CN102784413A - 一种复合生物神经导管的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种复合生物神经导管的制备方法，包括下述步骤：a、芯层溶液的制备：将神经营养因子，如神经生长因子、层粘连蛋白用磷酸缓冲液配成一定浓度的芯层溶液；b、壳层溶液的制备：分别制备壳聚糖溶液和碳纳米溶液，按比例混合，超声（功率300-360w）处理，使均匀分布，得壳层溶液；c、壳聚糖-碳纳米管膜的制备：采用静电纺丝技术，将壳层和芯层溶液纺织成管膜，工艺条件：喷丝头与高速旋转滚筒的距离为10-18cm，纺丝电压为7-12kv，旋转滚筒转速为3000-4500rpm，制得管膜；d、将管膜缝合，制成复合生物神经导管。具有良好的导电性和机械性能，对神经损伤的修复有很好的促进作用，且制备方法简单易行，成本低廉。

Description

一种复合生物神经导管的制备方法
技术领域
本发明涉及生物医用材料领域，具体指一种复合生物神经导管的制备方法。 
背景技术
对于周围神经缺损，自体神经移植仍是目前修复的“金标准”。但其存在再生速度慢、自体神经取材来源有限、供体与受体神经直径不匹配等缺点，因此，制备理想的神经导管促进神经再生成为神经修复的关键。 
生物体内普遍存在的生物电活动在维持正常生理功能方面必不可少，如神经系统的信号传导、肌肉收缩以及伤口愈合等。周围神经并非单纯的组织学结构，它除了输送神经营养物质，还传递电生理信号。神经修复后虽然有大量再生神经纤维，但功能恢复欠佳，这与运动终板等靶器官因失去电刺激而萎缩，进而失去再生功能有关。因此，神经损伤修复过程中，材料的导电性是决定神经修复效果的重要因素之一。具有导电性的生物材料可调节神经细胞的粘附，增殖和分化。Brett等（Brett RM,Mahrokh D,Jonas B,et al.Development of electically conductive oligo(polyethylene glycol)fumarate-poly pyrrole hydrogels for nerve regeneration.Biomacromolecules.2010,11(11):2845-2853.）研究发现，电刺激培养在聚吡咯酸（一种导电性生物材料）上的PC-12细胞与未经过电刺激培养的对照组相比，其神经伸长程度大大增加，较对照组增加达90%。 
目前，现有的神经导管虽然能促使损伤在一定程度的神经自行修复，但由于神经导管缺乏导电性，其再生纤维的形态及功能修复的效果都不甚理想。 
发明内容
本发明的目的是提供是提供一种多孔型壳聚糖-碳纳米管神经的制备方法，该方法制备神经导管具有良好的导电性和机械性能，对神经损伤的修复有很好的促进作 用，且制备方法简单易行，成本低廉。 
本发明是这样实现的，该复合生物神经导管的制备方法，包括下述步骤： 
a、芯层溶液的制备：将神经营养因子，如神经生长因子、层粘连蛋白用磷酸缓冲液（pH7.4）配成一定浓度的溶液；或将雪旺氏细胞、神经干细胞、脂肪干细胞用磷酸缓冲液(pH7.4)配成一定细胞密度的细胞悬液，即为芯层溶液； 
b、壳层溶液的制备：分别制备壳聚糖溶液和碳纳米溶液，将两种溶液按比例混合后，采用超声（功率300-360w）处理，使碳纳米管与壳聚糖充分混合，并均匀分布，得到壳聚糖/碳纳米壳层溶液； 
c、多孔型壳聚糖-碳纳米管膜的制备：采用同轴静电纺丝技术，将壳层和芯层溶液纺织成多孔型壳聚糖-碳纳米管膜，调节壳层和芯层给液速度，即得多孔型壳聚糖-碳纳米管膜； 
d、将制备的多孔型壳聚糖-碳纳米管膜用8-0显微缝线缝合，制成复合生物神经导管。 
所述的壳层溶液中碳纳米管的含量达3-5wt%。 
