CN111632193A - 壳聚糖基神经纤维膜及制备方法、神经导管和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及神经组织工程材料技术领域，具体提供一种壳聚糖基神经纤维膜及制备方法、神经导管和应用。所述壳聚糖基神经纤维膜由若干取向排列的复合纳米纤维形成；每根复合纳米纤维均为芯壳结构，其壳层中包含可降解功能材料、亲水官能团修饰的碳纳米管、枸杞多糖、以及壳聚糖和/或壳聚糖衍生物，其芯层中包含神经生长因子和稳定剂。本发明的壳聚糖基神经纤维膜由于具有取向排列良好、机械性能良好、生物响应性高，降解时壳聚糖和/或壳聚糖衍生物水解产物和自身所带氨基的碱性可有效的中和降解物呈现的弱酸性，避免酸性降解物对周围环境、组织的影响等特性，因而可以应用于人体、动物体的神经修复、再生中。

Description

壳聚糖基神经纤维膜及制备方法、神经导管和应用

技术领域

本发明属于神经组织工程材料技术领域，尤其涉及一种壳聚糖基神经纤维膜及制备方法、神经导管和应用。

背景技术

在现代外科手术中，临床上经常利用组织修复膜对组织和器官进行修复。这就需要组织修复膜具有良好的生物相容性、有一定的强度、便于细胞粘附和生长等等。

在众多外科手术中，常见的一种情况是周围神经缺损，其往往会导致患者相应神经支配区域感觉和运动功能丧失，因而周围神经损伤后的修复与再生一直是临床和神经学科领域的研究热点。

目前神经损伤后的修复与再生的临床治疗手段主要有端端缝合、自体或异体的神经移植等。其中，自体神经移植是利用自身次要神经的移植来桥接修复神经缺损，但是自体神经移植有供体来源有限等诸多的不足和局限性，这极大的限制了其在临床治疗中的应用；而异体神经移植往往存在免疫排斥反应，会很大程度的制约神经功能的恢复。这样的现状使得截至目前，医学上还没有在神经损伤后的修复与再生方面取得重要的突破。

众所周知，理想的治疗手段需要考虑到能够较好的恢复神经受损的神经组织、不造成新的组织损伤并能恢复其原有功能等多方面。尽管人工组织工程神经移植物已经迅速发展，但是现有的神经支架的临床恢复效果对于修复长的神经缺损的效果并不如意，不能满足临床需求。

通过电纺丝技术，可以获得具有纳米结构的模仿天然细胞外基质生物支架材料，这种具有纳米结构的模仿天然细胞外基质生物支架材料由于具有神经导管所要求的特质和优点，因而可以有效促进周围神经的再生，同时可以不再需要取自体神经进行移植。但是，用不可降解材料制成的不可降解型神经导管常常容易引起周围组织炎症并压迫神经，进而影响神经轴突的再生，而且这种神经导管需要再次手术将其移植，而这又会导致患者疼痛和加剧损伤。

壳聚糖(英文chitosan，简称CS)、聚乳酸-羟基乙酸共聚物(英文简称PLGA)、胶原等由于具有良好的生物相容性、可生物降解、对人体无毒等特性而被广泛研究作组织工程用材料。

但是，经过研究发现，单纯的壳聚糖制备的神经导管机械性能较差，机械性能差不利于外科手术操作。而PLGA由于是乳酸和羟基乙酸的共聚物，其属于无定形的生物降解聚酯，降解产生的降解物有弱酸性，可能会对局部机体产生刺激进而引发局部炎症。

发明内容

针对现有神经导管存在的机械性能差、降解物容易刺激机体引发局部炎症而不利于神经修复等问题，本发明提供一种壳聚糖基神经纤维膜及其制备方法。

进一步地，本发明还提供由壳聚糖基神经纤维膜制成的神经导管和该神经导管的应用。

本发明是这样实现的：

一种壳聚糖基神经纤维膜，所述壳聚糖基神经纤维膜由若干取向排列的复合纳米纤维形成；每根所述复合纳米纤维呈现芯壳状结构；

以所述复合纳米纤维的质量含量为100.0000％计，包含以下组分：

所述复合纳米纤维的壳层材料包含所述可降解功能材料、官能团修饰的碳纳米管、枸杞多糖、以及壳聚糖和/或壳聚糖衍生物；

所述复合纳米纤维的芯层材料包含神经生长因子和稳定剂。

对应地，上述壳聚糖基神经纤维膜的制备方法，包括以下步骤：

提供包含可降解功能材料、亲水官能团修饰的碳纳米管、枸杞多糖、以及壳聚糖和/或壳聚糖衍生物的A溶液，以及包含神经生长因子和稳定剂的B溶液；

采用同轴静电纺丝技术对所述A溶液和B溶液进行纺丝处理，控制所述A溶液的推进速度为(1.0～1.8)mL/h，所述B溶液的推进速度为(0.1～0.2)mL/h，针头到收集装置的距离范围为(10～15)cm，获得由取向排列的复合纳米纤维构成的纤维膜；

