CN114129778B - 一种通过静电纺丝与静电喷雾相结合制备引导组织再生膜的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种通过静电纺丝与静电喷雾相结合制备引导组织再生膜的方法。所述方法为：将PLCL静电纺丝液进行静电纺丝，制得光滑层；将PLCL静电纺丝液与I型胶原静电纺丝液进行静电纺丝对纺，在光滑层的表面上制得中间层；将I型胶原静电纺丝液进行静电纺丝，并同时将矿化胶原静电喷雾液进行静电喷雾，在中间层的表面上制得粗糙层，然后经过干燥，交联，制得引导组织再生膜。本发明制得的引导组织再生膜能起到隔离屏障作用，又具备一定引导组织再生性能，有利于细胞的黏附、增殖和分化，可以随着胶原的降解为细胞爬行提供空间，并且机械性能及操作性等俱佳。

Description

一种通过静电纺丝与静电喷雾相结合制备引导组织再生膜的 方法

技术领域

本发明属于医疗器械材料技术领域，尤其涉及一种通过静电纺丝与静电喷雾相结合制备引导组织再生膜的方法。

背景技术

种植牙已成为牙列缺损以及缺失的重要修复手段，但由于牙槽嵴自然萎缩、外伤、牙周疾病等各种原因导致的骨量不足，降低了种植修复的成功率，限制了种植牙的使用范围，而引导组织再生技术(GTR)的应用能够有效解决骨量不足、牙槽突骨缺损的问题。该技术是在骨缺损处放置屏障膜阻止成纤维细胞进入骨缺损部位，同时也要能够促进成骨细胞的黏附、增殖和骨组织再生。

组织工程支架材料是组织工程构建的一个重要因素，选择合适的支架材料对再生修复策略的成功与否起着非常重要的作用。GTR技术中屏障膜的设计需要考虑很多因素：生物安全性、组织整合性、细胞阻隔作用、空间维持能力、可降解性及临床可操作性等。目前，最常用的可吸收膜主要由胶原蛋白、聚乙交酯(PGA)、聚乳酸(PLA)、聚己内酯(PCL)以及他们的共聚物等组成；结构上合适的孔径大小能阻挡软组织生长并有利于氧气、营养物质和生物活性因子的扩散。

静电纺丝技术是一种利用聚合物溶液或熔体在高压电场作用下形成喷射流，拉伸从而形成纤维的技术，制备出的纤维直径与天然细胞外基质相近，最大程度模仿天然细胞环境，且电纺材料具有较高的孔隙率和较大的比表面积，为细胞的黏附、增殖、分化提供了良好的环境。通过对材料的选择和各项参数的调控，能够调节电纺纤维的直径、结构等各项性能。

左旋聚乳酸(PLLA)和PCL因其具有较好的生物力学性能、优秀的生物相容性，在组织工程中普遍用来制备聚合物支架，但PLLA的降解半衰期为2个月左右，且存在韧性差、断裂伸长率低等问题，而PCL的综合机械强度优于PLLA，但其降解半衰期长达一年，考虑到性能互补，可以通过PLLA和PCL的共混物来制备具有合适的降解速率和力学性能的支架材料。现有技术中有采用PLLA与PCL的共混溶液作为纺丝液通过静电纺丝法制备引导组织再生膜的致密层的相关报道(如参见中国专利申请CN103736153A)，但PLLA/PCL共混物为不相容体系，为了进一步提高PLLA/PCL体系的力学性能和稳定性，通常需要添加相容剂来提高二者的相容性，实现性能上的互补，且在PLLA/PCL共混体系中，相互限制对方的结晶行为，PCL可作为PLLA结晶过程的异相成核剂，会促使PLLA的熔融重结晶。目前未见有以具有特定比例和分子量结合的PLLA和PCL的共聚物聚(L-丙交酯-co-己内酯)(PLCL)纺丝液通过静电纺丝法制备引导组织结构层的相关报道，而本发明发现若采用聚(L-丙交酯-co-己内酯)，这种特定组成比例和分子量的共聚物通过静电纺丝法制备引导组织结构层，在生物相容性、组织整合性的基础上进一步可保证材料的力学性能、降解时间等。

Ⅰ型胶原为骨组织的主要有机成分，具有良好的生物相容性、低免疫原性、优越的渗透性以及生物可降解性，可以调节细胞形态，促进细胞黏附、迁移和分化。仿生制备的矿化胶因其组成、结构和性能与天然骨相似，有很好的生物活性和生物降解性。现有技术中有采用I型胶原和矿化胶原纳米颗粒经冷冻干燥复合得到疏松层的相关报道(如参见中国专利申请CN110420359A)，但未见有将I型胶原进行静电纺丝并同时通过静电喷雾将矿化胶纳米颗粒均匀分布在胶原纤维内的相关报道。而若能在静电纺I型胶原纤维内静电喷雾纳米矿化胶原颗粒，将有助于获得理想的细胞附着和增殖的粗糙表面形态，提高其生物活性，骨诱导性及成骨细胞的粘附与增殖。

综上，非常有必要提供一种新型的引导组织再生膜及其制备方法，以得到一种既能起到隔离屏障作用，又具备一定引导组织再生性能，有利于细胞的黏附、增殖和分化，可以随着胶原的降解为细胞爬行提供空间，且机械性能及操作性等俱佳的引导组织再生膜(GTR膜)。

发明内容

为了解决现有技术中存在的技术问题，本发明提供了一种通过静电纺丝与静电喷雾相结合制备引导组织再生膜的方法。本发明方法制得的引导组织再生膜既能起到隔离屏障作用，又具备一定引导组织再生性能，有利于细胞的黏附、增殖和分化，可以随着胶原的降解为细胞爬行提供空间，并且机械性能及操作性等俱佳。

本发明在第一方面提供了一种引导组织再生膜，所述引导组织再生膜依次包括光滑层、中间层和粗糙层；所述光滑层由聚(L-丙交酯-co-己内酯)通过静电纺丝法制得，所述中间层由聚(L-丙交酯-co-己内酯)和I型胶原通过静电纺丝对纺制得，所述粗糙层由I型胶原通过静电纺丝法和矿化胶原通过静电喷雾法复合而成。

本发明在第二方面提供了一种通过静电纺丝与静电喷雾相结合制备引导组织再生膜的方法，所述方法包括如下步骤：

S1、配制聚(L-丙交酯-co-己内酯)静电纺丝液、I型胶原静电纺丝液以及矿化胶原静电喷雾液；

S2、将所述聚(L-丙交酯-co-己内酯)静电纺丝液进行静电纺丝，制得光滑层；

S3：将所述聚(L-丙交酯-co-己内酯)静电纺丝液与所述I型胶原静电纺丝液进行静电纺丝对纺，以在步骤S2制得的光滑层的表面上制得中间层；

S4、将所述I型胶原静电纺丝液进行静电纺丝，并同时将所述矿化胶原静电喷雾液进行静电喷雾，以在步骤S3制得的中间层的表面上制得粗糙层，然后经过干燥，得到由光滑层、中间层和粗糙层组成的三层复合结构膜；

