CN106492283B

CN106492283B - 一种矿化引导组织再生膜及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN106492283B
Application number: CN201611048682.9A
Authority: CN
Inventors: 胡艳丽; 宋天喜; 张华�; 崔云; 仇志烨; 崔菡; 崔福斋
Original assignee: Aojing Medicine Sci & Tech Co Ltd Beijing
Current assignee: Aojing Medical Technology Co., Ltd
Priority date: 2016-11-22
Filing date: 2016-11-22
Publication date: 2019-07-12
Anticipated expiration: 2036-11-22
Also published as: CN106492283A

Abstract

本发明涉及一种矿化引导组织再生膜及其制备方法和应用，其中矿化引导组织再生膜包括：疏松层，由Ⅰ型胶原和纳米羟基磷灰石复合而成；致密层，其位于所述疏松层上，所述致密层由Ⅰ型胶原构成。本发明构建了双层结构的矿化引导组织再生膜，其中疏松层与自体骨成份相一致，能够与病变的口腔骨缺损面贴合诱导新骨生成；而致密层的表面光滑，能够很好地利用膜的物理屏障功能将病损区与周围组织隔离，使特定组织的再生功能得到最大程度的发挥，且制得的矿化引导组织再生膜的抗张强度和弹性较高。

Description

一种矿化引导组织再生膜及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及生物医用材料领域，尤其涉及一种矿化引导组织再生膜及其制备方法和应用。

背景技术

牙周病是危害人类健康的三大非染性疾病之一，是指发生在牙支持组织(牙周组织)的疾病，包括仅累及牙龈组织的牙龈病和波及深层牙周组织(牙周膜、牙槽骨、牙骨质)的牙周炎两大类。牙周病的治疗包括三个方面：消除炎症，防止感染的复发及牙周组织正常结构和功能的重建。传统的治疗方法只能达到消除炎症，控制病变的发展，而已破坏的牙周组织难以恢复正常。有研究发现只有源于牙周膜的牙周前体细胞才能形成牙周质，牙槽骨和牙周膜的能力。要使牙周前体细胞占据病损的部位并有效的重建牙周组织，必须阻止不能形成牙周组织的细胞占据病损部位，改善病变根面的生物相容性和增强牙周前体细胞的活性。引导组织再生技术(Guided Tissue Regeneration，GTR)是80年代末90年代初发展起来的一项新技术，是口腔临床上经常使用的一种治疗骨缺损和获得牙周组织再生的方法，其原理是利用膜的物理屏障功能将病损区与周围组织隔离，创造一个相对封闭的组织环境，从而使特定组织的再生功能得到最大程度的发挥。

GTR膜根据膜材料是否在体内被吸收、降解，可分为可吸收性膜和不可吸收性膜。

(1)不可吸收膜可在体内持续发挥机械屏障作用，为目标组织的再生提供充足时间。

聚四氟乙烯膜(e-PTFE膜)是应用最为广泛的不可吸收材料，在临床应用中显示了比较好的引导组织再生作用，它不可降解，不会引起组织发生炎症反应和免疫反应，骨再生效果理想。最近有临床报道使用钛片加强的e-PTFE膜能成功地增加牙槽嵴的垂直高度。e-PTFE膜的缺点是组织亲和性差，创口易开裂，膜早期暴露机率高，暴露后成骨的效果受影响大；由于膜不能在体内降解，需二次手术取出，且价格昂贵，不易被患者接受。现主要用在实验研究中对比其他屏障膜的功效时采用。

钛膜在口腔种植外科的植骨术中应用较多，有报道称在唇腭裂的牙槽嵴增高术中，将钛膜覆盖于植骨表面，可以更有效地扩增牙槽骨骨量。但是钛膜具有易暴露和需二次取出等缺点，同时钛膜在使用时，需要特殊的钛钉固定位置，使用上有一定的不方便，因此，对其性能的改进也在不断地研究中。有研究在钛膜表面制备微孔，发现有利于加快微循环的早期建立；有报道通过降低钛膜的厚度来增加钛膜的组织亲和性，也能减少膜早期暴露的机率；目前仅有部分医生根据临床适应症采用。