其中，所述A溶液和B溶液中各组分的浓度应保证经同轴静电纺丝后获得的取向排列的复合纳米纤维质量总含量为100％计时，各组分含量满足以下条件：

以及，进一步地，一种神经导管，所述神经导管由如上所述的壳聚糖基神经纤维膜卷制成型；或者，由如上所述的壳聚糖基神经纤维膜的制备方法制备得到的壳聚糖基神经纤维膜卷制成型；

所述神经导管的轴向方向与所述壳聚糖基神经纤维膜中取向排列的复合纳米纤维的取向方向一致。

相应地，上述神经导管在人体及动物神经损伤修复、再生中的应用。

本发明的有益效果如下：

相对于现有技术，本发明提供的壳聚糖基神经纤维膜取向排列良好，且机械性能良好、生物响应性高，纤维膜降解时壳聚糖和/或壳聚糖衍生物水解产物和自身所带氨基的碱性可有效的中和降解物呈现的弱酸性，避免酸性降解物对周围环境、组织的影响。

本发明提供的壳聚糖基神经纤维膜的制备方法，通过同轴静电纺丝的方式，获得具有完整三维、芯壳结构的复合纳米纤维，并且复合纳米纤维之间经良好取向排列形成具有力学性能优良、生物相容性良好及降解性良好的纤维膜；本制备方法工艺简单、稳定性良好，可以实现大批量纤维膜的制备。

本发明提供的神经导管，由于其采用上述的壳聚糖基神经纤维膜卷制成型，具有纤维膜完整的三维、芯壳纤维结构，有良好生物相容性、优良的力学强度、适宜的生物降解性；

其中，导管内壁为取向排列的壳聚糖基纤维结构，有利于细胞粘附，实现细胞的定向排列，同时壳聚糖基材料能明显抑制成纤维细胞的生长；

壳聚糖和/或壳聚糖衍生物水解产物和自身所带氨基的碱性可以部分中和降解物的弱酸性、减少对机体的刺激，而亲水官能团修饰的碳纳米管可以促进神经元电信号的传导和神经纤维的生长，减少甚至避免癍痕组织的形成并能促进神经细胞轴突的延伸，实现引导神经再生，达到修复周围神经缺损的目的。

本发明提供的神经导管在人体、动物体神经损伤修复、再生中的应用，可以有效的修复神经缺损，并减少甚至避免瘢痕组织的形成。

附图说明

为了更清楚地说明本发明施例中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是本发明实施例1提供的壳聚糖基神经纤维膜扫描电镜(SEM)图；

图2是本发明提供的壳聚糖基神经纤维膜中复合纳米纤维结构示意图；

图3是本发明对比例1提供的壳聚糖纳米纤维膜扫描电镜(SEM)图；

图4是本发明对比例2提供的提供的聚乳酸-羟基乙酸共聚物纳米纤维膜扫描电镜(SEM)图；

图5是本发明实施例1(2、3)及对比例1、2各纤维膜的应力拉应变曲线图；

图6是本发明雪旺细胞在对比例1(图6a)、2(图6b)及实施例1(图6c)的纤维膜上生长的示意图；

图7是本发明实施例1所示的壳聚糖基神经纤维膜卷制成型的神经导管照片；

其中，1-复合纳米纤维，11-复合纳米纤维的壳层，12-复合纳米纤维的芯层。

具体实施方式

为了使本发明要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明做进一步的详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