S5、将步骤S4得到的三层复合结构膜进行交联，制得引导组织再生膜。

优选地，所述聚(L-丙交酯-co-己内酯)静电纺丝液的配制为：将聚(L-丙交酯-co-己内酯)加入有机溶剂中搅拌溶解，得到聚(L-丙交酯-co-己内酯)静电纺丝液，所述聚(L-丙交酯-co-己内酯)静电纺丝液的浓度为8～12w/v％，优选的是，所述有机溶剂为氯仿、二甲基甲酰胺、四氢呋喃、二甲基亚砜、对甲苯磺酸、二氯甲烷中的一种或多种，更优选的是，所述有机溶剂由二氯甲烷和二甲基甲酰胺按照体积比为70:30混合而成；所述I型胶原静电纺丝液的配制为：将I型胶原加入有机溶剂中搅拌溶解，得到I型胶原静电纺丝液，所述I型胶原静电纺丝液的浓度为5～7w/v％，优选的是，所述有机溶剂为六氟异丙醇、三氟乙酸、三氟乙醇中的一种或多种；和/或所述矿化胶原静电喷雾液的配制为：用甲醇溶液或吡啶溶液将矿化胶原粉配制成悬浊液，然后将所述悬浊液进行超声处理，得到矿化胶原静电喷雾液，所述矿化胶原静电喷雾液的浓度为3～4.5w/v％。

优选地，在所述聚(L-丙交酯-co-己内酯)静电纺丝液的配制中，还可以往有机溶剂中加入聚乳酸、聚己内酯、聚(乳酸-乙交酯)中的一种或多种；和/或在所述I型胶原静电纺丝液的配制中，还可以往有机溶剂中加入明胶、壳聚糖、丝素蛋白、纳米纤维素中的一种或多种。

优选地，在通过静电纺丝与静电喷雾相结合制备引导组织再生膜的过程中，将用于聚(L-丙交酯-co-己内酯)静电纺丝液静电纺丝的微型注射泵、用于矿化胶原静电喷雾液静电喷雾的微型注射泵设置在圆柱形旋转接收器的同一侧，将用于I型胶原静电纺丝液静电纺丝的微型注射泵设置在圆柱形旋转接收器的另一侧。

优选地，在步骤S2和/或步骤S3中，在所述聚(L-丙交酯-co-己内酯)静电纺丝液进行静电纺丝时，所述聚(L-丙交酯-co-己内酯)静电纺丝液的流速为0.5～4mL/h，优选为1mL/h，静电纺丝的接收距离为12～25cm，优选为18cm，高压直流电源的电压为15～20kV，圆柱形旋转接收器的转速为110～130r/min；在步骤S3和/或步骤S4中，在所述I型胶原静电纺丝液进行静电纺丝时，所述I型胶原静电纺丝液的流速为0.5～4mL/h，优选为2mL/h，静电纺丝的接收距离为12～20cm，优选为15cm，高压直流电源的电压为15～20kV，圆柱形旋转接收器的转速为110～130r/min；和/或在步骤S4中，在所述矿化胶原静电喷雾液进行静电喷雾时，所述矿化胶原静电喷雾液的流速为0.5～4mL/h，优选为2mL/h，静电喷雾的接收距离为12～13cm，高压直流电源的电压为8～10kV，圆柱形旋转接收器的转速为145～160r/min。

优选地，在步骤S2中，进行静电纺丝的时间为35～50min；在步骤S3中，进行静电纺丝对纺的时间为15～25min；和/或在步骤S4中，进行静电纺丝的时间为50～70min，同时进行静电喷雾的时间为50～70min。

优选地，所述步骤S5包括如下子步骤：

S51、配制浓度为2～30mmol/L的交联液，交联剂为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，优选的是，溶剂为乙醇水溶液，更优选为质量浓度为40～80％的乙醇水溶液；

S52、将所述三层复合结构膜置于交联液中于冰浴条件下进行交联10～60min；

S53、将步骤S52进行交联后的三层复合结构膜进行清洗，然后置于乙醇水溶液中浸泡；

S54、将经步骤S53处理后的三层复合结构膜进行真空干燥，得到引导组织再生膜。

优选地，所述矿化胶原粉通过如下步骤制备而成：

(a)将I型胶原溶于盐酸、硝酸或醋酸中的任何一种，配制成浓度为0.01～0.2g/mL的I型胶原酸液；

(b)向I型胶原酸液中滴加钙盐溶液，钙离子的加入量为每克I型胶原对应加入钙离子0.1～2mol；

(c)向步骤(b)所得溶液中滴加磷酸溶液，磷酸根离子的加入量与步骤(b)中钙离子加入量的摩尔比为Ca/P＝1/1～2/1；

(d)向步骤(c)所得溶液中滴加NaOH溶液，形成混合溶液，调节pH值为6～8；

(e)将步骤(d)所得的混合溶液静置4～12h后，以3000～6000r/min的速度离心出沉淀，将沉淀物在50～70℃下鼓风干燥24～72h，得到矿化胶原；

(f)将步骤(e)所得矿化胶原进行研磨，得到矿化胶原粉。

本发明在第三方面提供了由本发明在第二方面所述的方法制得的引导组织再生膜。

本发明与现有技术相比至少具有如下有益效果：

(1)本发明制得的引导组织再生膜具有三层复合结构，依次包括光滑层、中间层和粗糙层；其中，光滑层由粗细均匀的纳米纤维组成，孔径大小均匀1-10微米左右，与天然细胞外基质相近，最大程度模仿天然细胞环境，且电纺材料具有较高的孔隙率和较大的比表面积，且能够防止结缔组织的长入，同时能够保证氧气、营养物质和生物活性因子的扩散；粗糙层均匀分布有胶原纤维和大量矿化胶原颗粒，有利于细胞的黏附、增殖和分化；而中间层由PLCL和I型胶原组成，能够起到很好的衔接作用，使三层复合结构保持稳定不易分层，且随着胶原的降解，PLCL纤维空隙逐渐增大，能够为细胞的爬行提供空间。

(2)本发明制得的引导组织再生膜中含有的聚乳酸(PLA)和聚己内酯(PCL)的结构单元、以及PLCL均获得美国食品药品监督管理局(FDA)批准用于临床，具有良好的生物相容性并且降解产物无毒；Ⅰ型胶原为骨组织的主要有机成分，具有良好的生物相容性、低免疫原性、优越的渗透性以及生物可降解性，可以调节细胞形态，促进细胞黏附、迁移和分化；矿化胶原为天然骨组织的三级结构，有很好的生物活性和生物降解性，可提高材料的骨诱导性及成骨细胞的粘附与增殖。

(3)本发明采用PLLA和PCL以特定比例和分子量结合的共聚物聚(L-丙交酯-co-己内酯)(PLCL)通过静电纺丝法制备的引导组织再生膜的光滑层，能够使得GTR膜整体具有较好的抗拉伸性能及抗缝合性能，本发明采用聚(L-丙交酯-co-己内酯)，这种特定组成比例和分子量的共聚物通过静电纺丝法制备引导组织结构层，在生物相容性、组织整合性的基础上进一步可保证材料的力学性能、降解时间等。

(4)本发明将I型胶原进行静电纺丝并同时通过静电喷雾将矿化胶纳米颗粒均匀分布在胶原纤维内，静电纺丝制得的I型胶原纤维为纳米级纤维，纳米纤维的直径小于细胞，可以模拟天然的细胞外基质的结构和生物功能；人的大多数组织、器官在形式和结构上与纳米纤维类似，这为I型胶原纳米纤维用于组织和器官的修复提供了可能；加之静电纺纳米纤维还有大的比表面积、孔隙率等优良特性；并且本发明通过克服了I型胶原静电纺丝和矿化胶原静电喷雾的合理参数设置上的难题，综合考虑配液比例、电压、接收距离、流速、接收器转速等，对纺时两侧溶剂极性等方面，才保证实现了I型胶原的静电纺丝与矿化胶原的静电喷雾对纺。