(2)可吸收GTR膜材料

理想的GTR膜应该在选择性的引导组织再生这一过程完成时，膜材料被完全降解吸收。可吸收的GTR膜材料可分为以聚酯为代表的高分子材料和胶原为代表的天然高分子材料。

聚乳酸、聚羟基乙酸、聚乙醇酸优点在于可以通过调控合成条件可以方便地改变膜的理化特性，以期达到临床使用的效果；价格相对低，容易被患者接受；其缺点在于降解、代谢产物对机体成骨可能有不利的影响；对工业化制膜工艺的研究还有待改进。因此，虽然也有一些研究报道了这类膜的良好性能，但总体上看，这类膜的成骨效率还不稳定，要达到完美的临床要求仍然需要继续深入研究。

胶原膜具有良好的组织相容性，其抗张强度和弹性较高，而免疫原性较低，并可完全降解。目前应用最多的胶原膜是Bio-Gide，它是由纯Ⅰ型和Ⅲ猪胶原组成，其最大的优点是在体内可以降解，无需二次手术取出，即使在愈合期发生暴露，其也具有一定的抗感染能力。但是对于较严重的牙周疾病，单纯的应用GTR膜和植骨术难以取得疗效。

发明内容

本发明要解决的技术问题是，针对单纯的胶原膜引导组织再生功能不强的缺陷，提供一种矿化引导组织再生膜及其制备方法和应用。

为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：

本发明第一方面，提供了一种矿化引导组织再生膜，包括：

疏松层，由Ⅰ型胶原和纳米羟基磷灰石复合而成；

致密层，其位于所述疏松层上，所述致密层由Ⅰ型胶原构成。

在根据本发明所述的矿化引导组织再生膜中，所述疏松层呈海绵状，且平均孔径为100-250um，孔隙率为75％-90％。

在根据本发明所述的矿化引导组织再生膜中，所述致密层表面光滑，且所述致密层的密度为0.7-1.5g/cm³。

在根据本发明所述的矿化引导组织再生膜中，所述疏松层的厚度为0.08-0.15mm，所述致密层的厚度为1-2mm。

在根据本发明所述的矿化引导组织再生膜中，所述纳米羟基磷灰石的粒径为20～200nm。

本发明第二方面，还提供了一种矿化引导组织再生膜的制备方法，包括以下步骤：

步骤S1、矿化胶原颗粒的制备，具体包括：

步骤S1-1、将胶原溶于盐酸、硝酸或醋酸中的任何一种，配置成胶原的酸溶液，其中胶原浓度为0.01～0.5g/ml；

步骤S1-2、在所述胶原的酸溶液中滴加钙盐溶液，其中钙离子的加入量为每克胶原对应加入钙离子0.1～2mol；

步骤S1-3、在步骤S1-2所得溶液中滴加磷酸溶液，其中磷酸根离子的加入量与步骤S1-2中钙离子加入量的摩尔比为Ca/P＝1/1～2/1；

步骤S1-4、在步骤S1-3所得溶液中滴加NaOH溶液，形成混合溶液，调节pH值为6～8；

步骤S1-5、将步骤S1-4所得的混合溶液静置4～12小时后，以3000～6000r/min的速度离心出沉淀后在50-70℃鼓风干燥24～72小时，得到矿化胶原颗粒；

步骤S2、疏松层的制备，具体包括：

步骤S2-1、将胶原溶于纯化水中，配制第一胶原水溶液，其中胶原的质量浓度为0.1％～2％；

步骤S2-2、在第一胶原水溶液中加入步骤S1-5所得的矿化胶原颗粒，其中加入的矿化胶原颗粒与步骤S2-1中胶原的质量比为4:1-3:2，搅拌4～12小时；

步骤S2-3、将步骤S2-2得到的溶液注入到模具中，冷冻干燥24～72小时，得到疏松层；

步骤S3、致密层的制备，具体包括：

步骤S3-1、将胶原溶于纯化水中，配制第二胶原水溶液，其中胶原的质量浓度为0.01％～1％；

步骤S3-2、将放置有疏松层的模具夹持在匀胶机上，通过匀胶机在所述疏松层上滴加所述第二胶原水溶液；

步骤S3-3、将步骤S3-2的模具放置在真空干燥机中，干燥后得到在疏松层上复合有致密层的矿化引导组织再生膜。

在根据本发明所述的矿化引导组织再生膜的制备方法中，所述步骤S3-2中调节匀胶机的速度为1000～10000r/min，旋转10～60s。

在根据本发明所述的矿化引导组织再生膜的制备方法中，所述步骤S3-3中真空干燥机的温度为30-50℃，干燥4～24小时后取下薄膜。

本发明第三方面，提供了上述矿化引导组织再生膜在治疗牙周病、拔牙位点保留、先天畸形或外伤导致的口腔骨缺损的应用。尤其针对具有骨缺损的严重的牙周病具有非常好的修复及引导组织再生效果。