请参阅图1，本发明提供的壳聚糖基神经纤维膜如图1所示，所述壳聚糖基神经纤维膜由若干取向排列的复合纳米纤维形成；每根所述复合纳米纤维呈芯壳状结构；

以所述复合纳米纤维的质量含量为100.0000％计，包含以下组分：

所述复合纳米纤维的壳层材料包含可降解功能材料、亲水官能团修饰的碳纳米管、枸杞多糖、以及壳聚糖和/或壳聚糖衍生物；

所述复合纳米纤维的芯层材料包含神经生长因子和稳定剂。

请参阅图2，形成上述壳聚糖基神经纤维膜的复合纳米纤维的示意图如图2所示。其中图2显示的是由一芯层和一壳层形成的复合纳米纤维1由复合纤维纳米纤维的壳层11和复合纤维纳米纤维的芯层12两部分构成，通过芯壳结构可以有效的控制神经生长因子的缓释效果。因为周围神经损伤后的10～15天是神经再生的关键时期，而周围神经的再生需要近四周的时间，这使得神经生长因子和壳层上枸杞多糖(英文简写：LBP)的释放基本满足周围神经再生周期的需求，从而有效的修复神经组织，提高神经组织再生效率。

优选地，所述复合纳米纤维1的直径不超过1000nm。如果直径过大，壳层11会变厚，降解时长超过组织修复的时长，不利于组织修复，或者芯层12的神经生长因子和稳定剂的含量过多，造成资源浪费。

进一步优选，复合纳米纤维的直径为250nm～400nm，该直径范围内的复合纳米纤维形成的壳聚糖基神经纤维膜，更有利于细胞的生长。

本发明壳聚糖的脱乙酰度不低于80％，壳聚糖衍生物的脱乙酰度也不低于80％。形成复合纳米纤维1的壳层11材料中，可以是壳聚糖和其他材料，也可以是壳聚糖衍生物和其他材料，还可以同时含有壳聚糖和壳聚糖衍生物及其他材料，这里的其他材料包括可降解功能材料、亲水官能团修饰的碳纳米管、枸杞多糖。壳聚糖和/或壳聚糖衍生物在复合纳米纤维1中有利于细胞粘附和迁移，与可降解功能材料协同提高纤维膜的机械强度，同时，在降解过程中，壳聚糖和/或壳聚糖衍生物还可以部分中和可降解功能材料降解物带来的弱酸性，从而降低甚至避免在组织修复时因弱酸性而刺激机体或者引发的炎症等。

具体来说，壳聚糖和/或壳聚糖衍生物的降解产物和自身所含氨基，均呈碱性，可以中和其他成分降解带来的酸性，同时能抑制其他组分自催化降解，从而避免降解物为酸类物质所带来的酸性所导致的非感染性炎症反应。

优选地，所述壳聚糖和/或壳聚糖衍生物的分子量为10kDa～30kDa。

壳聚糖衍生物在一些具体成分中也可以称为改性壳聚糖。优选地，壳聚糖衍生物为羧甲基壳聚糖、季铵盐壳聚糖中的至少一种，这两种壳聚糖衍生物都具有较好的亲水性，不仅有利于制备成型，而且在使用过程中还有利于与周围组织相容。

可降解功能材料可以选自聚乳酸、聚羟基乙酸、聚乳酸-羟基乙酸共聚物、聚己内酯、聚-3-羟基丁酸、聚乙交酯、左旋聚乳酸胶原蛋白、丝素蛋白、层粘连蛋白、明胶中的任一种。这些材料都有良好的降解性能，并且降解物对周围组织无毒、无刺激、无免疫原性。

在一些实施例中，可降解功能材料为聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)，并且形成聚乳酸-羟基乙酸共聚物的乳酸单体和羟基乙酸单体的质量比为(75:25)～(85:15)。在这个原料比例下，聚乳酸-羟基乙酸共聚物的降解时间大概为12周左右，迟于神经修复所需要的时间，能够在神经修复完成不久后自行消失，有利于提高组织修复效果。

使用亲水官能团修饰的碳纳米管不仅有效避免单纯碳纳米管具有的细胞毒性，还可以使得碳纳米管的水溶性提高。

优选地，亲水官能团修饰的碳纳米管中，亲水官能团为羧酸基、磺酸基、磷酸基、氨基、季铵基、醚基、羧酸酯基、嵌段聚醚中的至少一种。

优选地，亲水官能团修饰的碳纳米管中，碳纳米管为单壁碳纳米管、多壁碳纳米管中的至少一种。其中，单壁碳纳米管相对于多壁碳纳米管具有更高的均一性，缺陷更少，其更有利于形成形貌平整、结构均一的复合纳米纤维，从而形成厚薄均匀的壳聚糖基神经纤维膜，进而更有利于促进神经元电信号的传到和神经纤维的生长，减少甚至避免瘢痕组织的形成，并有效促进神经细胞轴突的延伸。