附图说明

图1是本发明实施例1制得的引导组织再生膜包括的粗糙层的扫描电镜图。图(a)表示放大倍数×500，图(b)表示放大倍数×1000，图(c)表示放大×5000，图(d)表示放大×10000。

图2是本发明实施例1制得的引导组织再生膜包括的光滑层的扫描电镜图。图(a)表示放大倍数×1000，图(b)表示放大倍数×10000。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明在第一方面提供了一种引导组织再生膜，所述引导组织再生膜依次包括光滑层、中间层和粗糙层；所述光滑层由聚(L-丙交酯-co-己内酯)(也记作：PLCL)通过静电纺丝法制得，所述中间层由聚(L-丙交酯-co-己内酯)和I型胶原通过静电纺丝对纺制得，所述粗糙层由I型胶原通过静电纺丝法和矿化胶原通过静电喷雾法复合而成。

本发明在第二方面提供了一种通过静电纺丝与静电喷雾相结合制备引导组织再生膜的方法，所述方法包括如下步骤：

S1、配制聚(L-丙交酯-co-己内酯)静电纺丝液、I型胶原静电纺丝液以及矿化胶原静电喷雾液；

S2、将所述聚(L-丙交酯-co-己内酯)静电纺丝液进行静电纺丝，制得光滑层；

S3：将所述聚(L-丙交酯-co-己内酯)静电纺丝液与所述I型胶原静电纺丝液进行静电纺丝对纺，以在步骤S2制得的光滑层的表面上制得中间层；在本发明中，进行静电纺丝对纺指的是，在圆柱形旋转接收器的两侧各采用一个机器进行静电纺丝液的高压喷射，在本发明中，步骤S3中的静电纺丝对纺指的是，在静电纺丝时，将用于聚(L-丙交酯-co-己内酯)静电纺丝液静电纺丝的微型注射泵和用于I型胶原静电纺丝液的微型注射泵设置在圆柱形旋转接收器的两侧，使得所述聚(L-丙交酯-co-己内酯)静电纺丝液与所述I型胶原静电纺丝液随着圆柱形旋转接收器的旋转同时进行静电纺丝共纺。

S4、将所述I型胶原静电纺丝液进行静电纺丝，并同时将所述矿化胶原静电喷雾液进行静电喷雾，以在步骤S3制得的中间层的表面上制得粗糙层，然后经过干燥，得到由光滑层、中间层和粗糙层组成的三层复合结构膜；本发明对步骤S4的干燥的时间没有特别的要求，使得残余溶剂充分挥发即可，优选的是，所述干燥为真空干燥，在35℃下真空干燥12h；在本发明中，所述静电纺丝和静电喷雾采用的是同一套装置，只是配制的溶液不同，主要跟溶质和溶剂有关系，溶液配制的黏稠度较高，适合进行静电纺丝，电纺时易拉丝，溶液配制的黏稠度较低，电纺时不易拉丝，适合静电喷雾形成纳米颗粒；在本发明中，通过采用合适的溶剂将I型胶原配制成了适合进行静电纺丝的静电纺丝液，通过采用合适的溶剂将矿化胶原配制成了适合进行静电喷雾的静电喷雾液，并通过将所述I型胶原静电纺丝液进行静电纺丝，并同时将所述矿化胶原静电喷雾液进行静电喷雾对纺，使得纳米I型胶原纤维内均匀分布有大量的纳米矿化胶原颗粒；在本发明中，将所述I型胶原静电纺丝液进行静电纺丝，并同时将所述矿化胶原静电喷雾液进行静电喷雾，也可认为是进行对纺，具体指的是，将用于I型胶原静电纺丝液进行静电纺丝的微型注射泵和用于矿化胶原静喷雾液进行静电喷雾的微型注射泵设置在圆柱形旋转接收器的两侧，使得所述I型胶原静电纺丝液与所述矿化胶原静电喷雾液随着圆柱形旋转接收器的旋转在圆柱形旋转接收器的两侧分别进行静电纺丝和静电喷雾；在本发明中，步骤S2、步骤S3和步骤S4采用的是同一套装置，这样可以保证不间断进行静电纺丝或静电喷雾，可有效防止分层。

S5、将步骤S4得到的三层复合结构膜进行交联，制得引导组织再生膜；本发明中的引导组织再生膜是通过静电纺丝和静电喷雾相结合制备的具有三层复合结构的引导组织再生膜；所述引导组织再生膜依次包括光滑层、中间层和粗糙层；所述光滑层由聚(L-丙交酯-co-己内酯)(也记作：PLCL)通过静电纺丝法制得，所述中间层由聚(L-丙交酯-co-己内酯)和I型胶原通过静电纺丝对纺制得，所述粗糙层由I型胶原通过静电纺丝法和矿化胶原通过静电喷雾法复合而成。

本发明制得的引导组织再生膜具有三层复合结构，依次包括光滑层、中间层和粗糙层；其中，光滑层由粗细均匀的纳米纤维组成，孔径大小均匀1-10微米左右，与天然细胞外基质相近，最大程度模仿天然细胞环境，且电纺材料具有较高的孔隙率和较大的比表面积，且能够防止结缔组织的长入，同时能够保证氧气、营养物质和生物活性因子的扩散；粗糙层均匀分布有胶原纤维和大量矿化胶原颗粒，有利于细胞的黏附、增殖和分化；而中间层由PLCL和I型胶原组成，能够起到很好的衔接作用，使三层复合结构保持稳定不易分层，且随着胶原的降解，PLCL纤维空隙逐渐增大，能够为细胞的爬行提供空间。虽然GTR膜都一样，有足够大的孔隙细胞都能爬行通过，但修复过程中，要阻止致密侧牙龈上皮和牙龈结缔组织向根面生长，疏松层诱导具有牙周组织再生潜力的牙周膜细胞冠向移动并生长分化，实现牙周膜、牙槽骨、牙骨质再生，形成牙周新附着；本发明发现，本发明中间层设计的好处还在于，中间层含有I型胶原，可诱导牙周膜侧的细胞向光滑层(致密层)爬行，随着胶原的降解，能够使得牙周膜侧的细胞逐渐爬行通过。本发明中的所述中间层起到两方面的过渡作用，一方面成分过渡，单一成分过渡到两组分，可有效防止分层，一方面结构过渡，胶原降解可产生孔隙，可诱导牙周膜侧的细胞逐渐爬行通过。

本发明采用PLLA和PCL以特定比例和分子量结合的共聚物聚(L-丙交酯-co-己内酯)(PLCL)通过静电纺丝法制备的引导组织再生膜的光滑层，相比采用PLLA和PCL的共混溶液作为纺丝液通过静电纺丝法制备引导组织再生膜的致密层，在保证GTR膜具有合适的降解速率的同时，能够使得GTR膜整体具有更好的抗拉伸性能及抗缝合性能；而且，本发明采用聚(L-丙交酯-co-己内酯)，这种特定组成比例和分子量的共聚物通过静电纺丝法制备引导组织结构层，在生物相容性、组织整合性的基础上进一步可保证材料的力学性能、降解时间等。

