CN117626527A - 基于静电纺丝技术的微纳米纤维复合生物膜及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于静电纺丝技术的微纳米纤维复合生物膜，通过静电纺丝工艺由分布均匀的微米级纤维与分布均匀的纳米级纤维交替堆叠复合形成，微纳米纤维复合生物膜为微米级纤维形成的微米纤维层与纳米级纤维形成的纳米纤维层交替堆叠形成的多孔膜结构，该多孔膜结构厚度为50‑100μm，平均孔径为2.4‑3.6μm，微米级纤维直径范围为1‑3μm；纳米级纤维直径范围为50‑1000nm，微纳米纤维膜断裂伸长率≥1.2％，拉伸强度为5.1‑7MPa，杨氏模量为1313.2‑2442.6MPa。通过随时调控A聚合物的a浓度以及b浓度，可随时调控微纳米纤维复合生物膜中微米级纤维和纳米级纤维的分布，从而调控微纳米纤维膜的比表面积，以获取比表面积可调控、力学性能增强，且技术简单灵活，纺丝过程容易控制。

Description

基于静电纺丝技术的微纳米纤维复合生物膜及其制备方法和 应用

技术领域

本发明涉及生物医用材料技术领域，尤其涉及一种基于静电纺丝技术的微纳米纤维复合生物膜及其制备方法和应用。

背景技术

静电纺丝技术是指聚合物溶液或熔体被喷射拉伸成纤维的过程。它是一种制备聚合物纳米纤维的新方法，可制备出直径为纳米级的超细纤维，最小直径可至1nm。较传统方法制备的聚合物纤维，电纺法制备聚合物纳米纤维具有设备简单、操作容易、高效等特点，且用电纺法制备的超细纤维膜比表面积大、孔隙率高、质轻，在组织工程、药物和催化剂载体、伤口敷料、过滤、传感器、模板、防护织物、纳米电子元件等众多领域具有潜在的应用价值。

在过去的几十年里，科学和技术的进步催生了很多创新的单一或复合型组织支架用作药物载体、填充材料、引导材料等，以实现损伤组织的快速愈合和再生修复。微纳米纤维膜凭借其高比表面积已被广泛应用于药物载体、生物支架、组织工程与化工领域。在组织修复应用中，微/纳米纤维所制备的纤维支架，可以模拟人体细胞外基质结构，提供细胞附着、增殖、分化的微生长环境，对受损组织或器官的修复、再生起着重要作用。静电纺丝制备的微纳米纤维，在收集过程中会形成相互堆叠的网格状结构，这种结构与天然细胞外基质等的生物结构非常相似，在纤维尺度、形态和结构、性能方面可以很好地模拟天然细胞外基质的固有蛋白质纤维，其比表面积和孔隙率可直接影响细胞黏附和增殖，已有大量文章证明微纳米纤维膜的平均孔径越小，则比表面积越大，并且微纳米纤维能够明显促进细胞增殖和分化、细胞外基质沉积和重塑，以及新组织再生。所以微纳米纤维的研究被广泛的应用于生物支架。

用于伤口敷料、填充材料以及生物支架方向的微纳米纤维膜，其功能的主要影响因素包括比表面积、孔径、孔隙率以及力学性能等方面。目前关于静电纺丝技术制备用于医疗生物用品的微纳米纤维膜较多，包括如下技术：

CN114713038A公开了一种微纳米纤维膜，所述微纳米纤维膜主要由聚合物纳米纤维组成，所述聚合物纳米纤维中的聚合物包括聚偏氟乙烯和聚苯乙烯，所述微纳米纤维膜中包括纳米级纤维和微米级纤维。该申请所述的微纳米纤维膜具有较优的疏水亲油特性，可以有效地对含油的水进行除油，还可以对油水混合物中的固体颗粒物进行过滤去除。另，本申请还公开了一种所述微纳米纤维膜的制备方法及应用。

CN116617438A公开了一种伤口敷料用微纳米纤维膜。本发明是由微纳米纤维无规堆砌形成的多孔膜结构，膜厚度可调，微纳米纤维由壳聚糖和聚氧化乙烯组成，壳聚糖和聚氧化乙烯在纤维内外的分布不同，外层壳聚糖含量大于内层，且外层壳聚糖含量≥70％，微纳米纤维膜中纤维的平均直径为100-1500nm。本发明具有较好的力学性能、热稳定性及抗氧化活性等；纤维外层主要为壳聚糖，在不添加其他抗菌剂的条件下，对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑菌率≥95％；不使用化学交联剂交联，具有较好的结构稳定性，并且无生物毒性，不会降低纤维膜的生物相容性；在水中的稳定性≥10天，不会粘连伤口，不会对伤口造成二次伤害，可用于伤口敷料。