本发明的优点以及所带来的预想不到的技术效果至少包括如下几点：

(1)构建了双层结构的矿化引导组织再生膜，其中疏松层由Ⅰ型胶原和纳米羟基磷灰石复合构成，与自体骨成份相一致，能够与病变的口腔骨缺损面贴合诱导新骨生成；而致密层的表面光滑，能够很好地利用膜的物理屏障功能将病损区与周围组织隔离，使特定组织的再生功能得到最大程度的发挥；矿化引导组织再生膜本身具有良好的组织相容性，其抗张强度和弹性较高，而免疫原性较低，并可完全降解。

(2)如果使用单纯的胶原膜搭配牙科骨粉使用来治疗严重的牙周疾病，也能比单纯使用胶原膜得到更好的治疗效果，但是使用牙粉必然会增加患者的经济负担，本发明的矿化引导组织再生膜不仅减少了患者购买牙科骨粉的费用，而且通过将纳米羟基磷灰石复合在胶原膜内部形成矿化胶原，可以得到更适于牙齿根面修复的降解性能和促进细胞生长的能力，对于非常严重的牙周疾病有很好的治疗效果。

(3)本发明制得的矿化引导组织再生膜的孔径和孔隙率适中，平均孔径为100-250um，孔隙率为75％-90％，能更好地促进口腔骨缺损面的细胞生长；且矿化引导组织再生膜的厚度适中，材料的降解速度与口腔骨缺损的修复速度匹配。

(4)制备方法中采用的胶原溶液浓度为0.01～0.5g/ml，整体溶液粘度适中，在提高胶原浓度的情况下保障了矿化的程度，避免因粘度造成局部离子浓度过大或过小所带来的影响。

(5)制备方法中每克胶原对应加入钙离子0.1～2mol，避免过多的钙离子导致钙盐的浪费或者材料中残留多余的游离钙离子，同时又避免了钙离子过少可能导致的胶原矿化不足，强度变低的缺陷，使得制得的矿化引导组织再生膜的成分更符合口腔骨缺损的病损区域修复材料要求，更好地发挥引导组织再生作用。

(6)制备方法中采用钙磷摩尔投料比为Ca：P＝1/1～2/1，提高了钙盐和磷盐的利用效率，减少了材料中游离钙盐和磷盐的残留。

(7)制备方法中采用第一胶原水溶液和第二胶原水溶液制备，与胶原的酸溶液相比，使用水溶液更有利于保持胶原的粘性，使致密层更好的黏附在疏松层上。并且第一胶原水溶液中胶原的质量浓度为0.1％～2％，可以使得疏松层中平均孔径与孔隙率达到所需的100至250μm以及70至95％。第二胶原水溶液中胶原的质量浓度为0.01％～1％，真空干燥后得到的致密层的密度达到0.7-1.5g/cm³。

(8)制备方法中加入的矿化胶原颗粒与第一胶原水溶液中胶原的质量比为4:1-3:2，此质量比更接近人体骨成分。

(9)制备方法中调节匀胶机的速度为1～10千转/分钟，旋转10～60s，可以匹配第二胶原水溶液的浓度，在疏松层上形成形态完整且厚度适中的致密层结构。

附图说明

图1为根据本发明优选实施例提供的矿化引导组织再生膜的制备方法流程图；

图2为根据本发明优选实施例的矿化引导组织再生膜的结构示意图；

图3为根据本发明优选实施例的矿化引导组织再生膜中疏松层的SEM结果图；

图4为根据本发明优选实施例的矿化引导组织再生膜中致密层的SEM结果图；

图5为根据本发明优选实施例的矿化引导组织再生膜截面的SEM结果图。

图6a和图6b分别为本发明中拔牙位点保留实验的A组和B组术后12周的样品大体观察图。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

请参阅图1，为根据本发明优选实施例提供的矿化引导组织再生膜的制备方法流程图。如图1所示，该制备方法包括以下步骤：

步骤S1、矿化胶原颗粒的制备，具体包括：

步骤S1-1、将胶原溶于盐酸、硝酸或醋酸中的任何一种，配置成胶原的酸溶液，其中胶原浓度为0.01～0.5g/ml(例如0.01、0.1、0.2或0.5g/ml)。本发明中使用的胶原均为Ⅰ型胶原。