优选地，所述亲水官能团修饰的碳纳米管的直径不超过20nm，长度不超过30μm，直径以及长度过大，容易导致加工堵塞。当然，如果可以解决加工堵塞问题，则亲水官能团修饰的碳纳米管的直径和长度则不受限制。

在一些壳聚糖基神经纤维膜中，复合纳米纤维1的壳层11还含有乳化剂，这是由于在制备复合纳米纤维1时，有时候通过加入乳化剂来提高乳化效果，使得复合纳米纤维1的制备液更为均匀，尤其是提高亲水官能团修饰的碳纳米管的分散均匀性，由于制备后其无法去除，因此留在成品中。

乳化剂优选为斯盘20(Span-20)、斯盘40(Span-40)、斯盘60(Span-60)、斯盘80(Span-80)、斯盘85(Span-85)中的任一种。

复合纳米纤维1的芯层12中，需要通过稳定剂来保持神经生长因子(英文简写：NGF)的活性，所使用的稳定剂为牛血清白蛋白(英文简写：BSA)。

上述壳聚糖基神经纤维膜的厚度不超过0.5mm，壳聚糖基神经纤维膜的厚度过薄容易出现强度不够，不利于外科手术操作，也不利于卷制成型，只要其厚度能够方便卷制成型并且利于外科手术操作即可；而如果厚度过厚，则在外科手术中，其挤占的组织空间大，造成局部浮肿，并且降解历时过长。

在作为神经导管时，壳聚糖基神经纤维膜的优选厚度为0.2mm～0.3mm，以使得卷制成型时与人体、动物体的各种神经导管的厚度等参数相接近甚至一致。

上述的壳聚糖基神经纤维膜，可以通过增材制造技术获得，比如可以通过静电纺丝技术或者3D打印技术。

优选地，增材制造技术为同轴静电纺丝技术。如果通过其他技术获得具有本发明具有芯壳结构的复合纳米纤维1以及壳聚糖基神经纤维膜，也属于本发明的构思。

相应地，本发明在提供上述壳聚糖基神经纤维膜的基础上，进一步提供了该壳聚糖基神经纤维膜的制备方法。

所述壳聚糖基神经纤维膜的制备方法，包括以下步骤：

(1)配制纺丝液：纺丝液包括A溶液和B溶液，其中，A溶液中包含可降解功能材料、亲水官能团修饰的碳纳米管、枸杞多糖、以及壳聚糖和/或壳聚糖衍生物；B溶液中包含神经生长因子和稳定剂。

所述A溶液和B溶液中各组分的浓度应保证最后获得的取向排列的复合纳米纤维质量总含量为100％计时各组分的含量满足以下条件：

在一些实施例中，上述A溶液各组分的浓度分别为：

A溶液使用的溶剂可以是六氟异丙醇(英文简写：HFIP)。在具体的制备过程中，还可以根据亲水官能团修饰的碳纳米管在A溶液中的分散程度，加入分散量的乳化剂，加入的乳化剂的量以能够使得A溶液分散均匀并且保证在整个壳聚糖基神经纤维膜制备过程中不沉降即可。

具体地，乳化剂优选为斯盘20(Span-20)、斯盘40(Span-40)、斯盘60(Span-60)、斯盘80(Span-80)、斯盘85(Span-85)中的任一种。

B溶液各组分的浓度为：

神经生长因子 (10～20)μg/mL；

稳定剂 (10～20)mg/mL。

(2)同轴静电纺丝：将配好的A溶液和B溶液吸入同轴双喷嘴的纺丝设备中进行静电纺丝处理。具体是将高压电源的正极接在纺丝设备的针尖上，负极与收集装置相连，收集装置为转速可控的旋转滚轴；设定推进速度、负载电压、接收距离，启动推进泵，在高压静电的作用下，纺丝液推出形成纤维，通过调节接收滚轴的转动速度以控制纤维的取向性，由此获得壳聚糖基神经纤维膜。

具体地，所述静电纺丝参数包括：负载电压为(14～18)kV，A溶液的推进速度为(1.0～1.8)mL/h，B溶液的推进速度为(0.1～0.2)mL/h，针头到收集装置的距离范围为(10～15)cm，所用针头为20号或者其他型号的不锈钢针头，静电纺丝收集装置的转速为(2000～3000)rpm。