CN113737393A公开了一种静电纺丝纳米纤维膜及其制备方法，用于解决目前静电纺丝复合纳米纤维材料力学强度差、使用寿命短以及纤维的均匀性、取向的一致性和纤网的稳定性差的问题。该静电纺丝纳米纤维膜是由纺丝溶液通过高压静电纺丝制备，所述纺丝溶液是将质量比为75-85:10-20:5的再生丝素蛋白、聚乙烯醇和聚乳酸溶解在体积比为7:3的三氟乙酸和二氯甲烷的混合溶剂中组成的共混溶液。本发明通过再生丝素蛋白、聚乙烯醇和聚乳酸共混纺丝，并建立合理的再生丝素蛋白、聚乙烯醇和聚乳酸的质量比参数，从而在提高丝素蛋白可纺性的同时，制备出力学性能好的静电纺丝再生丝素蛋白/聚乙烯醇/聚乳酸复合纳米纤维膜。

由上述专利技术可知，目前的纳米纤维膜以及微纳米纤维膜的技术研究重点主要是在纤维材料、用量等方面的选择，通过不同材料的功能结合用量在过滤以及医用材料方面获得相应的效果。但实际上，微纳米纤维膜在促进细胞增殖和分化以及促进组织修复、再生功能上，除了纺丝液的组分配比外，膜本身的结构也是重要的一个影响因素。

无论纳米纤维膜还是微纳米纤维膜，要想在伤口敷料、填充材料以及生物支架等应用方向上最大程度地促进细胞增殖分化、细胞外基质沉积和重塑、新生组织再生等，并在微纳米纤维膜的结构上实现其比表面积、孔径、孔隙率、力学性能有效可控，在目前的微纳米纤维膜制备领域较困难。因为静电纺丝过程受到多种参数的影响，大致可分为纺丝溶液参数、过程参数和环境参数，其中，纺丝溶液参数主要包括聚合物原料的性质和纺丝溶液的浓度、电导性、分子量和溶剂；过程参数主要包括外加电压(正负极电压)、流速、接受距离；环境参数主要包括温度和湿度。研究表明，上述参数不仅会明显影响纤维的外貌形态，而且参数之间会相互影响，需要建立合理的配备条件以获得理想的膜结构。利用两种以及两种以上聚合物原料溶液或者熔体进行静电纺丝制备复合纳米纤维过程中容易发生不同的聚合物原料的交联点断裂，从而造成复合纳米纤维普遍存在如下缺点：一是复合纳米纤维材料的力学强度低、使用寿命短；二是纺丝成型的纤维的均匀性、取向的一致性和纤网的稳定性差。

可见，如何在现有微纳米纤维膜的基础上，通过控制微纳米纤维膜的结构，在提高力学性能的同时还能够兼顾微纳米纤维膜的小孔径、高比表面积和孔隙率，实现在细胞增殖和分化以及受损组织或器官的修复、再生的过程中起到辅助促进作用的目的，成为了生物支架医疗领域技术人员亟待解决的一个难题。

发明内容

针对现有技术存在的不足，本发明所要解决的技术问题是，提供一种从结构上进行控制，实现比表面积、孔径、孔隙率可精确调控，明显提高力学性能，能够有效提高细胞增殖和分化以及受损组织或器官的修复、再生效果的基于静电纺丝技术的微纳米纤维复合生物膜及其制备方法和应用。

为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案是：一种基于静电纺丝技术的微纳米纤维复合生物膜，所述微纳米纤维复合生物膜通过静电纺丝工艺由分布均匀的微米级纤维与分布均匀的纳米级纤维交替堆叠复合形成，所述微纳米纤维复合生物膜为微米级纤维形成的微米纤维层与纳米级纤维形成的纳米纤维层交替堆叠形成的多孔膜结构，该多孔膜结构厚度为50-100μm，平均孔径为2.4-3.6μm，微米级纤维直径范围为1-3μm；纳米级纤维直径范围为50-1000nm，微纳米纤维膜断裂伸长率≥1.2％，拉伸强度为5.1-7MPa，杨氏模量为1313.2-2442.6MPa。

上述的基于静电纺丝技术的微纳米纤维复合生物膜，所述微纳米纤维复合生物膜是由A聚合物制备的a浓度的纺丝前驱体以及由该聚合物制备的b浓度的纺丝前驱体在静电纺丝装置中同步纺丝制得，所述纳米级纤维的原料为A聚合物制备的a浓度的纺丝液，微米级纤维的原料为A聚合物制备的b浓度的纺丝液，所述a浓度纺丝液的质量百分比为2％-10％，b浓度纺丝液的质量百分比为20％。

