CN103981590A - 一步法乳化电纺制备pcl微纳米双峰纤维 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一步法乳化电纺制备PCL微纳米双峰纤维的方法，将PCL溶解在HFIP和DCM的混合溶剂中，配置成0.1g/mL的液体；通过外力搅拌的方法使溶液形成稳定的乳化液；将乳化液加入到静电纺丝注射器中；将高压电加到注射器针头上，调整高压电在针头的位置；调节电纺温度和湿度，调节流速；在滚筒接收器上铺上平滑的导电的锡箔纸，调节接收器转速，使形成的纤维丝形成强有力的拉力；将锡箔纸从滚筒接收器上取下，收集微纳米双峰纤维，静置干燥环境过夜，使其表面溶剂挥发，得到最终的微纳米双峰纤维。本发明的有益效果是一步法静电纺丝过程中引进乳化过程可以制备PCL微纳米双峰纤维。
Description
技术领域
本发明属于纤维制作技术领域，涉及一步法乳化电纺制备PCL微纳米双峰纤维。
背景技术
近年来，静电纺丝技术日趋成熟，作为可以制备出具有良好生物相容性、模拟细胞外基质(ECM)的成熟纳米纤维支架的技术已经广泛地应用于组织工程修复中。为了更好的在修复过程中模拟ECM的功能以及促进细胞在其中的增殖迁移和侵润作用，纳米纤维支架的结构和性能优化已经成为研究的热点[1-4]。静电纺丝过程中常使用具有良好力学性质的人工合成聚合物——聚己内酯(PCL,polycaprolactone)作为纺丝原料，因其降解产物完全无毒，而且具有良好的生物相容性、生物降解性和力学性能，在皮肤[5-7]、血管[8-11]、骨修复[12-14]上都取得了极大的进展。静电纺丝纤维支架在组织修复中起到了重要的作用，但由于传统纳米纤维的微尺寸造成的小孔径和低孔隙率，导致较低的细胞浸润仍是静电纺丝技术的一个难题。
发明内容
本发明的目的在于提供一步法乳化电纺制备PCL微纳米双峰纤维的方法，解决了现在通过标准静电纺丝装置只能制备出单峰纤维的问题。
本发明所采用的技术方案是按照以下步骤进行：
步骤1：将PCL溶解在HFIP和DCM的混合溶剂中，配置成0.1g/mL的液体；
步骤2：通过外力搅拌的方法使溶液形成稳定的乳化液；
步骤3：将乳化液加入到静电纺丝注射器中；
步骤4：将高压电加到注射器针头上，调整高压电在针头的位置；
步骤5：调节电纺温度和湿度，选择合适针头与滚筒接收器的距离避免电纺溶剂挥发不完全形成泡珠状结构；
步骤6：调节流速；
步骤7：在滚筒接收器上铺上平滑的导电的锡箔纸，调节接收器转速，使形成的纤维丝形成强有力的拉力；
步骤8：将锡箔纸从滚筒接收器上取下，收集微纳米双峰纤维，静置干燥环境过夜，使其表面溶剂挥发，得到最终的微纳米双峰纤维。
进一步，步骤1中DCM：HFIP的比例范围在0～1之间。
进一步，步骤2中搅拌的速度为100r/min。
进一步，步骤3中电纺丝注射器的电纺针头为22G规格。
进一步，步骤4中高压电的电压为17KV。
进一步，步骤5中调整温度至27℃，湿度至25％，针头与滚筒接收器距离为15cm。
进一步，步骤6中流速为1mL/h。
进一步，步骤7中滚筒接收器的转速为300r/min。
本发明的有益效果是一步法静电纺丝过程中引进乳化过程可以 制备PCL微纳米双峰纤维。
附图说明
图1(a)是本发明不同乳化溶液的宏观形态图，(b-f)是本发明PDH02、PDH13、PDH11、PDH31和PDH20五种溶液微观显微镜观测形态图；