本发明的静电纺丝，除了可以使用同轴静电纺丝设备外，还可以使用多通道静电纺丝设备，从而可以获得由若干芯层和一壳层结构的复合纳米纤维。

本发明提供的壳聚糖基神经纤维膜，由于其具有良好的机械性能、细胞粘附和生长性能、生物相容性、可降解性、无毒性、对机体刺激较少等特性，可以制成壳聚糖基神经制品。比如，可以将本发明壳聚糖基神经纤维膜制成神经导管等等。

当本发明壳聚糖基神经纤维膜制成神经导管时，其可以根据需要采用卷制成型的方式卷制成不同管径的神经导管，并且卷制成型的神经导管的轴向方向与所述壳聚糖基神经纤维膜中取向排列的复合纳米纤维的取向方向一致。从而有利于损伤部位的细胞沿着神经导管方向粘附和生长，促进神经再生速率。

本发明神经导管的一种卷制成型方法为：将壳聚糖基神经纤维膜剪成所需的长条形，将其卷绕至洁净的玻璃棒上，卷绕过程中要保证取向排列的复合纳米纤维的取向方向与圆棒的长轴方向一致，尽量保证层与层之间的贴合以减小层间缝隙，利用二氯甲烷或者其他对人体、动物体无副作用的粘结剂对结合处进行黏结，最后干燥处理，即可得到轴向取向的神经导管，并剪成所需长度。在具体卷制过程中，可根据实际所缺损部位直径调节导管直径。

由于本发明提供的神经导管，具有高度取向，并且机械性能良好、生物响应性高，纤维膜降解时壳聚糖的水解产物和自身所带氨基的碱性可有效的中和降解物呈现的弱酸性，避免酸性降解物对周围环境、组织的影响，其作为神经异体移植材料，可以广泛应用于人体或者动物体的神经损伤修复、再生中。

为了更好的说明本发明的技术方案，下面结合具体实施例进行说明。

实施例1

一种壳聚糖基神经纤维膜的制备方法，其包括以下步骤：

(1).将1.25g聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA，其中乳酸单体和羟基乙酸单体的质量比为75:25)、0.35g壳聚糖(CS，脱乙酰度为90％)和10mg枸杞多糖(LBP)同时溶于5mL的六氟异丙醇中，磁力搅拌24h，使PLGA和LBP充分溶解形成均匀的溶液。

(2).向步骤(1)获得的溶液中加入0.1g羧基修饰的多壁碳纳米管(MWCNTs，平均直径为15nm，平均长度1μm)和100μL Span 80，磁力搅拌8h，使MWCNTs均匀的分散在溶液中，获得A溶液。

(3).配制10μg/mL的神经生长因子(NGF)水溶液，并同时加入牛血清白蛋白(BSA)，控制BSA的浓度为10mg/mL，获得B溶液。

(4).利用同轴静电纺丝技术制备壳聚糖基神经纤维膜，在纺丝前纺丝前对A溶液进行超声处理1h，使得多壁碳纳米管分散均匀。设定纺丝电压为18kV，A溶液和B溶液的推进速率分别设定为1mL/h和0.2mL/h，设定接收距离为10cm；利用铝箔包裹的滚轴作为接收装置收集取向排列的纳米纤维，滚轴的转速为2500rpm。

按照上述程序纺丝完毕，将膜撕下，自然干燥后置于扫描电镜下观察所制备的纤维膜形貌，结果如图1所示。从图1可知，纤维膜高度取向排列，且所得纤维膜厚度为0.2mm。

实施例2

一种壳聚糖基神经纤维膜的制备方法，包括以下步骤：

(1).将0.9g聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA，其中乳酸单体和羟基乙酸单体的质量比为85:15)、0.32g壳聚糖(CS，脱乙酰度为90％)和10mg枸杞多糖(LBP)同时溶于2.5mL六氟异丙醇中，磁力搅拌24h，使PLGA和LBP充分溶解形成均匀的溶液。

(2).向步骤(1)获得的溶液中加入0.01g羧基修饰的多壁碳纳米管(MWCNTs，平均直径为10nm，平均长度5μm)和50μL Span 80，磁力搅拌8h，使MWCNTs均匀的分散在溶液中，获得A溶液。