根据一些优选的实施方式，所述聚(L-丙交酯-co-己内酯)静电纺丝液的配制为：将聚(L-丙交酯-co-己内酯)加入有机溶剂中搅拌溶解，得到聚(L-丙交酯-co-己内酯)静电纺丝液，所述聚(L-丙交酯-co-己内酯)静电纺丝液的浓度为8～12w/v％(例如8、9、10、11或12w/v％)优选为10w/v％，优选的是，所述有机溶剂为氯仿(MSDS)、二甲基甲酰胺(DMF)、四氢呋喃(THF)、二甲基亚砜(DMSO)、对甲苯磺酸(TsOH)、二氯甲烷(DCM)中的一种或多种，更优选的是，所述有机溶剂由二氯甲烷和二甲基甲酰胺按照体积比为70:30混合而成；在本发明中，所述聚(L-丙交酯-co-己内酯)(PLCL)指的是聚L-丙交酯(PLLA)与聚己内酯(PCL)的共聚物，本发明对所述PLCL的组成、分子量以及来源没有特别的限制，所述PLCL直接从市面上购买得到或者通过现有方法制备而成均可，例如，所述聚(L-丙交酯-co-己内酯)可以采用LA/CL＝70:30、分子量Mw＝150kDa的共聚物，其中LA/CL为摩尔比例；在本发明中，静电纺丝液浓度的选择有利于保证静电纺丝的进行，在合适的浓度范围内，静电纺丝的纤维直径随着浓度的增大而增大；本发明发现，只有当所述聚(L-丙交酯-co-己内酯)静电纺丝液的浓度为8～12w/v％优选为10w/v％时，才有利于聚(L-丙交酯-co-己内酯)的静电纺丝；特别说明的是，在本发明中，浓度的单位“w/v％”均表示的是单位“g/100mL”。

根据一些优选的实施方式，所述I型胶原静电纺丝液的配制为：将I型胶原加入有机溶剂中搅拌溶解，得到I型胶原静电纺丝液，所述I型胶原静电纺丝液的浓度为5～7w/v％(例如5、6或7w/v％)优选为6w/v％，优选的是，所述有机溶剂为六氟异丙醇(HFIP)、三氟乙酸、三氟乙醇中的一种或多种；在本发明中，静电纺丝液浓度的选择有利于保证静电纺丝的进行，在合适的浓度范围内，静电纺丝的纤维直径随着浓度的增大而增大；本发明发现，只有当所述I型胶原静电纺丝液的浓度为5～7w/v％时，特别是优选为6w/v％时，才有利于I型胶原的静电纺丝。

根据一些优选的实施方式，所述矿化胶原静电喷雾液的配制为：用甲醇溶液(例如体积百分含量为30～40％的甲醇水溶液)或吡啶溶液(例如体积百分含量为20～40％的吡啶水溶液)将矿化胶原粉配制成悬浊液，然后将所述悬浊液进行超声处理，得到矿化胶原静电喷雾液，所述矿化胶原静电喷雾液的浓度为3～4.5w/v％(例如3、3.5、4或4.5w/v％)优选为4w/v％；在本发明中，经过超声处理，可以使得矿化胶原粉在甲醇溶液中形成纳米级悬浮液即得到矿化胶原静电喷雾液，如此可以使得所述粗糙层的I型胶原纤维内均匀分布有大量的纳米矿化胶原颗粒，相比采用I型胶原和矿化胶纳米颗粒经冷冻干燥复合得到疏松层，更有利于细胞的黏附、增殖和分化；在本发明中，静电纺丝制得的I型胶原纤维为纳米级纤维，纳米纤维的直径小于细胞，可以模拟天然的细胞外基质的结构和生物功能；人的大多数组织、器官在形式和结构上与纳米纤维类似，这为纳米纤维用于组织和器官的修复提供了可能；加之静电纺纳米纤维还有大的比表面积、孔隙率等优良特性；在本发明中，所述纳米矿化胶原颗粒，不只分布在所述粗糙层的表面，还存在于内部，对纺过程中I型胶原与纳米矿化胶原颗粒二者始终处于混合状态；在本发明中，优选将浓度为3～4.5w/v％的所述悬浊液在频率为25～40kHz优选为30kHz的条件下进行超声处理1～2h，如此可以利于纳米级悬浮液的形成，有利于保证所述矿化胶原静电喷雾液中含有的矿化胶原颗粒为粒径不大于200nm的纳米级矿化胶原颗粒，从而有利于保证静电喷雾的均匀性。本发明对所述矿化胶原粉的来源没有特别的限制，采用现有方法制备的矿化胶原粉即可。

根据一些优选的实施方式，在所述聚(L-丙交酯-co-己内酯)静电纺丝液的配制中，还可以往有机溶剂中加入聚乳酸(PLA)、聚己内酯(PCL)、聚(乳酸-乙交酯)(PLGA)中的一种或多种；所述聚己内酯例如可以为分子量Mn＝80，000的PCL；和/或在所述I型胶原静电纺丝液的配制中，还可以往有机溶剂中加入明胶、壳聚糖、丝素蛋白、纳米纤维素中的一种或多种；在本发明中，所述明胶例如为明胶(Type A型)，所述壳聚糖例如为壳聚糖(DA＝86％，Mw＝200,000)。

根据一些优选的实施方式，在通过静电纺丝与静电喷雾相结合制备引导组织再生膜的过程中，将用于聚(L-丙交酯-co-己内酯)静电纺丝液静电纺丝的微型注射泵、用于矿化胶原静电喷雾液静电喷雾的微型注射泵设置在圆柱形旋转接收器的同一侧，将用于I型胶原静电纺丝液静电纺丝的微型注射泵设置在圆柱形旋转接收器的另一侧。

根据一些优选的实施方式，在步骤S2和/或步骤S3中，在所述聚(L-丙交酯-co-己内酯)静电纺丝液进行静电纺丝时，所述聚(L-丙交酯-co-己内酯)静电纺丝液的流速为0.5～4mL/h(例如0.5、1、2、3或4mL/h)，优选为1mL/h，静电纺丝的接收距离为12～25cm(例如12、15、18、20或25cm)，优选为18cm，高压直流电源的电压为15～20kV(例如15、17.5或19.5kV)，圆柱形旋转接收器的转速为110～130r/min(例如110、120或130r/min)；在步骤S3和/或步骤S4中，在所述I型胶原静电纺丝液进行静电纺丝时，所述I型胶原静电纺丝液的流速为0.5～4mL/h(例如0.5、1、2、3或4mL/h)，优选为2mL/h，静电纺丝的接收距离为12～20cm(例如12、15、18或20cm)，优选为15cm，高压直流电源的电压为15～20kV(例如15、17.5或19.5kV)，圆柱形旋转接收器的转速为110～130r/min(例如110、120或130r/min)；和/或在步骤S4中，在所述矿化胶原静电喷雾液进行静电喷雾时，所述矿化胶原静电喷雾液的流速为0.5～4mL/h(例如0.5、1、2、3或4mL/h)，优选为2mL/h，静电喷雾的接收距离为12～13cm(例如12、12.5或13cm)，高压直流电源的电压为8～10kV(例如8、9或10kV)，圆柱形旋转接收器的转速为145～160r/min(例如145、150、155或160r/min)优选为150r/min。本发明优选为通过对静电纺丝液浓度、静电喷雾液浓度、喷射速率、接收距离、高压直流电源的电压、圆柱形旋转接收器的转速、对纺时两侧溶剂极性等实验参数综合考虑后进行上述优化，如此有利于得到综合性能最佳的所述引导组织再生膜，有利于保证三层复合结构膜的稳定性不易分层，能够使得GTR膜整体具有好的抗拉伸性能及抗缝合性能；对于粗糙层而言，本发明通过克服了I型胶原静电纺丝和矿化胶原静电喷雾的合理参数设置上的难题，综合考虑配液比例、电压、接收距离、流速、接收器转速等，对纺时两侧溶剂极性等方面，才保证实现了I型胶原静电纺丝形成了合适的纤维直径和合适的纤维直径分布以及实现了矿化胶原静电喷雾形成了均匀分布的纳米矿化胶原颗粒。