图2(a)是本发明不同纤维支架的宏观形态图，(b-f)是本发明PDH02、PDH13、PDH11、PDH31和PDH20五种纤维支架的微观扫描电镜形态图；
图3是本发明ImageJ测量不同纤维支架的纤维直径双峰分布图；
图4是本发明比表面积及微孔分析仪测量不同纤维支架的孔径分布图；
图5(a)是本发明HaCaT细胞扫描电镜准备图，(b-f)细胞在不同纤维支架的上层运动形貌扫描电图；
图6是本发明HaCaT细胞培养1、3和5天以后细胞增殖分析图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明进行详细说明。
1.步骤1：将PCL溶解在HFIP和DCM的混合溶剂中，配置成0.1g/mL的液体。DCM：HFIP的比例范围可以在0～1之间进行选择，下面实验中取0、0.25、0.5、0.75、1(即0:4、1:3、1:1、3:1、4:0)。
步骤2：通过外力搅拌的方法使溶液形成稳定的乳化液，搅拌的速度为100r/min。
步骤3：将乳化液加入到静电纺丝注射器中，选择合适规格的电 纺针头，本发明优选为22G规格，溶液现配现用，不能长期放置。
步骤4：选择合适的电压，本发明优选为17KV。将高压电加到注射器针头上，调整高压电在针头的位置。
步骤5：调节电纺温度和湿度至合适，本发明优选为温度27℃，湿度为25％。选择合适的距离，本发明优选为15cm，避免电纺溶剂挥发不完全形成泡珠状结构。
步骤6：调节流速至合适流速，本发明优选流速为1mL/h。
步骤7：在滚筒接收器(优选直径d＝15cm)上铺上平滑的导电的锡箔纸，调节接收器转速为合适，本发明中优选为300r/min，使形成的纤维丝形成强有力的拉力。
步骤8：将锡箔纸从滚筒接收器上取下，收集微纳米双峰纤维，静置干燥环境过夜，使其表面溶剂挥发。
2试验
2.1实验仪器和材料：
人皮肤永生化细胞株HaCaT(英国巴斯大学馈赠)；1640培养基(Hyclon,美国)；聚己内酯(80kDa,sigma，美国)；细胞增殖试剂盒(MTS,Promega，美国)；HFIP(杜邦，美国)；DCM(Sigma，美国)；FITC-鬼笔环肽(EnzoLifeScienceInternational，美国)；DAPI(RocheAppliedScience，德国)；高压直流电源(DW-P503-4ACCD型，天津市东文高压电源厂)；注射泵控制器(T-3A型，保定兰格恒流泵有限公司)。
2.2静电纺丝溶液准备：
表1静电纺丝溶液配比情况
2.3溶液乳化情况观察
按照上表1配比溶液，将PCL溶于溶剂中，配成浓度为0.1g/mL的电纺丝溶液。溶剂比例DCM:HFIP分别为0:4；1:3；1:1；3:1；4:0，形成乳化情况各不相同的溶液。将溶液滴在载玻片上，使用光学显微镜(IX71,Olympus,Japan)观察乳化情况。
2.4静电纺丝支架的的制备：
喷丝头与接收器之间的距离为15cm，接收装置使用自组装的螺旋滚筒收集器，转速为300r/min。设定电压为17kv，流速为1mL/h。收集、干燥后获得具有不同形貌的PDH纤维支架。
支架的形貌观察：
选取PDH02、PDH13、PDH11、PDH31、PDH20五种不同的纤维支架，经喷金镀膜后，用扫描电镜(SEM,ZeissAurigacrossbeam system，德国)观察形貌。相同条件下不同支架重复实验三次。
2.5纤维直径的测量：
采用ImageJ图像分析软件(ImageJ,NationalInstitutesofHealth，美国)进行纤维平均直径统计，每个样品至少取300根纤维测定纤维 直径的分布。