(3).配制10μg/mL的神经生长因子(NGF)水溶液，并同时加入牛血清白蛋白(BSA)，控制BSA的浓度为10mg/mL，获得B溶液。

(4).利用同轴静电纺丝技术制备壳聚糖基神经纤维膜，在纺丝前纺丝前对A溶液进行超声处理1h，使得多壁碳纳米管分散均匀。设定纺丝电压为18kV，A溶液和B溶液的推进速率分别设定为1mL/h和0.2mL/h，设定接收距离为10cm；利用铝箔包裹的滚轴作为接收装置收集取向排列的纳米纤维，滚轴的转速为2500rpm。

按照上述程序纺丝完毕，将膜撕下，自然干燥后置于扫描电镜下观察所制备的纤维膜形貌，所得纤维膜厚度为0.16mm。

实施例3

一种壳聚糖基神经纤维膜的制备方法，包括以下步骤：

(1).将1.5g聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA，其中乳酸单体和羟基乙酸单体的质量比为70:30)、0.35g壳聚糖(CS，脱乙酰度为80％)和10mg枸杞多糖(LBP)同时溶于5mL六氟异丙醇中，磁力搅拌24h，使PLGA和LBP充分溶解形成均匀的溶液。

(2).向步骤(1)获得的溶液中加入0.10g羧基修饰的单壁碳纳米管(平均直径为15nm，平均长度1μm)和150μL Span 80，磁力搅拌8h，使羧基修饰的单壁碳纳米管均匀的分散在溶液中，获得A溶液。

(3).配制10μg/mL的神经生长因子(NGF)水溶液，并同时加入牛血清白蛋白(BSA)，控制BSA的浓度为10mg/mL，获得B溶液。

(4).利用同轴静电纺丝技术制备壳聚糖基神经纤维膜，在纺丝前纺丝前对A溶液进行超声处理1h，使得多壁碳纳米管分散均匀。设定纺丝电压为18kV，A溶液和B溶液的推进速率分别设定为1mL/h和0.2mL/h，设定接收距离为10cm；利用铝箔包裹的滚轴作为接收装置收集取向排列的纳米纤维，滚轴的转速为2500rpm。

按照上述程序纺丝完毕，将膜撕下，自然干燥后置于扫描电镜下观察所制备的纤维膜形貌，发现所得纤维膜厚度为0.22mm。

对比例1

一种壳聚糖纺丝膜的制备方法，包括以下步骤：

(1).将0.35g壳聚糖(CS，脱乙酰度为90％)溶于5mL六氟异丙醇中，磁力搅拌至完全溶解，获得CS静电纺丝液。

(2).用7号注射器吸取4mL步骤(1)得到的CS静电纺丝液，将高压电源的正极接在针尖上，负极与收集装置相连，将针管固定放置推进泵上，设定电压14kV，推进速度0.1mL/h，接收距离12cm。启动推进泵，待针头处有液滴滴下后开启直流电压器输液泵以1mL/h向前推压，在距离针尖10cm的位置放置接收装置，将纺丝有序的收集于接收板中。纺丝完毕，将膜撕下，干燥后置于扫描电镜下观察，得到的壳聚糖纺丝膜如图3所示。由图3可知，壳聚糖纺丝纤维膜取向排列性能差。

对比例2

一种聚乳酸-羟基乙酸共聚物纤维膜的制备方法，包括以下步骤：

(1).将1.25g聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA，其中乳酸单体和羟基乙酸单体的质量比为75:25)溶于5mL六氟异丙醇中，磁力搅拌至完全溶解，获得PLGA静电纺丝液。

(2).用7号注射器吸取4mL步骤(1)得到的PLGA静电纺丝液，将高压电源的正极接在针尖上，负极与收集装置相连，将针管固定放置推进泵上，设定电压14kV，推进速度0.1mL/h，接收距离12cm。启动推进泵，待针头处有液滴滴下后开启直流电压器输液泵以1mL/h向前推压，在距离针尖10cm的位置放置接收装置，将纺丝有序的收集于接收板中。纺丝完毕，将膜撕下，干燥后置于扫描电镜下观察，得到的聚乳酸-羟基乙酸共聚物纤维膜如图4所示。从图4可知，聚乳酸-羟基乙酸共聚物纤维膜具有比较好的取向排列特性。