上述的基于静电纺丝技术的微纳米纤维复合生物膜，所述A聚合物为聚己内酯、聚乙烯醇、聚丙烯吡咯烷酮、聚乙交酯-丙交酯、聚乳酸、聚丙交酯-乙交酯中的任意一种。

上述的基于静电纺丝技术的微纳米纤维复合生物膜，所述静电纺丝装置包括一双供电高压静电发生器及接收滚筒，在接收滚筒的两侧分别对称设置有用于制备微米纤维层及纳米纤维层的两个纺丝喷头，所述高压静电发生器的正负极分别与两个纺丝喷头相连。

上述的基于静电纺丝技术的微纳米纤维复合生物膜，所述双供电高压静电发生器的纺丝电压为-12kV-﹢12kV，接收滚筒两侧的接收距离分别为16cm，a、b浓度纺丝液的挤出速度为0.8mL/h，纺丝温度为20℃，相对湿度为40％。

上述的基于静电纺丝技术的微纳米纤维复合生物膜，所述A聚合物制备的a浓度的纺丝液的质量百分比为6％。

一种基于静电纺丝技术的微纳米纤维复合生物膜的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)、配制由A聚合物制备的质量百分比为2％-10％的a浓度纺丝液，以及质量百分比为20％的b浓度纺丝液，备用；

(2)、将上述配制好的纺丝液分别连接静电纺设备的两个纺丝喷头，双供电高压静电发生器的正负极分别与两个纺丝喷头相连。

(3)、开启双供电高压静电发生器分别为两个纺丝喷头提供相反的高压静电，在一定的纺丝电压、接收距离、纺丝液挤出速度条件下进行同步纺丝；

(4)、利用接收滚筒收集两个纺丝喷头分别在接收滚筒两侧形成的微米、纳米纤维；

(5)、微米纤维与纳米级纤维分别形成微米纤维网与纳米纤维网，并连续重复交替堆叠；

(6)、根据厚度要求，获得微米级纤维和纳米级纤维连续、分布均匀、无明显串珠的微纳米纤维复合生物膜。

上述的基于静电纺丝技术的微纳米纤维复合生物膜的制备方法，所述步骤(3)中，在纺丝电压为-12kV-﹢12kV，接收距离为16cm，纺丝液挤出速度为0.8mL/h，纺丝温度为20℃，相对湿度为40％。

上述的基于静电纺丝技术的微纳米纤维复合生物膜的制备方法，所述步骤(4)中，接收滚筒转速为300rpm。

基于静电纺丝技术的微纳米纤维复合生物膜在制备组织受损伤口的伤口敷料、肌腱补片、疝修补片材料中的应用。

本发明基于静电纺丝技术的微纳米纤维复合生物膜及其制备方法和应用的优点是：将由A聚合物制备的a浓度的纺丝前驱体以及由该聚合物制备的b浓度的纺丝前驱体在改进的静电纺丝装置中制成的微纳米纤维膜制备而成。其中，通过随时调控A聚合物的a浓度以及b浓度，可随时调控微纳米纤维膜中微米级纤维和纳米级纤维的分布，从而调控微纳米纤维膜的比表面积，以获取比表面积可调控、力学性能增强，且技术简单灵活，纺丝过程容易控制的微纳米纤维膜。本发明特殊结构的微纳米纤维复合生物膜，弥补了传统微纳米纤维膜力学性能有限的缺陷，能够实现微纳米纤维的高方向性纤维结构堆叠。微米级纤维与纳米级纤维结合的手段，从电镜照片来看，相当于纳米纤维填充了微米纤维之间的空隙减小了微米纤维间的孔径，增大了微纳米纤维膜的比表面积，同时微米纤维与纳米级纤维分别形成微米纤维网与纳米纤维网，并连续重复交替堆叠的结构，提高了力学性能，达到了比表面积和力学性能都能够平衡的双重效果。