根据一些优选的实施方式，在步骤S2中，进行静电纺丝的时间为35～50min(例如35、40、45或50min)，优选为40min；在步骤S3中，进行静电纺丝对纺的时间为15～25min(例如15、20或25min)，优选为20min；和/或在步骤S4中，进行静电纺丝的时间为50～70min(例如50、55、60、65或70min)，优选为60min，同时进行静电喷雾的时间为50～70min(例如50、55、60、65或70min)，优选为60min；在本发明中，优先为形成所述光滑层(致密层)的厚度为0.8～1.2mm，优选为1mm，形成所述中间层的厚度为0.4～0.6mm，优选为0.5mm，形成所述粗糙层(疏松层)的厚度为1.2～1.8mm，优选为1.5mm；在一些优选的实施例中，所述光滑层的厚度为1mm，所述中间层的厚度为0.5mm，所述粗糙层的厚度为1.5mm，这一厚度的匹配更有利于三层复合结构保持稳定不易分层。

根据一些优选的实施方式，所述步骤S5包括如下子步骤：

S51、配制浓度为2～30mmol/L(例如2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28或30mmol/L)的交联液，交联剂为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，优选的是，溶剂为乙醇水溶液，更优选为质量浓度为40～80％(例如40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％或80％)的乙醇水溶液；

S52、将所述三层复合结构膜置于交联液中于冰浴条件下进行交联10～60min(例如10、20、30、40、50或60min)；

S53、将步骤S52进行交联后的三层复合结构膜进行清洗，然后置于乙醇水溶液中浸泡；在一些优选的实施方式中，在步骤S53中：进行清洗时，先用流动的纯净水冲洗10～30s，重复3～5次，再用质量浓度为40～80％的乙醇水溶液洗涤3～5次，每次洗涤30～60s；和/或进行浸泡时，所用的乙醇水溶液的质量浓度为40～80％，浸泡时间为12～48h，以除去残留的交联剂；

S54、将经步骤S53处理后的三层复合结构膜进行真空干燥(例如在42℃下进行真空干燥)，得到引导组织再生膜。

根据一些优选的实施方式，所述矿化胶原粉通过如下步骤制备而成：

(a)将I型胶原溶于盐酸、硝酸或醋酸中的任何一种，配制成浓度为0.01～0.2g/mL的I型胶原酸液；

(b)向I型胶原酸液中滴加钙盐溶液，钙离子的加入量为每克I型胶原对应加入钙离子0.1～2mol；

(c)向步骤(b)所得溶液中滴加磷酸溶液，磷酸根离子的加入量与步骤(b)中钙离子加入量的摩尔比为Ca/P＝1/1～2/1；

(d)向步骤(c)所得溶液中滴加NaOH溶液，形成混合溶液，调节pH值为6～8；

(e)将步骤(d)所得的混合溶液静置4～12h后，以3000～6000r/min的速度离心出沉淀，将沉淀物在50～70℃下鼓风干燥24～72h，得到矿化胶原；

(f)将步骤(e)所得矿化胶原进行研磨，得到矿化胶原粉。

根据一些具体的实施方式，通过静电纺丝与静电喷雾相结合制备引导组织再生膜的方法包括如下步骤：

1、矿化胶原粉的制备

1.1、将I型胶原溶于盐酸、硝酸或醋酸中的任何一种，配制成I型胶原的酸溶液，配制成的I型胶原酸液中含有的I型胶原的浓度为0.01～0.2g/mL；

1.2、在所述I型胶原酸液中滴加钙盐溶液，其中钙离子的加入量为每克I型胶原对应加入钙离子0.1～2mol；

1.3、在步骤1.2所得溶液中滴加磷酸溶液，其中磷酸根离子的加入量与步骤1.2中钙离子加入量的摩尔比为Ca/P＝1/1～2/1；

1.4、在步骤1.3所得溶液中滴加NaOH溶液，形成混合溶液，调节pH值为6～8；

1.5、将步骤1.4所得的混合溶液静置4～12小时后，以3000～6000r/min的速度离心出沉淀后在50-70℃鼓风干燥24～72小时，得到矿化胶原颗粒；

1.6、将步骤1.5所得的矿化胶原颗粒放入坩埚中进行研磨，直至无明显颗粒状，得到矿化胶原粉。

2、原料的配制

2.1、PLCL静电纺丝液的制备

称取一定质量的聚(L-丙交酯-co-己内酯)(LA/CL＝70:30，Mw＝150kDa)，溶解于二氯甲烷(DCM)/二甲基甲酰胺(DMF)(体积比70:30)中，搅拌溶解过夜，形成10w/v％的澄清溶液，即得PLCL静电纺丝液。

2.2、Ⅰ型胶原静电纺丝液的制备

以六氟异丙醇(HFIP)为溶剂，称取一定质量Ⅰ型胶原加入其中搅拌溶解过夜，制得6w/v％的Ⅰ型胶原静电纺丝液。

2.3、纳米矿化胶原静电喷雾液的制备

称取一定质量的矿化胶原粉加入到甲醇溶液中，制得4w/v％的悬浊液，在频率为25～40kHz的条件下超声处理该悬浊液1h，在溶剂中形成纳米级悬浮液，即得矿化胶原静电喷雾液。

3、具有复合结构的引导组织再生膜的制备

通过调节纺丝室的加湿器和抽湿器控制纺丝室的湿度维持在40-50％，调节空调维持纺丝室内温度在25℃左右。将三个微型注射泵分别置于圆柱形旋转接收器的两侧，一侧为PLCL静电纺丝液和矿化胶原静电喷雾液，另一侧为Ⅰ型胶原静电纺丝液，同时将圆柱形旋转接收器和高压电源与地线相连。

3.1、光滑层的制备

将步骤2.1配制好的PLCL静电纺丝液装入10mL的注射器中，该注射器连接一个21#不锈钢钝头针，固定在微型注射泵上并设置参数，注射器内径为14.90mm，流速设为1mL/h，将连接高压直流电源的夹头与注射器的针头相连。调整注射器的针头对准包覆附有铝箔的圆柱形旋转接收器中央，接收距离为12～25cm(优选18cm)，调节高压直流电源的电压为19.5kV、17.5kV或15kV，圆柱形旋转接收器转速120r/min静电纺丝时间持续40min，得到GTR膜的光滑层。

