用する。その調製は上述した。AlloDerm^RはLifeCellsha社、The Woodlands Texasから商業的にできる。パッケージから取り出した後、乾燥無細胞組織マトリックスを非-中断「連続」切断回転刃を取りつけたZimmerメッシャーを用いてストリップに切断する。得られる長い無細胞組織マトリックスのストリップを約１〜約２cmの長さに切断する。
OMNI International, Warrenton VAから入手可能なLabTeck Macroホモゲナイザーのようなホモゲナイザーと滅菌ホモゲナイザープローブを組立て、このホモゲナイザー塔に無菌液体窒素を注いで極低温に冷却する。ホモゲナイザーが極低温に達したならば、上述のようにストリップに調製しておいた無細胞組織マトリックスを無菌液体窒素を含むこのホモゲナイザー塔に入れる。次に、このホモゲナイザーの作動させ無細胞組織マトリックスのストリップを低温破壊する。極低温破壊工程の時間および継続期間は使用するホモゲナイザーの、モホゲナイズチャンバーの大きさ、ホモゲナイザーが操作される速度および時間に依存し、これらは所望の結果をえるためのパラメータの単純な変動によって当業者が決定することができる。

極低温破壊された粒状無細胞組織マトリックス材料を、ホモゲナイズ産物を液体窒素により予め冷却しておいた一連の金属スクリーンを通過させて液体窒素で洗浄することにより、粒子サイズによってソーティングする。われわれは上述した型のホモゲナイザーとスクリーンの組合せ（粒子が洗浄され、最初に大きすぎる粒子を排除し、次に望ましくない粒子を排除するためにソーティングする）が特に有用であることを見いだした。
単離されたならば、粒状無細胞組織マトリックスを取り出し、バイアルに入れ液体窒素を蒸発させた後に凍結乾燥する。この最後の工程は上記手順の際に吸収されていたかもしれない一切の残存湿分の除去を確かなものにするためである。
最終産物は約１μm〜約900μm、好ましくは約30μm〜約750μmの粒子サイズを有する白色の粉末である。好ましくは、粒子は約150〜300μmの平均に分布する。この材料は通常の生理食塩水または他の類似の適切な再水和剤に懸濁することにより容易に再水和できる。再水和無細胞組織マトリックスは通常の生理食塩水または他のいかなる適切な医薬的に共存可能な担体中に懸濁してもよい。

湿潤処理無細胞組織マトリックスと凍結破壊無細胞組織マトリックスの比較：
湿潤処理（室温）した粒状無細胞組織マトリックスと凍結破壊（液体窒素温度）した粒状無細胞組織マトリックスの両方を以下のようにして調製した：初めにAlloDerm^Rのサンプルを再水和し、その再水和無細胞組織マトリックスをストリップに切断し、それらのストリップをリン酸緩衝生理食塩水中で室温にてホモゲナイズすることによって湿潤処理粒状無細胞組織マトリックスを作製した。極低温破壊粒状無細胞組織マトリックスは本明細書中で上述した本発明の方法に従って調製した。使用に先立ち、凍結破壊粒状無細胞組織マトリックスをリン酸緩衝生理食塩水で再水和し、遠心によりペレット化した。

得られた粒状無細胞組織マトリックス材料の各サンプルを1mlあたり約50mgの粒状材料の濃度でリン酸緩衝生理食塩水に懸濁した。この懸濁液を1mlのツベルクリン注射器に吸い込んだ。サンプルを、試験動物に注射するために独立の研究所に４℃にて一晩デリバリーによって送った。サンプルをラットの背中側の皮下平面または耳下のいずれかに注射した。動物を３日間観察し、その後、注射領域の周辺およびその部分を含む皮膚のサンプルを評価のために切り出した。サンプルの目視および顕微鏡観察によって以下が明らかになった：
湿潤処理極低温破壊
目視 1/15^* 12/15^*
顕微鏡 6/30^* 24/30^*
＊粒状AlloDerm^Rの残留を示したサンプル数／サンプルの総数

長期間の動物解析：
本発明の方法による凍結破壊粒状無細胞ブタ組織マトリックスをブタモデル動物に皮下および真皮下注射した。1mlの生理食塩水あたり150mgの粒状マトリックス濃度をこの研究に使用した。注射後３か月および６か月に注射部位のバイオプシーを得た。これらのバイオプシーにより、急性炎症のなんらの徴候も無く６か月後において粒状マトリックスの残留が明らかにされた。さらに、粒状マトリックスはブタ線維芽細胞とともに再配置し、粒状マトリックスの血管再生の証拠を示した。
上記の開示に鑑み，当業者は本発明のひとつの例示的実施態様が無細胞組織マトリックスを処理して粒状無細胞組織マトリックスを生じさせることを含み、その方法が以下を含むことを理解し認めるであろう：乾燥無細胞組織マトリックスストリップを極温にて極低温破壊すること；および得られる粒子を極低温にてサイズにより分別し、粒状無細胞組織マトリックスを生成すること。

本発明の他の例示的実施態様には、無細胞組織マトリックスを処理して粒状無細胞組織マトリックスを生じさせることを含み、その方法の例は以下を含む：乾燥無細胞組織マトリックスストリップを極低温にて極低温破壊すること；得られる粒子を極低温にてサイズにより分別すること；および、所望のサイズの粒子画分を凍結乾燥させ、吸収していたかもしれない一切の湿分を除去して粒状無細胞組織マトリックスを生成すること。
更に、本発明の他の例示的実施態様には、無細胞組織マトリックスを処理して粒状無細胞組織マトリックスを生じさせることを含み、その方法の例は以下を含む：乾燥無細胞組織マトリックスのシートをストリップに切断すること；その乾燥無細胞組織マトリックスストリップを低温にて低温破壊すること；得られる粒子を低温にてサイズにより分別すること；所望のサイズの粒子画分を凍結乾燥させ、吸収していたかもしれない一切の湿分を除去して乾燥粒状無細胞組織マトリックスを生成すること；および、その乾燥無細胞組織マトリックスを再水和すること。

【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、本発明によって極低温破壊されたコラーゲン線維の束である。
【図２】図２は室温でホモゲナイズしたコラーゲン線維の束の図解である。