附图说明

图1为本发明微纳米纤维复合生物膜制备过程示意图；

图2为本发明微纳米纤维复合生物膜的结构示意图；

图3为本发明微纳米纤维复合生物膜实物照片；

图4为本发明微纳米纤维复合生物膜表面形态的电镜照片；

图5为比较例中微米纤维膜表面形态的电镜照片以及纤维平均直径和直径分布图；

图6为实施例1的微纳米纤维复合生物膜表面形态的电镜照片以及纤维平均直径和直径分布图；

图7为实施例2的微纳米纤维复合生物膜表面形态的电镜照片以及纤维平均直径和直径分布图；

图8为实施例3的微纳米纤维复合生物膜表面形态的电镜照片以及纤维平均直径和直径分布图；

图9为微纳米纤维复合生物膜的力学性能测试图；

图10为微纳米纤维复合生物膜的平均孔径和孔径分布率测试图；

图11为本发明提供的HDFs细胞种植在微纳米纤维膜上培养七天后phalloidin和DAPI染色的免疫荧光染色照片；

图12为HDFs细胞种植在微纳米纤维膜上分别培养1,3,7天后MTT检测的实物图片和吸光度值分析图。

具体实施方式

下面结合附图及具体实施例对本发明做进一步详细说明。

在本发明中，在未作相反说明的情况下，使用的方位词如“上”和“下”通常是指装置实际使用或工作状态下的上和下，具体为附图中的图面方向；而“内”和“外”则是针对装置的轮廓而言的。另外，在本申请的描述中，术语“包括”是指“包括但不限于”。用语第一、第二、第三等仅仅作为标示使用，并没有强加数字要求或建立顺序。用语“多个”是指“两个或两个以上”。

本发明的各种实施例可以以一个范围的形式存在；应当理解，以一范围形式的描述仅仅是因为方便及简洁，不应理解为对本申请范围的硬性限制；因此，应当认为所述的范围描述已经具体公开所有可能的子范围以及该范围内的单一数值。例如，应当认为从1到6的范围描述已经具体公开子范围，例如从1到3，从1到4，从1到5，从2到4，从2到6，从3到6等，以及所述范围内的单一数字，例如1、2、3、4、5及6，此不管范围为何皆适用。另外，每当在本文中指出数值范围，是指包括所指范围内的任何引用的数字(分数或整数)。

如图2、3、4所示，本发明实施例提供一种基于静电纺丝技术的微纳米纤维复合生物膜，该微纳米纤维复合生物膜通过静电纺丝工艺由分布均匀的微米级纤维与分布均匀的纳米级纤维交替堆叠复合形成。微纳米纤维复合生物膜为微米级纤维形成的微米纤维层与纳米级纤维形成的纳米纤维层交替堆叠形成的多孔膜结构，该多孔膜结构厚度为50-100μm，平均孔径为2.4-3.6μm，微米级纤维直径范围为1-3μm；纳米级纤维直径范围为50-1000nm，微纳米纤维膜断裂伸长率≥1.2％，拉伸强度为5.1-7MPa，杨氏模量为1313.2-2442.6MPa。

具体的，微纳米纤维复合生物膜由A聚合物制备的a浓度的纺丝前驱体以及由该聚合物制备的b浓度的纺丝前驱体在改进的静电纺丝装置中同步纺丝制成。其中，a浓度的纺丝液用于制备纳米级纤维，b浓度的纺丝液用于制备微米级纤维。通过随时调控A聚合物的a浓度和b浓度，可随时调控微纳米纤维复合生物膜中微米级纤维和纳米级纤维的分布，从而调控微纳米纤维复合生物膜的比表面积。

制备微纳米纤维复合生物膜的a浓度纺丝液的质量百分比为2％-10％，b浓度纺丝液的质量百分比为20％。A聚合物为聚己内酯、聚乙烯醇、聚丙烯吡咯烷酮、聚乙交酯-丙交酯、聚乳酸、聚丙交酯-乙交酯中的任意一种。

如图1所示，制备微纳米纤维复合生物膜采用静电纺丝设备，高压静电发生器能够产生正负静电高压；本发明实施例采用一台双供电高压静电发生器，高压静电发生器的正负极分别与双纺丝喷头相连。双纺丝喷头成相对而立，并且存在一定的距离，距离为10-20cm，最佳距离为16cm。双纺丝喷头的结构为针式喷头或者无针式喷头；针式喷头为单针或者多针组合式，为单轴、同轴或者多通道组合式；无针式喷头为金属丝、狭缝式、圆环式、圆柱式、圆盘式、球形中的一种或者多种组合，接收滚筒位于双纺丝喷头的中间位置。双供电高压静电发生器的纺丝电压为-12kV-﹢12kV，a、b浓度纺丝液的挤出速度为0.8mL/h，纺丝温度为20℃，相对湿度为40％。将不同浓度的聚合物采用双纺丝喷头的静电纺丝装置同步制备，在上述特定的纺丝条件下，同时通过随时调控A聚合物的a浓度以及b浓度，可随时调控微米级纤维和纳米级纤维的分布，得到微米级纤维和纳米级纤维分布均匀的微纳米纤维复合生物膜，比表面积、孔径、孔隙率均可调控，能够形成具有较大比表面积，较小孔径的微纳米纤维复合生物膜，并且工艺简单灵活。本发明的喷头直径、距离与高度可用于调节纺不同直径的纳米纤维材料，从而能够得到不同纤维结构堆叠，从而极大的丰富了微纳米纤维材料的种类。在模拟人体细胞外基质结构，提供细胞附着、增殖、分化的微生长环境，对受损组织或器官的修复、再生的过程中起到辅助作用。