步骤S1-2、在所述胶原的酸溶液中滴加钙盐溶液，其中钙离子的加入量为每克胶原对应加入钙离子0.1～2mol(例如0.1、0.5、1、1.5或2mol)。更优选为每克胶原对应加入钙离子1～2mol。

步骤S1-3、在步骤S1-2所得溶液中滴加磷酸溶液，其中磷酸根离子的加入量与步骤S1-2中钙离子加入量的摩尔比为Ca/P＝1/1～2/1(例如1、1.2、1.4、1.6、1.8或2mol)。

步骤S1-4、在步骤S1-3所得溶液中滴加NaOH溶液，形成混合溶液，调节pH值为6～8(例如6、7或8)。

步骤S1-5、将步骤S1-4所得的混合溶液静置4～12小时(例如4、7、10或12小时)后，以3000～6000r/min(例如3000、4500或6000r/min)的速度离心出沉淀后在50-70℃(例如50℃、60℃或70℃)鼓风干燥24～72小时(例如24、36、48或72小时)，得到矿化胶原颗粒。

步骤S2、疏松层的制备，具体包括：

步骤S2-1、将胶原溶于纯化水中，配制第一胶原水溶液，其中胶原的质量浓度为0.1％～2％(例如0.1％、0.5％、1％或2％)。

步骤S2-2、在第一胶原水溶液中加入步骤S1-5所得的矿化胶原颗粒，其中加入的矿化胶原颗粒与步骤S2-1中胶原的质量比为4:1-3:2(例如4:1、3:1、2:1或3:2)，搅拌4～12小时(例如4、7、10或12小时)。

步骤S2-3、将步骤S2-2得到的溶液注入到模具中，冷冻干燥24～72小时(例如24、36、48或72小时)，得到疏松层。

步骤S3、致密层的制备，具体包括：

步骤S3-1、将胶原溶于纯化水中，配制第二胶原水溶液，其中胶原的质量浓度为0.01％～1％(例如0.01％、0.05％、0.1％、0.5％、0.8％或1％)。

步骤S3-2、将放置有疏松层的模具夹持在匀胶机上，通过匀胶机在所述疏松层上滴加所述第二胶原水溶液；优选地，该步骤中调节匀胶机的速度为1000～10000r/min(例如1000、3000、5000、8000或10000r/min)，旋转10～60s(例如10s、30s或60s)。

步骤S3-3、将步骤S3-2的模具放置在真空干燥机中，干燥后得到在疏松层上复合有致密层的矿化引导组织再生膜。优选地，该步骤中真空干燥机的温度为30-50℃(例如30℃、40℃或50℃)，干燥4～24小时(例如4、8、12、18或24小时)后取下薄膜。

请参阅图2，为根据本发明优选实施例的矿化引导组织再生膜的结构示意图。该矿化引导组织再生膜可以采用前述制备方法制得，也可以采用其它方法制备。如图所示，本发明提供的矿化引导组织再生膜具有双层结构，包括：疏松层1和致密层2。

其中疏松层1由Ⅰ型胶原和纳米羟基磷灰石复合而成，Ⅰ型胶原和纳米羟基磷灰石的质量份数比为0.7-0.9:0.3-0.1。优选地，该疏松层呈海绵状，且平均孔径为100-250um，孔隙率为75％-90％。其中纳米羟基磷灰石的粒径为20～200nm。该疏松层1的成份与自体骨成份相一致。在使用时，将矿化引导组织再生膜的疏松层1与口腔骨缺损表面贴合，该疏松层1中复合有纳米羟基磷灰石的Ⅰ型胶原构成了矿化胶原，能够诱导新骨生成。

致密层2位于疏松层1上，该致密层由Ⅰ型胶原构成。该致密层表面光滑，致密层2的密度优选为0.7-1.5g/cm³。致密层2中Ⅰ型胶原纤维束紧密排列，具有粘合水化性、促进细胞贴附和增殖和分化的生物学功能。

优选地，上述疏松层1的厚度为0.08-0.15mm，所述致密层2的厚度为1-2mm。

本发明还提供了上述矿化引导组织再生膜在治疗牙周病、拔牙位点保留、先天畸形或外伤导致的口腔骨缺损的应用。尤其针对具有骨缺损的严重的牙周病具有非常好的修复及引导组织再生效果。