2.6纤维孔径的测量：
支架材料的孔结构用比表面积及微孔分析仪(MICROPORE AnalyzerASAP-2020M，美国)进行分析，通过-196°N2吸附。吸附前，将准备好的样品在300℃下抽真空12个小时，N吸附等温线用标准Brunauer–Emmett–Teller(BET)方程分析并计算出比表面积(SBET)，用t-plot方法来计算微孔体积(Vmicro)和外表面面积(Sext)，计算机自动从吸附数据推导出总孔隙体积(Vtotal)，孔隙大小分布从密度泛函理论(DFT)衍生而来。
2.7细胞培养：
采用含10％胎牛血清的1640培养液培养角质形成细胞株HaCaT细胞，置于37℃，5％CO2的孵箱里培养，隔天换液一次。待细胞融合生长达80-90％时，使用0.25％的胰蛋白酶消化传代。
2.8细胞-材料相容性检测：
将5种不同的纤维支架裁成相同大小，灭菌处理后加入1640培养液过夜。将培养状态良好的HaCaT细胞均匀接种到不同的材料上，置于37℃，5％CO2的孵箱里，用含有10％胎牛血清的1640培养基培养。2.9细胞增殖检测：
细胞增殖用MTS试验来测定。细胞在支架上培养1d到7d后，各时间点取3块细胞－支架复合物进行MTS试验。在进行试验前，将原培养液移除，按试剂盒说明加入MTS试剂和新鲜培养液。经过4h的培养，振荡10min，每孔吸出100μl培养液至96孔培养板中，用TECAN酶标 仪在490nm波长下进行测量。
2.10统计学方法：
数据使用Origin8.5.1软件进行分析，实验结果以平均数±标准差(±sd)表示，两组数据间的差异性采用t检验，以ｐ＜0.05为显著性差异，ｐ＜0.01为极显著性差异。
3.实验结果与讨论：
3.1溶液乳化情况：
图1展示了不同溶液的乳化情况。图1(a)图显示五种溶液乳化程度宏观图，PDH02溶液透明均一，无乳化特征出现；在HFIP溶剂中加入不同量的乳化剂DCM致使溶液产生不同程度乳化。PDH13到PDH20四种溶液由清澈逐渐浑浊，乳化情况明显增强，说明溶液的乳化情况随着DCM的量的增加而逐渐增强。图1(b-f)通过光学显微镜观察溶液的微观乳化情况得出相同的结论。HFIP和DCM表面张力不同，HFIP表面张力小，DCM表面张力大，二者互不相容形成分散相为PCL的乳液。加入的DCM量的不同导致分散相的数量以及直径的变化，从微观图可以推断出，PDH02只形成了PCL/HFIP的溶液状态，而PDH11到PDH20形成了PCL/HFIP和PCL/DCM以及PCL/HFIP/DCM的不同相，且PDH11到PDH20形成的相直径之间差异趋向于明显化。说明DCM的增加使分散相变大，更易形成直径较大的纤维。
3.2材料表面形貌表征：
通过SEM观察静电纺丝纤维支架表面形态(图2)。五种纤维支架均呈现出多孔支架的形态。图2(a)为材料喷金之前的准备状态，五种材料均为平滑无结点的纤维膜。图2(b)为PDH02纤维， 呈现出传统纳米纤维的均一纤维膜形态；图2(c)开始出现纤维双峰分布，图2(c)到图2(f)双峰之间拉开差距，微米纤维直径呈上升趋势。这是由于在溶液中加入DCM，一方面，乳化后的液滴本身比较大，较易形成大直径的纤维；另一方面，乳化后的DCM溶液粘度比HFIP大，粘度与纤维直径呈正相关关系[16]，f纤维出现单根微米纤维丝上出现直径不均一的情况，可能因为溶剂只有DCM，溶液蒸发速率相对较低，在同样的纺丝距离和纺丝时间下，溶剂挥发不完全，导致纤维拉伸不完全，形成了纤维丝局部不均一的情况。