下面通过具体实施例来对本申请进行具体说明，以下实施例仅是本申请的部分实施例，不是对本申请的限定。

实施例1：

如图1所示，采用聚己内酯(PCL)所配置的纺丝液为例，进行纺丝。包括以下步骤：(1)将PCL溶于六氟异丙醇中，经过搅拌、溶解、静置分别得到浓度为10％的a浓度纺丝液和浓度为20％的b浓度纺丝液；(2)将10％浓度的PCL纺丝液装入一侧注射器中，将20％浓度的PCL纺丝液装入另一侧注射器中，在纺丝电压为-12kV-﹢12kV，接收距离为16cm，纺丝液挤出速度为0.8mL/h，接收滚筒转速为300rpm，纺丝温度为20℃，相对湿度为40％的条件下进行纺丝；(3)微米纤维与纳米级纤维分别形成微米纤维网与纳米纤维网，并在接收滚筒表面连续重复交替堆叠；(4)将PCL纳米纤维和微米纤维收集为无明显串珠，纤维连续、均匀并且厚度为50-100μm的PCL微纳米纤维膜，即为本发明的微纳米纤维复合生物膜。

实施例2：

本实施例与实施例1制备过程相同部分不再赘述，其不同之处在于：采用聚己内酯(PCL)所配置的纺丝液为例，进行纺丝。包括以下步骤：(1)将PCL溶于六氟异丙醇中，经过搅拌、溶解、静置分别得到浓度为6％的a浓度纺丝液和浓度为20％的b浓度纺丝液；(2)将6％浓度的PCL纺丝液装入一侧注射器中，将20％浓度的PCL纺丝液装入另一侧注射器中，注射器推进速率均为0.8mL/h，外加电压设置为±12kV，接收滚筒转速为300rpm；(3)将PCL纳米纤维和微米纤维收集为无明显串珠，纤维连续、均匀并且厚度为50-100μm的PCL微纳米纤维膜。

实施例3：

本实施例与实施例1、2制备过程相同部分不再赘述，其不同之处在于：采用聚己内酯(PCL)所配置的纺丝液为例，进行纺丝。包括以下步骤：(1)将PCL溶于六氟异丙醇中，经过搅拌、溶解、静置分别得到浓度为2％的纺丝液和浓度为20％的纺丝液；(2)将2％浓度的PCL纺丝液装入一侧注射器中，将20％浓度的PCL纺丝液装入另一侧注射器中，注射器推进速率均为0.8mL/h，外加电压设置为±12kV，接收滚筒转速为300rpm；(3)将PCL纳米纤维和微米纤维收集为无明显串珠，纤维连续、均匀并且厚度为50-100μm的PCL微纳米纤维膜。

比较例：

本比较例作为与实施例1-3的对比，来制备微米纤维膜。采用聚己内酯(PCL)所配置的纺丝液为例，进行纺丝。包括以下步骤：(1)将PCL溶于六氟异丙醇中，经过搅拌、溶解、静置得到浓度为20％的纺丝液；(2)将20％浓度的PCL纺丝液装入注射器中，在纺丝电压为-12kV-﹢12kV，接收距离为16cm，纺丝液挤出速度为0.8mL/h，接收滚筒转速为300rpm，纺丝温度为20℃，相对湿度为40％的条件下进行纺丝；(3)将PCL微米纤维收集为无明显串珠，纤维连续、均匀并且具有一定厚度的PCL微纳米纤维膜。

1、形貌分析

用扫描电镜(TESCAN VEGA3，捷克)观察了比较例和实施例1-3微纳米纤维复合生物膜样品的形貌和结构。为了提高微纳米纤维复合生物膜样品的电导率，在样品表面镀金160s。采用ImageJ软件(National Institutes of Health,USA)，根据获得的SEM图像测量平均纤维直径和纤维直径分布。每个样本随机选取100个不同位置，计算平均纤维直径和纤维直径分布。