在本发明中，本发明人至少在如下方面进行了改进并取得了相应的技术效果：

(1)本发明不是直接对胶原进行矿化得到疏松层，而是通过两个步骤，即先在步骤S1中制备矿化胶原颗粒，再将其溶于一定比例的胶原水溶液中，这样以胶原为支架，使矿化胶原颗粒均匀的分布在胶原支架内，当矿化胶原膜植入口腔骨缺损的病损区时，胶原逐渐降解，矿化胶原颗粒逐步与病损区接触，诱导新骨生成。

(2)采用每克胶原滴加钙离子0.1～2mol；现有技术中有时候会滴加过少的钙离子，有时甚至低至0.01mol；有时候又滴加过多的钙离子，有时高至2.5mol/g；过多的钙离子会导致钙盐的浪费或者材料中残留多余的游离钙离子，使得后续的清洗变得复杂甚至困难，如果钙离子过少，则可能导致胶原矿化不足，强度变低，不符合口腔骨缺损的病损区域修复要求，影响引导组织再生作用。

(3)采用胶原溶液浓度为0.01～0.5g/ml，整体溶液粘度适中，在提高胶原浓度的情况下保障了矿化的程度，避免因粘度造成局部离子浓度过大或过小所带来的影响。

(4)采用钙磷摩尔投料比为Ca/P＝1/1～2/1，使得材料的无机盐成份更加符合羟基磷灰石的理论钙磷比1.667，提高了钙盐和磷盐的利用率，减少钙离子和/或磷酸根离子在材料中的残留，降低后续洗涤等操作难度，提高时间效率，避免游离钙离子或磷酸根离子残留造成的材料强度不足的问题。

(5)制备方法中采用第一胶原水溶液和第二胶原水溶液制备，与胶原的酸溶液相比，使用水溶液更有利于保持胶原的粘性，使致密层更好的黏附在疏松层上。并且第一胶原水溶液中胶原的质量浓度为0.1％～2％，使得疏松层中平均孔径与孔隙率达到所需的100至250μm以及70至95％。第二胶原水溶液中胶原的质量浓度为0.01％～1％，可以使真空干燥后得到的致密层的密度达到0.7-1.5g/cm³。

(6)制备方法中加入的矿化胶原颗粒与第一胶原水溶液中胶原的质量比为4:1-3:2，此质量比更接近人体骨成分。

(7)制备方法中调节匀胶机的速度为1～10千转/分钟，旋转10～60s，可以匹配第二胶原水溶液的浓度，在疏松层上形成形态完整且厚度适中的致密层结构。本发明在加入致密层后测抗缝线强度，致密层胶原的浓度越高，厚度越大，力学强度越大，穿入线后维持的时间越久，但是致密层的胶原浓度过高，在均胶的时候将不易铺开，无法得到形态完整且厚度适中的结构。

综上，本发明的制备方法具有成本低、材料利用率高、易操作等优点，由该方法制得的矿化引导组织再生膜具有力学强度高、降解时间与口腔骨缺损修复时间匹配、平均孔径和孔隙率复合要求、引导性和诱导性优异等优点。

外，本发明人还在质量体系建立过程中，对部分原材料进行了如下改进并取得了相应的技术效果：

(1)采用了Ⅰ型胶原蛋白，非凝胶状态的纤维作为胶原原料，避免因为凝胶中固含量的不一致，造成投料量不一致；同时Ⅰ型胶原是在动物体中发现的一种结构蛋白，是自体骨的主要有机组成部分。Ⅰ型胶原蛋白是脊柱动物的主要结构蛋白，是成骨过程中成骨细胞分泌的细胞外基质，是钙盐沉积的支架和骨基质矿化的促进剂、矿化的模板；能促进细胞迁移、吸附、分化，并能调节细胞生长，作为生物材料已被美国FDA认可，并有一系列胶原植入产品，包括骨植入产品。

(2)采用了药用或药用辅料级别的钙盐、磷盐，避免因为原料的级别造成杂质、重金属、灰分的超标，也影响材料的生物相容性。

(3)采用双层结构的矿化引导组织再生膜，不仅减少了患者购买牙科骨粉的费用，而且通过将纳米羟基磷灰石复合在胶原膜内部形成矿化胶原，可以得到更适于口腔骨缺损修复的降解性能和促进细胞生长的能力，对于非常严重的牙周疾病有很好的治疗效果。