3.3不同乳化程度对纤维直径的影响：
使用ImageJ测量统计纤维直径分布情况(图3)。纤维直径分布图显示出，不同的乳化情况产生了不同的微-纳米尺寸分布。加入的DCM越多，乳化情况越严重，产生的纤维尺寸越不均一。DCM:HFIP＝0:4时，没有乳化情况，产生的PDH02支架纳米纤维数量占总纤维数量的接近100％，而DCM:HFIP＝4:0时，溶剂完全为DCM，乳化情况最强，纤维尺寸差异最明显，产生的PDH20支架纳米纤维数量占总纤维数量的不到20％，微米纤维数量占总纤维数量的80％。其中，DCM:HFIP＝1:3的PDH13、DCM:HFIP＝1:1的PDH13、DCM:HFIP＝3:1的PDH31的双峰纤维比例逐渐加大，微米纤维所占比例为别为62％、70％和73％。
3.4纤维孔径分析：
样品干燥后通过N2吸附后检测，得到支架纤维孔径分布(图4)。PDH02在区域分布较广；PDH13、PDH11、PDH31和PDH20在 区域分布较广。表2中给出了比表面积、外表面积、平均孔径 等参数。从表中可以看出纳米纤维具有传统优良的大比表面积的外表面积，而双峰纤维具有较大的平均孔径。同时，随着乳化程度的增加，平均孔径呈增长趋势。
表2不同支架的孔结构参数
3.5细胞在支架上的形态：
HaCaT细胞在不同支架上培养48h后，SEM观察细胞在材料上的运动形态表征(图5)。图5(a)HaCaT细胞扫描电镜准备图；不同纤维尺寸上细胞的运动状态不同[17]，图5(b)和(c)中，材料上的细胞紧紧粘附在材料的上面，呈铺展状态，而d-f图中，细胞呈现出一个正在运动的状态。d图表示，细胞感受支架材料的状态，试图从中间收缩进入材料下层，e图中材料已经进入到材料下层并呈现出铺展的状态，f图中细胞同时展示了刚进入下层支架中的收紧状态以及收缩成球状打算进入下层支架的状态。说明双峰纤维对细胞浸润有促进作用。
3.6细胞增殖分析：
细胞在支架上培养了5d，MTS方法分析细胞增殖情况(图6)。第1d，细胞数目PDH02纳米纤维支架与其他双峰纤维支架基本出现了显著差异。双峰纤维较纳米纤维细胞粘附较少，证明纳米结构相对于微米结构而言利于细胞粘附。第3d，PDH02纳米纤维上细胞持续增长，PDH02纳米纤维支架与其他双峰纤维支架基本出现了显著差异，而且与PDH31支架出现极显著差异。双峰纤维上细胞增殖速度 高于纳米纤维，PDH20却出现增殖速度明显降低的趋势，可能是纳米结构过少，微纳米结构比例失衡，不足以支持细胞在其中的粘附和增殖。第5d(天)，趋势与第三天大致相同，PDH02纳米纤维支架与其他双峰纤维支架基本出现了显著差异，PDH11双峰纤维支架与PDH02纳米纤维支架出现极显著差异。由此可见，支架的微-纳米交叉结构对细胞增殖有较大促进，在细胞从表面进入支架时，下一层的纳米结构使细胞粘附在其中，而微米空间展示出的更大空间让细胞能够更快进行物质交换[18]，从而细胞在双峰结构中进行更好增殖和浸润；但纳米纤维比例过小，双峰结构失衡会抑制细胞增殖。
3.7细胞浸润情况分析：
HaCaT细胞在支架材料上培养了7天，DAPI染色后层扫细胞浸润情况结果显示，相较于PDH02纳米纤维支架而言，更多的细胞进入到双峰支架的深处，其中PDH11和PDH31双峰纤维在30μm深度细胞数量最大。表示出双峰纤维较纳米纤维而言，支架孔隙率增大，有更多的生存空间，也更利于细胞往深处浸润[19]。
4结论：