如图5-8所示，比较例和实施例1-3中较粗的微米纤维的平均纤维直径分别为1.71±0.29μm、2.13±0.51μm、2.20±0.20μm和2.12±0.42μm，均超过1μm，可定义为微米级纤维。实施例1-3中纳米纤维的平均纤维直径分别为0.42±0.09μm、0.20±0.05μm和0.09±0.02μm。均小于1μm，可定义为纳米纤维。实施例1-3中纳米纤维可以填补微米纤维之间的空隙，进而增加了微纳米纤维的比表面积。另外，纯的纳米纤维的可纺性很差，纺出来的纤维膜存在很多串珠，纯微米纤维的比表面积是比实施例小。可见，采用微米纤维与纳米纤维相结合的方式能够达到本发明微纳米纤维复合生物膜最佳的比表面积。

2、力学性能测试

采用万能拉力试验机(Instron5965，美国)分别测定了比较例和实施例1-3的力学性能。微纳米纤维复合生物膜在两端夹住固定距离为10mm。在正式实验前，对样品施加0.02N的预张力，拉伸速度固定为10mm/min。首先获得了载荷-伸长曲线，然后计算了应力-应变曲线、断裂强度、断裂伸长率和杨氏模量等4个重要力学参数，具体如下：

表1为比较例和实施例1-3力学性能测试结果

测试项目	比较例	实施例1	实施例2	实施例3
					杨氏模量(MPa)	653.7	1313.2	1399.8	2442.6
断裂强度(MPa)	2.7	5.1	5.5	7.0
					断裂伸长率(％)	8.7	1.4	1.2	1.4

如图9所示，结合上表可知，应力-应变曲线，比较例表现为线性弹性区，随后是屈服平台，最终导致断裂。与此相反，实施例1-3表现出不同的拉伸曲线，在线性弹性区之后出现明显的塑性变形区。实施例1-3的杨氏模量和断裂强度有显著提高，但断裂伸长率明显降低。其中，实施例3的杨氏模量相比于比较例提高了273％,断裂强度提高了159％，可见，在纳米级纤维纺丝浓度越低的条件下，其断裂强度和杨氏模量越大，体出现较好的力学性能。实施例1-3中纳米纤维的平均直径越小，纳米纤维和微米纤维之间的缠结越紧密，可以更好的提高微纳米纤维膜的力学性能。在实际的静电纺丝过程中，平均直径小的纳米纤维跟平均直径大的微米纤维产生了一个纠缠，促进了力学性能的提高。混合以后，纳米纤维跟微米纤维有一个交错，相当于纳米纤维的数量少了，个别纳米纤维会产生串珠，但总体数量大大减少，避免了纳米纤维膜或微米纤维膜中容易出现串珠出现疏水现象影响细胞黏附和增殖的效果。

3、孔径测试

如图10所示，用孔径分析仪测定了比较例和实施例1-3的孔径。将微纳米纤维复合生物膜裁剪成直径为2cm的圆形，并将浸润液滴入材料中，直至液体完全填充到样品的孔隙中。具体测试结果如下表：

测试项目	比较例1	实施例1	实施例2	实施例3
					平均孔径(μm)	5.2	3.6	2.4	3.0

根据现有技术的研究表明，孔径越小的微纳米纤维膜具有更大的比表面积，为细胞提供更多的粘附位点。实施例1-3的平均孔径明显小于比较例的平均孔径，平均减小了30％左右。说明实施例1-3通过微米级纤维与纳米级纤维相结合的方式可以减小微纳米纤维膜的平均孔径，从而可精确的调控微纳米纤维的比表面积。制备纳米级纤维所用纺丝液浓度为6％时获得的平均孔径最小，即本发明实施例2。

4、细胞实验

如图11所示，人表皮成纤维细胞(HDFs，中国科学院细胞系)在DMEM培养基中培养。将微纳米纤维膜裁剪成直径为10mm的圆形。对样品进行灭菌，以4×10⁴的细胞密度将HDFs接种到样品上，每两天更换一次培养基，直到达到预定的时间点。采用MTT法(Sigma-Aldrich)测定培养1、3和7天后样品的细胞活力和增殖情况。随后，拍摄照片观察不同样品中的蓝紫色Formazan晶体区域。使用微孔板读取仪(Infinite M Nano,Tecan)在490nm波长下测量吸光度。培养7天后，用IFluorTM 488phalloidin和DAPI染色观察细胞形态和细胞核结构，最后，使用共聚焦激光扫描显微镜(CLSM，蔡司900，卡尔蔡司)观察染色样品。