需要特别指出的是，本说明书的数值范围表示该数值范围的上限值、下限值以及处在该数值范围之内的任何数值或者子范围。因此，如果没有特别说明，在本说明书中涉及数值范围时就不再详细列举包含在该数值范围内的具体数值。

实施例

下文将通过实施例的形式对本发明进行举例说明，但是本发明的保护范围不应被理解为限于这些实施例。

实施例1

(1)将Ⅰ型胶原溶于浓度为0.5M的醋酸，配置成胶原的酸溶液，其中Ⅰ型胶原浓度为0.01g/ml；

(2)在所述胶原的酸溶液中滴加钙盐溶液，其中钙离子的加入量为每克胶原对应加入钙离子1mol；

(3)在步骤2所得溶液中滴加磷酸溶液，其中磷酸根离子的加入量与步骤S1-2中钙离子加入量的摩尔比为Ca/P＝1.5/1；

(4)在步骤3所得溶液中滴加NaOH溶液，形成混合溶液，调节pH值为8；

(5)将步骤4所得的混合溶液静置4小时后，以3000r/min的速度离心出沉淀后在50℃鼓风干燥24小时，得到矿化胶原颗粒。

(6)将胶原溶于纯化水中，配制第一胶原水溶液，其中胶原的质量浓度为0.1％；

(7)在第一胶原水溶液中加入步骤5所得的矿化胶原颗粒，其中加入的矿化胶原颗粒与步骤6中胶原的质量比为，搅拌4小时；

(8)将步骤7得到的溶液注入到模具中，冷冻干燥24小时，得到疏松层。

(9)将胶原溶于纯化水中，配制第二胶原水溶液，其中胶原的质量浓度为0.01％；

(10)将放置有疏松层的模具夹持在匀胶机上，通过匀胶机在所述疏松层上滴加所述第二胶原水溶液；优选地，该步骤中调节匀胶机的速度为1000r/min，旋转10s；

(11)将步骤10的模具放置在真空干燥机中，干燥后得到在疏松层上复合有致密层的矿化引导组织再生膜。其中真空干燥机的温度为40℃，干燥4小时后取下薄膜。

(12)根据临床需求对获得的矿化引导组织再生膜进行切割、修剪，即得具有双层结构的矿化引导组织再生膜。

实施例2至14

除了下表1和表2的内容之外，以与实施例1基本相同的方式进行。

注：第二胶原水溶液中胶原浓度表示胶原的质量浓度。

SEM结果观察

通过扫描电子显微镜(SEM)对实施例1制得的矿化引导组织再生膜进行观察。请参阅图3为其中疏松层的SEM结果图，图4为致密层的SEM结果图，图5为矿化引导组织再生膜截面的SEM结果图。如图所示，其中疏松层为多孔结构，致密层则表面光滑，从两者的截面图可以看出，致密层由Ⅰ型胶原纤维束紧密排列构成，疏松层中则复合有纳米羟基磷灰石颗粒，并且两者的连接面紧密，无分层现象。

抗缝线强度实验

取实施例1制得的矿化引导组织再生膜10×10mm置于生理盐水中浸泡1min、漂洗后，用扁平夹子夹住一边5mm处，垂直悬挂在支架上，下边3mm处穿一3/0的线环，线环上加挂50g砝码，5min后，该矿化引导组织再生膜不会破裂。

拔牙位点保留实验

拔除牙齿后，由于失去了生理性的刺激，牙槽嵴骨质会发生进行性、不可逆性的吸收，牙槽窝周围硬组织和软组织出现不同程度的改变，常常会造成牙槽嵴的低平及原有形态的变化，从而严重影响到未来义齿的修复，更不利于种植体的植入。充足的牙槽嵴高度和宽度对于义齿的修复至关重要，尤其是种植修复。目前，矿化引导组织再生膜与人工骨修复材料结合广泛用于拔牙后保存牙槽嵴。

1.实验方法：

除6犬下颌双侧第三前磨牙，共有24个牙槽窝，随机分成A，B，C三组，分别是8，8，8个牙槽窝。A、B、C三组拔牙窝分别做如下处理：

A组实验组：在牙槽窝内植入纳米羟基磷灰石/胶原人工骨材料并覆盖实施例1制得的矿化引导组织再生膜；

B组对照组1：在牙槽窝内植入纳米羟基磷灰石/胶原人工骨材料；

C组为空白对照：拔牙窝内充满血液并颊舌侧对位间断缝合(图4)。

注：上述纳米羟基磷灰石/胶原人工骨材料为北京奥精医药科技有限公司产品。术后，每天一次给所有动物喂食预防抗感染和抗炎药物。术后12周在麻醉下处死动物。所取样本包括实验拔牙位点及其周围的牙槽骨，进行大体观察和形态学测量。