3.2、中间层的制备

将盛有Ⅰ型胶原静电纺丝液的10mL的注射器固定在另一个微型注射泵上，该注射器连接一个21#不锈钢钝头针，固定在微型注射泵上并设置参数，注射器内径为14.90mm，流速设为2mL/h，将连接高压直流电源的夹头与注射器的针头相连。调整注射器的针头对准包覆有铝箔的圆柱形旋转接收器中央，接收距离为15cm。

待光滑层连续喷涂40min后，开启Ⅰ型胶原静电纺丝液侧的电压及注射泵与PLCL静电纺丝液侧对纺(即Ⅰ型胶原静电纺丝液与PLCL静电纺丝液随着圆柱形旋转接收器的旋转在相对的两侧同时进行静电纺丝)20min，制得中间层。

3.3、粗糙层的制备

将盛有矿化胶原静电喷雾液的注射器固定在微型注射泵上，注射器的内径均为14.9mm，均连接一个21#不锈钢钝头针，将连接高压直流电源的夹头与注射器的针头相连。设置矿化胶原静电喷雾液侧的流速也为2mL/h，电压9kV，接收距离12～13cm，调整圆柱形旋转接收器转速150r/min。

将PLCL侧的注射泵及电压关停，开启盛有矿化胶原静电喷雾液的注射泵及电压开关，与Ⅰ型胶原静电纺丝液对纺(即随着圆柱形旋转接收器的旋转，Ⅰ型胶原静电纺丝液在圆柱形旋转接收器的一侧进行静电纺丝的同时，在圆柱形旋转接收器的另一侧，矿化胶原静电喷雾液进行静电喷雾)1h，得到三层复合结构膜。

3.4、干燥

待步骤3.3结束后，沿着轴心方向划开三层复合结构膜，置于真空干燥箱干燥，例如在35℃的真空干燥箱干12h。

3.5、交联

a、以1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)作为交联剂，质量浓度为40～80％的乙醇溶液作为溶剂来配制2mM-30mM的交联液，搅拌至完全溶解后放到冰浴预冷；

b、将经步骤3.4干燥的三层复合结构膜置于交联液中，在冰浴条件下，交联10min-60min；

c、将步骤b获得的引导组织再生膜从交联液中取出，用流动的纯净水冲洗10s，重复三次，用40％-80％的乙醇洗涤三次，每次洗涤30s，然后在40％-80％的乙醇中浸泡12-48h，以除去残留的交联剂；在本发明中，40％-80％的乙醇指的是质量浓度(质量百分含量)为40％-80％的乙醇水溶液；

d、将步骤c获得的引导组织再生膜进行真空干燥，获得静电纺丝法与静电喷雾相结合制备的所述引导组织再生膜。

本发明在第三方面提供了由本发明在第二方面所述的方法制得的引导组织再生膜。

下文将通过举例的方式对本发明进行进一步的说明，但是本发明的保护范围不限于这些实施例。

实施例1

1、矿化胶原粉的制备

1.1、将I型胶原溶于盐酸中，配制成的I型胶原酸液中含有的I型胶原的浓度为0.1g/mL；

1.2、在所述I型胶原酸液中滴加钙盐溶液，其中钙离子的加入量为每克I型胶原对应加入钙离子1mol；

1.3、在步骤1.2所得溶液中滴加磷酸溶液，其中磷酸根离子的加入量与步骤1.2中钙离子加入量的摩尔比为Ca/P＝1.5/1；

1.4、在步骤1.3所得溶液中滴加NaOH溶液，形成混合溶液，调节pH值为6.5；

1.5、将步骤1.4所得的混合溶液静置8小时后，以4000r/min的速度离心出沉淀后在60℃鼓风干燥60小时，得到矿化胶原颗粒；

1.6、将步骤1.5所得的矿化胶原颗粒放入坩埚中进行研磨，直至无明显颗粒状，得到矿化胶原粉。

2、原料的配制

2.1、PLCL静电纺丝液的制备

称取聚(L-丙交酯-co-己内酯)(LA/CL＝70:30，Mw＝150kDa)，溶解于二氯甲烷(DCM)/二甲基甲酰胺(DMF)(体积比70:30)中，搅拌溶解过夜，形成10w/v％的澄清溶液，即得PLCL静电纺丝液。

2.2、Ⅰ型胶原静电纺丝液的制备

以六氟异丙醇(HFIP)为溶剂，称取Ⅰ型胶原加入其中搅拌溶解过夜，制得6w/v％的Ⅰ型胶原静电纺丝液。

2.3、纳米矿化胶原静电喷雾液的制备

称取矿化胶原粉加入到甲醇溶液(体积百分含量为35％的甲醇水溶液)中，制得4w/v％的悬浊液，在35kHz频率下超声处理该悬浊液1h，在溶剂中形成纳米级悬浮液，即得矿化胶原静电喷雾液。

3、具有复合结构的引导组织再生膜的制备

通过调节纺丝室的加湿器和抽湿器控制纺丝室的湿度维持在45％，调节空调维持纺丝室内温度在25℃左右。将三个微型注射泵分别置于圆柱形旋转接收器的两侧，一侧为PLCL静电纺丝液和矿化胶原静电喷雾液，另一侧为Ⅰ型胶原静电纺丝液，同时将圆柱形旋转接收器和高压电源与地线相连。

3.1、光滑层的制备

将步骤2.1配制好的PLCL静电纺丝液装入10mL的注射器中，该注射器连接一个21#不锈钢钝头针，固定在微型注射泵上并设置参数，注射器内径为14.90mm，流速设为1mL/h，将连接高压直流电源的夹头与注射器的针头相连。调整注射器的针头对准包覆附有铝箔的圆柱形旋转接收器中央，接收距离为18cm，调节高压直流电源的电压为17.5kV，接收器转速120r/min静电纺丝时间持续40min，得到厚度为1mm的光滑层。

3.2、中间层的制备

将盛有Ⅰ型胶原静电纺丝液的10mL的注射器固定在微型注射泵上，该注射器连接一个21#不锈钢钝头针，固定在微型注射泵上并设置参数，注射器内径为14.90mm，流速设为2mL/h，将连接高压直流电源的夹头与注射器的针头相连。调整注射器的针头对准包覆有铝箔的圆柱形旋转接收器中央，接收距离为15cm，调节高压直流电源的电压为17.5kV，接收器转速120r/min。

待光滑层连续喷涂40min后，开启Ⅰ型胶原静电纺丝液侧的电压及注射泵与PLCL静电纺丝液侧对纺(即Ⅰ型胶原静电纺丝液与PLCL静电纺丝液随着圆柱形旋转接收器的旋转在相对的两侧同时进行静电纺丝)20min，制得厚度为0.5mm的中间层。

3.3、粗糙层的制备

将盛有矿化胶原静电喷雾液的注射器固定在微型注射泵上，注射器的内径均为14.9mm，均连接一个21#不锈钢钝头针，将连接高压直流电源的夹头与注射器的针头相连。设置矿化胶原静电喷雾液侧的流速也为2mL/h，电压9kV，接收距离12cm，调整圆柱形旋转接收器转速150r/min。