性能测试：

为了更好的比较本发明的壳聚糖基神经纤维膜与壳聚糖纺丝膜、聚乳酸-羟基乙酸共聚物纤维膜的性能，对实施例、对比例1、对比例2得到的膜进行相应的性能测试。

1.力学性能测试

将实施例1～3得到的壳聚糖基神经纤维膜、对比例1及对比例2得到的膜分别裁成60mm×10mm的矩形样条，每个实施例以及每个对比例均裁5个样品，在M350-20KN型力学拉伸机上于室温下进行单轴拉伸试验，使用100N传感器，其中膜的有效拉伸长度为40mm，拉伸速度为5mm/min，由5个样品的平均值得到各膜的拉伸强度、杨氏模量以及断裂伸长率，结果如图5，其中实施例1、2、3的5个样品平均值得到的曲线相互重合。

从图5可知，静电纺丝得到的壳聚糖纺丝膜(对比例1)为脆性断裂；而聚乳酸-羟基乙酸共聚物纤维膜(对比例2)为典型的韧性断裂，即在拉伸过程中有屈服点的出现，而且有较长的屈服平台；本发明的壳聚糖基神经纤维膜的拉伸行为与壳聚糖纺丝膜的拉伸行为相似，但是由于添加了壳聚糖、聚乳酸-羟基乙酸共聚物、碳纳米管等组分，其拉伸强度、杨氏模量和断裂伸长率都有所提高，明显优于壳聚糖纺丝膜；从图5还可以看到，由于实施例1、2、3样品的平均曲线相互重合，说明本发明的壳聚糖基神经纤维膜的力学性能均一性良好。

2.雪旺细胞的细胞生长形态验证

根据力学性能测试结果，仅对实施例1、对比例1、对比例2的膜进行雪旺细胞的生长形态测试验证，具体如下：

(1).将实施例1、对比例1、对比例2得到的膜分别裁剪至24孔板大小，于体积分数为75％的乙醇浸泡6h灭菌处理，之后用磷酸缓冲盐溶液(PBS)清洗3次，去除残留的乙醇。在每张膜上接种雪旺细胞，细胞接种量为每张膜1万个细胞。

(2).体外分别培养3天后，用体积分数为4％多聚甲醛对细胞固定2h，之后用PBS清洗3次，再用稀释500倍的聚乙二醇辛基苯基醚(Triton-X100)处理10min，用PBS清洗三次后加入罗丹明标记鬼笔环肽(1:200稀释)避光处理40min，对细胞骨架染色，用PBS清洗3次，加入4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI，稀释100倍)避光处理5～10min，对细胞核进行染色。染色结束后，用PBS清洗3次，在荧光显微镜下观察细胞形态，结果见附图6。

由图6可知，对比例1(对应图6a)、对比例2(对应图6b)、实施例1(对应图6c)的膜上，雪旺细胞基本沿着纤维的方向生长。在对比例1获得的膜上表现出良好的增殖效果，但由于单纯的CS膜为无规排列，所以生长方向不是特别一致。在对比例2膜上的增殖效果不是特别好。雪旺细胞在实施例1的壳聚糖基神经纤维膜表现出良好的增殖效果，并表现出更成熟的细胞形貌，细胞变得更加细长，细胞排列生长的更加有序。

而由于雪旺细胞通常会在神经损伤后迁移并有序形成Büngner带，从而引导轴突再生，因此可以预测实施例1的壳聚糖基神经纤维膜对促进雪旺细胞髓鞘形成有潜在作用，对神经突触的延伸有促进作用。

3.纤维膜卷制成型效果实验

将实施例1获得的壳聚糖基神经纤维膜剪成所需的长条形，将其人工卷绕到玻璃棒上，卷绕过程中控制纤维的方向与圆棒的长轴方向一致，并且应避免纤维形貌不受破坏，尽量保证层与层之间的贴合，减小层间缝隙，卷绕后利用二氯甲烷对结合处进行黏结，然后将其放在真空干燥箱内24h，即可得到轴向取向的神经导管，具体卷制成型的神经导管如图7所示。

从图7可知，本发明的壳聚糖基神经纤维膜可以制成所需的神经导管，并且卷制成的神经导管几乎无缺损。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (15)