2.实验结果：

(1)大体观察

实验犬由于伤的疼痛刺激术后4天大多饮食及一般情况不佳，术后1周饮食正常。术后1-4天，口内黏膜轻度充血发红，5天后黏膜色泽正常，拔牙创表面完全被上皮组织覆盖。2周后伤口愈合良好，均达到一期愈合。所有动物均生存良好，未发生明显伤口出血、感染或拔牙窝内植入物脱落情况。术后10周口内黏膜色泽正常，质地坚韧而富有弹性。术后12周A组牙槽嵴轮廓饱满，探测质地坚硬，与邻牙牙槽骨质地相当，表面未见材料残留(如图6a所示)。B组牙槽嵴外形丰满度稍逊于A组，表面可见少许残余材料(如图6b所示)，质地不如A组，C组可见唇侧骨壁坍塌明显，高度和宽度下降明显。

(2)形态学测量

10周测量实验各组颊舌侧牙槽窝嵴顶高度差，10周内，A，B，C三组的颊舌侧牙槽窝嵴顶高度差分别为1.12±0.13mm，1.38±0.12mm，1.74±0.12mm，如表3所示。三组统计有显著性差异。A组牙槽嵴高度和宽度降低明显小于B组和C组，有效的减缓牙槽骨的吸收。

表3实验各组颊舌侧牙槽嵴顶高度差(mm)

与C组比较，P<0.05；△与B组比较，P<0.05.

(3)X射线显微CT检测

12周，X射线显微CT显示A组纳米羟基磷灰石/胶原人工骨和矿化引导组织再生膜材料吸收降解，新生骨组织表面疏松多孔，A组新生骨与周围颊舌侧骨板界限较为模糊，已基本完成骨性结合，其它两组界限较A组更为明显且骨结合效果不及A组。A组新生骨组织充满整个拔牙窝，排列紧密有序。超微结构显示大量新生的骨小梁紧密有序地排列成立体网状结构，大部分已改建形成成熟骨，并有部分新生骨小梁正在发生改建，B组新生骨组织较A组相对排列比较疏松、无规则，且数目少于A组。超微结构表明B组虽形成了网状结构但结构立体网状的紧密有序性差于A组，只有部分新骨完成改建，成熟骨数量不如A组，成骨效果不如A组。C组新生骨组织最少，排列最为疏松，紊乱。超微结构显示C组新生骨小梁数目稀少且未形成立体网状结构，几乎未见改建后的成熟骨，成骨效果最差。分析三组3个VOI区域内骨密度(BMD)、骨体积分数(BV/TV)，骨小梁厚度(Tb.Th)，骨小梁数量(Tb.N)以及骨小梁分离度之和(Th.Sp)的平均值、标准差见表4。12周六项指标组间比较时差异具有统计学意义。BMD，TMD，BV/TV，Tb.Th，Th.N越大，骨结构越趋于稳定和成熟，相反Th.Sp越大，骨小梁之间距离越大，三维立体网状结构的紧密有序性越差，骨的结构越差。该结果可在一定程度上表明A组的成骨效果最为理想。

表4术后12周三组3个VOI区域内骨密度(BMD)、骨体积分数(BV/TV),骨小梁厚度(Tb.Th)，骨小梁数量(Tb.N)以及骨小梁分离度(Th.Sp)之和的平均值、标准差

Tb.Th，Th.Sp单位为mm，Tb.N单位为mm^-1，BMD单位为g/cm³。☆与C组比较，P<0.05；△与B组比较，P<0.05。

Claims

1.一种矿化引导组织再生膜的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤S1、矿化胶原颗粒的制备，具体包括：

步骤S2、疏松层的制备，具体包括：

步骤S3、致密层的制备，具体包括：

2.根据权利要求1所述的矿化引导组织再生膜的制备方法，其特征在于，所述步骤S3-2中调节匀胶机的速度为1000～10000r/min，旋转10～60s。

3.根据权利要求1所述的矿化引导组织再生膜的制备方法，其特征在于，所述步骤S3-3中真空干燥机的温度为30-50℃，干燥4～24小时后取下薄膜。