将PLCL侧的注射泵及电压关停，开启盛有矿化胶原静电喷雾液的注射泵及电压开关，与Ⅰ型胶原静电纺丝液对纺(即随着圆柱形旋转接收器的旋转，Ⅰ型胶原静电纺丝液在圆柱形旋转接收器的一侧进行静电纺丝的同时，在圆柱形旋转接收器的另一侧，矿化胶原静电喷雾液进行静电喷雾)1h，得到厚度为1.5mm的粗糙层，形成由光滑层、中间层和粗糙层组成的三层复合结构膜。

3.4、干燥

待步骤3.3结束后，沿着轴心方向划开三层复合结构膜，置于真空干燥箱干燥以去除残余溶剂。

3.5、交联

a、以1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)作为交联剂，质量浓度为60％的乙醇溶液作为溶剂来配制15mM的交联液，搅拌至完全溶解后放到冰浴预冷；

b、将经步骤3.4干燥的三层复合结构膜置于交联液中，在冰浴条件下，交联40min；

c、将步骤b获得的引导组织再生膜从交联液中取出，用流动的纯净水冲洗10s，重复三次，用质量浓度为60％的乙醇洗涤三次，每次洗涤30s，然后在质量浓度为60％的乙醇中浸泡24h，以除去残留的交联剂；

d、将步骤c获得的引导组织再生膜进行真空干燥以去除残余溶剂，获得静电纺丝法与静电喷雾相结合制备的所述引导组织再生膜。

本实施例制得的引导组织再生膜包括的粗糙层的扫描电镜图和光滑层的扫描电镜图分别如图1和图2所示；从图1中可以看出，对于粗糙层，粗糙层内均匀分布大量的纳米矿化胶原颗粒。

实施例2

实施例2与实施例1基本相同，不同之处在于：

在步骤2.2的Ⅰ型胶原静电纺丝液的制备中：

以三氟乙酸为溶剂，称取Ⅰ型胶原加入其中搅拌溶解过夜，制得8w/v％的Ⅰ型胶原静电纺丝液。

在步骤2.3的纳米矿化胶原静电喷雾液的制备中：

称取矿化胶原粉加入到甲醇溶液(体积百分含量为35％的甲醇水溶液)中，制得6w/v％的悬浊液，在20kHz频率下超声处理该悬浊液1h，即得矿化胶原静电喷雾液。

在步骤3.3的粗糙层的制备中：

将盛有矿化胶原静电喷雾液的注射器固定在微型注射泵上，注射器的内径均为14.9mm，均连接一个21#不锈钢钝头针，将连接高压直流电源的夹头与注射器的针头相连。设置矿化胶原静电喷雾液侧的流速也为2mL/h，电压17.5kV，接收距离15cm，圆柱形旋转接收器转速120r/min。

将PLCL侧的注射泵及电压关停，开启盛有矿化胶原静电喷雾液的注射泵及电压开关，与Ⅰ型胶原静电纺丝液对纺(即随着圆柱形旋转接收器的旋转，Ⅰ型胶原静电纺丝液在圆柱形旋转接收器的一侧进行静电纺丝的同时，在圆柱形旋转接收器的另一侧，矿化胶原静电喷雾液进行静电喷雾)1h，得到由光滑层、中间层和粗糙层组成的三层复合结构膜。

对比例1

对比例1与实施例1基本相同，不同之处在于：

在步骤3具有复合结构的引导组织再生膜的制备过程中，不包括中间层的制备，直接在光滑层的表面制备粗糙层。

对比例2

一种双层引导组织再生膜的制备方法，包括如下步骤：

S1、疏松层的制备

将I型胶原溶于纯化水中，搅拌30h，配制成I型胶原水溶液，其中I型胶原的质量浓度为0.15％；

在I型胶原水溶液中加入矿化胶原粉，搅拌6h，得到混合液，所述混合液中含有的I型胶原与矿化胶原粉的质量比为1:1；所述矿化胶原粉采用与实施例1中相同的方法制备而成；

将所述混合液放入聚四氟乙烯板中，流延均匀后放入冷冻干燥机中进行冷冻干燥，得到厚度为0.2mm的疏松层，将其修剪后固定在用铝箔包覆的圆柱形旋转接收器上。

S2、致密层的制备

将聚己内酯溶于三氟乙醇中，搅拌过夜，得到质量浓度为10％的溶液A；

将左旋聚乳酸溶于三氟乙醇中，搅拌过夜，得到质量浓度为10％的溶液B；

将溶液A与溶液B混合，搅拌6h，得到质量浓度为10％的溶液C，在所述溶液C中，聚己内酯与左旋聚乳酸的质量比为1:1。

在室温用溶液C进行静电纺丝，以固定有步骤S1的疏松层的圆柱形旋转接收器作为接收装置，转速为200r/min，纺丝液的流速为10mL/h，调节高压直流电源的电压为12kV，接收距离为15cm，纺丝时间为2h，在疏松层的基础上得到厚度为0.25mm的致密层，即得到双层复合结构膜；

S3、采用与实施例1中步骤3.4与步骤3.5中相同的方法对双层复合结构膜进行后处理(干燥和交联)，制得双层引导组织再生膜。

将实施例1～2以及对比例1～2制得的引导组织再生膜进行性能检测。

1、拉伸强度测试：拉伸强度测试依据

ASTM-D882-02(中文)塑料薄板材抗拉伸性能的标准方法，将样品薄膜修剪成150mm×20mm的矩形试样，将试样置于试验机上进行拉伸强度测试，实验条件为：夹具间距为100mm，夹具分离速度：100mm/min，初始应变速度是50mm/min。将实施例以及对比例中的样品进行Co60灭菌，剂量为15KGy，在灭菌后分别进行拉伸强度测试，测试条件如表1所示；测得的实验结果如表2所示。

表1：拉伸强度测试条件。

H<sub>厚度</sub>/mm	B<sub>宽度</sub>/mm	A<sub>0面积</sub>/mm<sup>2</sup>	L<sub>0夹具距</sub>/mm	L<sub>原长</sub>/mm
					0.44	20	1.60	100.00	100.00

表2：实施例1～2以及对比例1～2的拉伸强度。

实施例	拉伸强度/N	断裂伸长率/％
			实施例1	17.08±1.81	21.03％
实施例2	13.56±1.35	11.85％
			对比例1	10.46±0.96	8.56％
对比例2	5.63±0.83	4.67％

2、抗缝线拉张强度测试：抗缝线拉张强度测试条件为：夹具间距100mm，夹具分离速度：100mm/min，初始应变速度：0.5mm/min。使用3-0#的不可吸收性缝合线，样品正中间穿双股线，单股线长75mm。

将实施例以及对比例中的样品进行Co60灭菌，剂量为15KGy，在灭菌后分别进行抗缝线拉张强度测试，测得的实验结果如表3所示。

表3：实施例1～2以及对比例1～2的抗缝线拉张强度。

本发明未详细说明部分为本领域技术人员公知技术。

最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

Claims (20)

1.一种引导组织再生膜，其特征在于：

所述引导组织再生膜依次包括光滑层、中间层和粗糙层；

所述光滑层由聚（L-丙交酯-co-己内酯）通过静电纺丝法制得，所述中间层由聚（L-丙交酯-co-己内酯）和I型胶原通过静电纺丝对纺制得，所述粗糙层由I型胶原通过静电纺丝法和矿化胶原通过静电喷雾法复合而成。

2.一种通过静电纺丝与静电喷雾相结合制备引导组织再生膜的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