(1)通过一步法乳化静电纺丝成功制备具有微-纳米双峰的纤维支架，实验利用DCM作为诱导乳化剂，改变溶剂的乳化情况，通过一个标准电纺实验装置制备出具有不同比例的微米-纳米双峰支架。
(2)制备出的双峰纤维结合了纳米结构和微米结构的优势。纳米结构利于HaCaT细胞的粘附，而亚微米及微米结构提供开放的大孔径，为细胞浸润提供了更易于进入支架内部的条件，但是微纳米结构失衡会抑制细胞的生长。确定乳化电纺PCL纤维支架的最有利情况为 DCM：HFIP为3:1的乳化配比。
(3)通过改良静电纺丝设备改变纤维支架结构[19,20]或改变支架成分[21,22]来诱导细胞浸润已经得到了广泛应用，但本实验中的一步法乳化电纺过程更为方便，设备简单，是有前途的制备双峰纤维结构的方法，在大规模电纺制备医用支架工业化上有很大的潜力。
本实验中使用六氟异丙醇(HFIP，dichloromethane)作为溶剂，将二氯甲烷(DCM，dichloromethane)作为乳化剂，使用一步法乳化静电纺丝制备PCL/HFIP纳米纤维、PCL/HFIP/DCM微纳米纤维，并通过调整两种溶剂的比例制备出不同的双峰纤维，进一步对比了单纯纳米纤维和双峰纤维对细胞增殖和浸润的不同影响，探索工业化静电纺丝的可能性。
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Claims (8)
1.一步法乳化电纺制备PCL微纳米双峰纤维，其特征在于按照以下步骤进行：
步骤1：将PCL溶解在HFIP和DCM的混合溶剂中，配置成0.1g/mL的液体；
步骤2：通过外力搅拌的方法使溶液形成稳定的乳化液；
步骤3：将乳化液加入到静电纺丝注射器中；
步骤4：将高压电加到注射器针头上，调整高压电在针头的位置；
步骤5：调节电纺温度和湿度，选择合适针头与滚筒接收器的距离避免电纺溶剂挥发不完全形成泡珠状结构；
步骤6：调节流速；
步骤7：在滚筒接收器上铺上平滑的导电的锡箔纸，调节接收器转速，使形成的纤维丝形成强有力的拉力；
步骤8：将锡箔纸从滚筒接收器上取下，收集微纳米双峰纤维，静置干燥环境过夜，使其表面溶剂挥发，得到最终的微纳米双峰纤维。
2.按照权利要求1所述一步法乳化电纺制备PCL微纳米双峰纤维，其特征在于：所述步骤1中DCM：HFIP的比例范围在0～1之间。
3.按照权利要求1所述一步法乳化电纺制备PCL微纳米双峰纤维，其特征在于：所述步骤2中搅拌的速度为100r/min。
4.按照权利要求1所述一步法乳化电纺制备PCL微纳米双峰纤维，其特征在于：所述步骤3中电纺丝注射器的电纺针头为22G规格。
5.按照权利要求1所述一步法乳化电纺制备PCL微纳米双峰纤维，其特征在于：所述步骤4中高压电的电压为17KV。
6.按照权利要求1所述一步法乳化电纺制备PCL微纳米双峰纤维，其特征在于：所述步骤5中调整温度至27℃，湿度至25％，针头与滚筒接收器距离为15cm。
7.按照权利要求1所述一步法乳化电纺制备PCL微纳米双峰纤维，其特征在于：所述步骤6中流速为1mL/h。
8.按照权利要求1所述一步法乳化电纺制备PCL微纳米双峰纤维，其特征在于：所述步骤7中滚筒接收器的转速为300r/min。
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| Title |
|---|
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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