如图12所示，F-actin和DAPI分别代表HDFs的细胞骨架和细胞核。结果表明，实施例1-3样品上的细胞数量明显高于比较例，这表明HDFs在实施例1-3样品上具有良好的细胞粘附、增值和迁移。进一步采用MTT法测定HDFs在样品上7天内的增殖情况。实施例的结晶区域面积在3个时间点都明显大于比较例。并且统计分析结果表明，实施例1-3的吸光度值明显大于比较例的吸光度值。综上所述，微米级纤维和纳米级纤维分布均匀的微纳米纤维复合生物膜的比表面积较大，促进了细胞的粘附、增殖和迁移。

众所周知，在静电纺丝应用领域，对纺丝参数进行调控，特别是对纺丝直径、方向性的调控，也是一项关键技术。目前纺丝直径、方向性的调控方式可以藉由改变电压、纺丝距离、溶液浓度、注射流量以及工作距离来实现。但在工业化生产中，一般需要固定所有其它参数后，再对某一参数进行调节，在实际生产中，难以实现对所有参数的稳定调控，难以大量制备直径、方向性统一的电纺纤维，更限制了许多应用的展开。本发明的构思巧妙利用了静电纺纤维“细度难掌握、方向难控制”所产生的不规则孔隙，所获得的微纳米纤维网由方向无序的不同细度的纤维相互堆叠组成，堆叠形成的这种多层结构起到了“骨架”的支撑作用，不但获得了更大的比表面积及孔隙率，而且赋予了良好的外界屏障能力。

本发明微纳米纤维复合生物膜的具体应用：

1、水凝胶微针生物支架：

目前的水凝胶支架尽管从结构、组成和功能上具备了仿生天然组织，具有较好的生物相容性，能够进细胞增殖和分化、细胞外基质沉积和重塑，以及新组织再生，但是与水凝胶微针相结合的纤维膜或纤维其功能仍然存在一些影响支架生物性能的缺陷。虽然水凝胶的载药能力强，载药效率高，但水凝胶支架的力学性能有限并且外界屏障作用较差，在外力作用下，水凝胶会出现裂纹导致细菌入侵。本发明与水凝胶微针相结合，通过微纳米纤维复合生物膜粘附在水凝胶外层起到支撑形态和阻隔作用，从而提高了水凝胶微针的力学性能和外界屏障能力。

2、肌腱补片：

肌腱损伤是运动系统常见疾病之一，目前关节镜手术治疗是最有效的手段之一，但是肌腱愈合受多种因素干扰，严重影响手术治疗术后愈合效果。利用肌腱修补补片在关节镜手术中进行增强修补或桥接修补成为新的治疗方案选择。目前的肌腱补片要求需要具备良好的生物力学特性和生物相容性，诱导组织再生和愈合，为腱-骨界面提供稳定的力学保障。目前主要研究方向为可降解功能，主要包括采用可降解的经纱纬纱编制而成的纤维结构，或可降解性合成高分子聚合物编织而成的片网状结构。本发明与传统的肌腱补片相比，从促进组织再生、愈合和辅助提供力学保障方面有着明显的优势。纺丝液采用可降解材料，静电纺丝微纳米纤维膜的结构能与组织更加紧密贴合。通过微米级纤维与纳米级纤维相结合的方式可以减小微纳米纤维膜的平均孔径，从而可精确的调控微纳米纤维的比表面积，能够明显促进细胞增殖和分化、细胞外基质沉积和重塑，以及新组织再生。纳米纤维和微米纤维之间的紧密缠结结构，可以更好的提高微纳米纤维膜的力学性能，可用于肌腱组织受损的修补愈合用途。为肌腱补片技术的进一步发展提供了研究方向。

3、疝修补片：

疝修补片是疝修补材料的简称。近年来随着材料学的迅猛发展，各种疝修补材料已广泛应用到临床中，使得疝的治疗发生了根本的变化。目前国际上已被广泛用于疝修补的合成材料分为两大类：第一类为不可吸收的聚酯补片、聚丙烯补片、膨化聚四氟乙烯补片；第二类为复合补片。疝修补片基本功能：柔软，更耐受弯曲和折叠；可随需要大小剪裁；刺激纤维组织增生作用更明显，网孔孔径大，更利于纤维组织生长穿过，易被结缔组织浸润，能够早期与组织嵌合、耐受感染、有更高的抗张强度以及价格便宜等。本发明微纳米纤维复合生物膜由于采用静电纺丝技术，相比织物结构更加柔软，避免了在疤痕收缩造成网片扭曲，其不规则的表面可能刺激并损伤周围组织的问题。而且可控的厚度、比表面积、孔径、孔隙率在防粘连、促愈方面有着更多的优势，微纳米纤维堆叠缠结的结构，大大提高了膜本身的力学性能，使得微纳米纤维复合生物膜的这种特殊的、可控的结构更耐受弯曲和折叠，植入后在腹壁生长更加牢固。