1.一种壳聚糖基神经纤维膜，其特征在于，所述壳聚糖基神经纤维膜由若干取向排列的复合纳米纤维形成；每根所述复合纳米纤维呈现芯壳状结构；

以所述复合纳米纤维的质量含量为100.0000％计，包含以下组分：

所述复合纳米纤维的壳层材料包含所述可降解功能材料、亲水官能团修饰的碳纳米管、枸杞多糖、以及壳聚糖和/或壳聚糖衍生物；

所述复合纳米纤维的芯层材料包含神经生长因子和稳定剂。

2.如权利要求1所述的壳聚糖基神经纤维膜，其特征在于，所述壳聚糖和/或壳聚糖衍生物的脱乙酰度不低于80％；和/或，

所述可降解的功能材料选自聚乳酸、聚羟基乙酸、聚乳酸-羟基乙酸共聚物、聚己内酯、聚-3-羟基丁酸、聚乙交酯、左旋聚乳酸胶原蛋白、丝素蛋白、层粘连蛋白、明胶中的任一种；和/或，

所述亲水官能团修饰的碳纳米管中，碳纳米管为单壁碳纳米管、多壁碳纳米管中的至少一种。

3.如权利要求2所述的壳聚糖基神经纤维膜，其特征在于，所述聚乳酸-羟基乙酸共聚物中，乳酸单体和羟基乙酸单体的质量比为(75:25)～(85:15)。

4.如权利要求1或2所述的壳聚糖基神经纤维膜，其特征在于，所述亲水官能团修饰的碳纳米管中亲水官能团选自羧酸基、磺酸基、磷酸基、氨基、季铵基、醚基、羧酸酯基、嵌段聚醚中的至少一种。

5.如权利要求1或2所述的壳聚糖基神经纤维膜，其特征在于，所述壳聚糖和/或壳聚糖衍生物的分子量为10kDa～30kDa；

所述壳聚糖衍生物选自羧甲基壳聚糖、季铵盐壳聚糖中的至少一种。

6.如权利要求1所述的壳聚糖基神经纤维膜，其特征在于，所述稳定剂为牛血清白蛋白；

和/或，

所述复合纳米纤维的壳层中还含有乳化剂；

和/或，

所述亲水官能团修饰的碳纳米管的直径不超过20nm，长度不超过30μm。

7.如权利要求1或2所述的壳聚糖基神经纤维膜，其特征在于，所述壳聚糖基神经纤维膜的厚度不超过0.5mm。

8.如权利要求1或2所述的壳聚糖基神经纤维膜，其特征在于，所述壳聚糖基神经纤维膜采用增材制造技术得到；所述增材制造技术包括静电纺丝技术、3D打印技术。

9.如权利要求8所述的壳聚糖基神经纤维膜，其特征在于，所述静电纺丝技术为同轴静电纺丝技术。

10.如权利要求1所述的壳聚糖基神经纤维膜，其特征在于，所述复合纳米纤维的直径不超过1000nm。

11.一种如权利要求1～10任一项所述的壳聚糖基神经纤维膜的制备方法，包括以下步骤：

提供包含可降解功能材料、亲水官能团修饰的碳纳米管、枸杞多糖、以及壳聚糖和/或壳聚糖衍生物的A溶液，以及包含神经生长因子和稳定剂的B溶液；

采用同轴静电纺丝技术对所述A溶液和B溶液进行纺丝处理，控制所述A溶液的推进速度为(1.0～1.8)mL/h，所述B溶液的推进速度为(0.1～0.2)mL/h，针头到收集装置的距离为(10～15)cm，经纺丝获得由取向排列的复合纳米纤维构成的壳聚糖基神经纤维膜；

其中，所述A溶液和B溶液中各组分的浓度应保证经同轴静电纺丝后获得的取向排列的复合纳米纤维质量总含量为100％计时，各组分的含量满足以下条件：

12.如权利要求11所述的壳聚糖基神经纤维膜的制备方法，其特征在于，所述同轴静电纺丝的负载电压为(14～18)kV，收集装置的转速为(2000～3000)rpm。

13.如权利要求11所述的壳聚糖基神经纤维膜的制备方法，其特征在于，所述A溶液中亲水官能团修饰的碳纳米管的质量浓度不超过10％，亲水官能团修饰的碳纳米管的直径不超过20nm，长度不超过30μm；和/或，

所述A溶液中还含有乳化剂。

14.一种神经导管，其特征在于，所述神经导管由权利要求1～10任一项所述的壳聚糖基神经纤维膜经卷制成型；

或者，由如权利要求11～13任一项所述的壳聚糖基神经纤维膜的制备方法制备得到的壳聚糖基神经纤维膜经卷制成型；

所述神经导管的轴向方向与所述壳聚糖基神经纤维膜中取向排列的复合纳米纤维的取向方向一致。

15.如权利要求14所述的神经导管在人体及动物神经损伤修复、再生中的应用。

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