S1、配制聚（L-丙交酯-co-己内酯）静电纺丝液、I型胶原静电纺丝液以及矿化胶原静电喷雾液；

S2、将所述聚（L-丙交酯-co-己内酯）静电纺丝液进行静电纺丝，制得光滑层；

S3：将所述聚（L-丙交酯-co-己内酯）静电纺丝液与所述I型胶原静电纺丝液进行静电纺丝对纺，以在步骤S2制得的光滑层的表面上制得中间层；

S4、将所述I型胶原静电纺丝液进行静电纺丝，并同时将所述矿化胶原静电喷雾液进行静电喷雾，以在步骤S3制得的中间层的表面上制得粗糙层，然后经过干燥，得到由光滑层、中间层和粗糙层组成的三层复合结构膜；

S5、将步骤S4得到的三层复合结构膜进行交联，制得引导组织再生膜。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：

所述聚（L-丙交酯-co-己内酯）静电纺丝液的配制为：将聚（L-丙交酯-co-己内酯）加入有机溶剂中搅拌溶解，得到聚（L-丙交酯-co-己内酯）静电纺丝液，所述聚（L-丙交酯-co-己内酯）静电纺丝液的浓度为8~12w/v%；

所述I型胶原静电纺丝液的配制为：将I型胶原加入有机溶剂中搅拌溶解，得到I型胶原静电纺丝液，所述I型胶原静电纺丝液的浓度为5~7w/v%；和/或

所述矿化胶原静电喷雾液的配制为：用甲醇溶液或吡啶溶液将矿化胶原粉配制成悬浊液，然后将所述悬浊液进行超声处理，得到矿化胶原静电喷雾液，所述矿化胶原静电喷雾液的浓度为3~4.5w/v%。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：

在所述聚（L-丙交酯-co-己内酯）静电纺丝液的配制中，所述有机溶剂为氯仿、二甲基甲酰胺、四氢呋喃、二甲基亚砜、对甲苯磺酸、二氯甲烷中的一种或多种。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：

在所述聚（L-丙交酯-co-己内酯）静电纺丝液的配制中，所述有机溶剂由二氯甲烷和二甲基甲酰胺按照体积比为70:30混合而成。

6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：

在所述I型胶原静电纺丝液的配制中，所述有机溶剂为六氟异丙醇、三氟乙酸、三氟乙醇中的一种或多种。

7.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：

在所述聚（L-丙交酯-co-己内酯）静电纺丝液的配制中，往有机溶剂中加入聚乳酸、聚己内酯、聚（乳酸-乙交酯）中的一种或多种；和/或

在所述I型胶原静电纺丝液的配制中，往有机溶剂中加入明胶、壳聚糖、丝素蛋白、纳米纤维素中的一种或多种。

8.根据权利要求2至7中任一项所述的方法，其特征在于：

在通过静电纺丝与静电喷雾相结合制备引导组织再生膜的过程中，将用于聚（L-丙交酯-co-己内酯）静电纺丝液静电纺丝的微型注射泵、用于矿化胶原静电喷雾液静电喷雾的微型注射泵设置在圆柱形旋转接收器的同一侧，将用于I型胶原静电纺丝液静电纺丝的微型注射泵设置在圆柱形旋转接收器的另一侧。

9.根据权利要求2至7中任一项所述的方法，其特征在于：

在步骤S2和/或步骤S3中，在所述聚（L-丙交酯-co-己内酯）静电纺丝液进行静电纺丝时，所述聚（L-丙交酯-co-己内酯）静电纺丝液的流速为0.5~4mL/h，静电纺丝的接收距离为12~25cm，高压直流电源的电压为15~20kV，圆柱形旋转接收器的转速为110~130r/min；

在步骤S3和/或步骤S4中，在所述I型胶原静电纺丝液进行静电纺丝时，所述I型胶原静电纺丝液的流速为0.5~4mL/h，静电纺丝的接收距离为12~20cm，高压直流电源的电压为15~20kV，圆柱形旋转接收器的转速为110~130r/min；和/或

在步骤S4中，在所述矿化胶原静电喷雾液进行静电喷雾时，所述矿化胶原静电喷雾液的流速为0.5~4mL/h，静电喷雾的接收距离为12~13cm，高压直流电源的电压为8~10kV，圆柱形旋转接收器的转速为145~160r/min。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：

在步骤S2和/或步骤S3中，在所述聚（L-丙交酯-co-己内酯）静电纺丝液进行静电纺丝时，所述聚（L-丙交酯-co-己内酯）静电纺丝液的流速为1mL/h。

11.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：

在步骤S2和/或步骤S3中，在所述聚（L-丙交酯-co-己内酯）静电纺丝液进行静电纺丝时，静电纺丝的接收距离为18cm。

12.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：

在步骤S3和/或步骤S4中，在所述I型胶原静电纺丝液进行静电纺丝时，所述I型胶原静电纺丝液的流速为2mL/h。

13.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：

在步骤S3和/或步骤S4中，在所述I型胶原静电纺丝液进行静电纺丝时，静电纺丝的接收距离为15cm。

14.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：

在步骤S4中，在所述矿化胶原静电喷雾液进行静电喷雾时，所述矿化胶原静电喷雾液的流速为2mL/h。

15.根据权利要求2至7中任一项所述的方法，其特征在于：

在步骤S2中，进行静电纺丝的时间为35~50min；

在步骤S3中，进行静电纺丝对纺的时间为15~25min；和/或

在步骤S4中，进行静电纺丝的时间为50~70min，同时进行静电喷雾的时间为50~70min。

16.根据权利要求2至7中任一项所述的方法，其特征在于，步骤S5包括如下子步骤：

S51、配制浓度为2～30mmol/L的交联液，交联剂为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐；

S52、将所述三层复合结构膜置于交联液中于冰浴条件下进行交联10~60min；

S53、将步骤S52进行交联后的三层复合结构膜进行清洗，然后置于乙醇水溶液中浸泡；

S54、将经步骤S53处理后的三层复合结构膜进行真空干燥，得到引导组织再生膜。

17.根据权利要求16所述的方法，其特征在于：

在配制浓度为2～30mmol/L的交联液时，溶剂为乙醇水溶液。

18.根据权利要求17所述的方法，其特征在于：

在配制浓度为2～30mmol/L的交联液时，溶剂为质量浓度为40～80％的乙醇水溶液。

19.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述矿化胶原粉通过如下步骤制备而成：

（a）将I型胶原溶于盐酸、硝酸或醋酸中的任何一种，配制成浓度为0.01～0.2g/mL的I型胶原酸液；

（b）向I型胶原酸液中滴加钙盐溶液，钙离子的加入量为每克I型胶原对应加入钙离子0.1～2mol；

（c）向步骤（b）所得溶液中滴加磷酸溶液，磷酸根离子的加入量与步骤（b）中钙离子加入量的摩尔比为Ca/P＝1/1～2/1；

（d）向步骤（c）所得溶液中滴加NaOH溶液，形成混合溶液，调节pH值为6～8；

（e）将步骤（d）所得的混合溶液静置4～12h后，以3000～6000r/min的速度离心出沉淀，将沉淀物在50～70℃下鼓风干燥24～72h，得到矿化胶原；

（f）将步骤（e）所得矿化胶原进行研磨，得到矿化胶原粉。

20.由权利要求2至19中任一项所述的方法制得的引导组织再生膜。

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