当然，上述说明并非是对本发明的限制，本发明也并不限于上述举例，本技术领域的普通技术人员，在本发明的实质范围内，作出的变化、改型、添加或替换，都应属于本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种基于静电纺丝技术的微纳米纤维复合生物膜，其特征在于：所述微纳米纤维复合生物膜通过静电纺丝工艺由分布均匀的微米级纤维与分布均匀的纳米级纤维交替堆叠复合形成，所述微纳米纤维复合生物膜为微米级纤维形成的微米纤维层与纳米级纤维形成的纳米纤维层交替堆叠形成的多孔膜结构，该多孔膜结构厚度为50-100μm，平均孔径为2.4-3.6μm，微米级纤维直径范围为1-3μm；纳米级纤维直径范围为50-1000nm，微纳米纤维膜断裂伸长率≥1.2％，拉伸强度为5.1-7MPa，杨氏模量为1313.2-2442.6MPa。

2.根据权利要求1所述的基于静电纺丝技术的微纳米纤维复合生物膜，其特征是：所述微纳米纤维复合生物膜是由A聚合物制备的a浓度的纺丝前驱体以及由该聚合物制备的b浓度的纺丝前驱体在静电纺丝装置中同步纺丝制得，所述纳米级纤维的原料为A聚合物制备的a浓度的纺丝液，微米级纤维的原料为A聚合物制备的b浓度的纺丝液，所述a浓度纺丝液的质量百分比为2％-10％，b浓度纺丝液的质量百分比为20％。

3.根据权利要求2所述的基于静电纺丝技术的微纳米纤维复合生物膜，其特征是：所述A聚合物为聚己内酯、聚乙烯醇、聚丙烯吡咯烷酮、聚乙交酯-丙交酯、聚乳酸、聚丙交酯-乙交酯中的任意一种。

4.根据权利要求2所述的基于静电纺丝技术的微纳米纤维复合生物膜，其特征是：所述静电纺丝装置包括一双供电高压静电发生器及接收滚筒，在接收滚筒的两侧分别对称设置有用于制备微米纤维层及纳米纤维层的两个纺丝喷头，所述高压静电发生器的正负极分别与两个纺丝喷头相连。

5.根据权利要求4所述的基于静电纺丝技术的微纳米纤维复合生物膜，其特征是：所述双供电高压静电发生器的纺丝电压为-12kV-﹢12kV，接收滚筒两侧的接收距离分别为16cm，a、b浓度纺丝液的挤出速度为0.8mL/h，纺丝温度为20℃，相对湿度为40％。

6.根据权利要求2或3所述的基于静电纺丝技术的微纳米纤维复合生物膜，其特征是：所述A聚合物制备的a浓度的纺丝液的质量百分比为6％。

7.一种制备如权利要求1-6任一项所述的基于静电纺丝技术的微纳米纤维复合生物膜的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)、配制由A聚合物制备的质量百分比为2％-10％的a浓度纺丝液，以及质量百分比为20％的b浓度纺丝液，备用；

(2)、将上述配制好的纺丝液分别连接静电纺设备的两个纺丝喷头，双供电高压静电发生器的正负极分别与两个纺丝喷头相连；

(3)、开启双供电高压静电发生器分别为两个纺丝喷头提供相反的高压静电，在一定的纺丝电压、接收距离、纺丝液挤出速度条件下进行同步纺丝；

(4)、利用接收滚筒收集两个纺丝喷头分别在接收滚筒两侧形成的微米、纳米纤维；

(5)、微米纤维与纳米级纤维分别形成微米纤维网与纳米纤维网，并连续重复交替堆叠；

(6)、根据厚度要求，获得微米级纤维和纳米级纤维连续、分布均匀、无明显串珠的微纳米纤维复合生物膜。

8.根据权利要求7所述的基于静电纺丝技术的微纳米纤维复合生物膜的制备方法，其特征是：所述步骤(3)中，在纺丝电压为-12kV-﹢12kV，接收距离为16cm，纺丝液挤出速度为0.8mL/h，纺丝温度为20℃，相对湿度为40％。

9.根据权利要求7所述的基于静电纺丝技术的微纳米纤维复合生物膜的制备方法，其特征是：所述步骤(4)中，接收滚筒转速为300rpm。

10.根据权利要求1-6中任一项所述的基于静电纺丝技术的微纳米纤维复合生物膜在制备组织受损伤口的伤口敷料、肌腱补片、疝修补片材料中的应用。