由于壳聚糖具有良好的可降解性和促细胞黏附性，碳纳米管具有良好的导电性和机械性能，壳聚糖和碳纳米管都是具有良好的生物相容性，分别制备壳聚糖溶液和碳纳米溶液，将两种溶液按比例混合后，采用超声（功率300-360w）处理，使碳纳米管与壳聚糖充分混合，并均匀分布，在碳纳米管的一定浓度下，两者制成的复合材料，既能提高材料的生物相容性也能提高材料的导电性和机械性能同时又具有生物降解性，当电刺激并匹配有导电性纳米纤维时神经生长长度大大增加，表明电刺激与导电性纳米生物材料有协同作用，将生物导电可降解神经导管与神经营养因子有机结合，可导电的支架材料和相关神经营养因子（细胞）的共同作用下，具有良好的导电性和机械性能，对神经损伤的修复有很好的促进作用，且制备方法简单易行，成本低廉。在修复神经的结构的同时还修复其感觉和运动功能。 
表1超声波功率、纳米管浓度与皮层溶液电导率实验数据 
Figure DEST_PATH_BDA00002092260300031
从表1看出，当壳聚糖-碳纳米管的混合液中，碳纳米管的含量为3wt%、4wt%、5wt%时，用不同功率的超声波处理溶液，其电导率有明显差异，其中，在300-360w的功率范围内，其电导率较高。 
表2电导率与形态、运动功能、感觉功能修复对照表 
从表2中可以看出，神经损伤修复时，材料的导电性为0时，损伤神经的形态、运动和感觉功能的修复水平都相对较低，但随着材料导电性能的增加，其修复水平逐渐升高，当材料的导电性达到10-3s/cm时，其修复水平显著的高于无导电性的材 料。 
附图说明：
图1为电导率与碳纳米管的浓度含量关系图 
具体实施方式
参见图1，电导率与碳纳米管与壳聚糖混合均匀分布程度及碳纳米管的浓度含量有关，电导率用BD-86A型四探针式电导率测试仪在室温下测定。 
该复合生物神经导管的制备方法，包括下述步骤： 
a、芯层溶液的制备：将神经营养因子，如神经生长因子、层粘连蛋白用磷酸缓冲液（pH7.4）配成一定浓度的溶液；或将雪旺氏细胞、神经干细胞、脂肪干细胞用磷酸缓冲液(pH7.4)配成一定细胞密度的细胞悬液，即为芯层溶液； 
b、壳层溶液的制备：分别制备壳聚糖溶液和碳纳米溶液，将两种溶液按比例混合后，采用超声（功率300-360w）处理，使碳纳米管与壳聚糖充分混合，并均匀分布，得到壳聚糖/碳纳米壳层溶液； 
c、多孔型壳聚糖-碳纳米管膜的制备：采用同轴静电纺丝技术，将壳层和芯层溶液纺织成多孔型壳聚糖-碳纳米管膜，同轴静电纺丝工艺条件：喷丝头与高速旋转滚筒接收装置的距离为10-18cm，纺丝电压为7-12kv，旋转滚筒的转速为3000-4500rpm，调节壳层和芯层给液速度，制得多孔型壳聚糖-碳纳米管膜； 
d、将制备的多孔型壳聚糖-碳纳米管膜用8-0显微缝线缝合，制成复合生物神经导管。 
所述的壳层溶液中碳纳米管的含量达3-5wt%。 
所述的壳层给液速率为1.0-1.3mL/h。 
所述的芯层给液速率为0.1-0.3mL/h左右。 
实施例1 
将0.1mg层粘连蛋白溶于10ml磷酸缓冲液（0.05mol/L,pH7.4）中，配成10μg/ml 的神经营养因子芯层溶液。将2g碳纳米管加入120mL混酸溶液中(浓H2SO4与浓HNO3体积比为3∶1)，超声（300w）分散2～3h，然后在室温磁力搅拌120h，进行氧化。通过0.22Ixm的聚碳酸酯滤纸真空抽滤混合物，再由去离子水洗涤至pH值为7。处理后的碳纳米在80℃真空干燥24h。所得样品研磨过筛后备用。将700mg壳聚糖溶解于10mL的稀醋酸溶液(pH＝2)中，然后加入300mg纯化后的碳纳米管，将混合液超声分散2h，然后加入聚乙烯醇(PVA)的2w/v%冰酸溶液并充分搅拌，得到碳纳米管浓度为3wt%的皮层溶液。同轴静电纺丝条件：设定芯层溶液的给液速率0.3mL/h，喷丝头直径为0.6mm，壳层溶液给液速率为1.0mL/h，喷丝头直径为1.1mm；电压为10kv，接收距离为17cm；高速旋转滚筒的接受速率为4000rpm，得到卷曲的多孔型壳聚糖-碳纳米管膜。 
将制备的卷曲的多孔型壳聚糖-碳纳米管膜用8-0显微缝线缝合，制成多孔型壳聚糖-碳纳米神经导管。神经导管的长度为1.7cm,内径为1.2mm，管壁厚0.5mm。用BD-86A型四探针式电导率测试仪在室温下测定其电导率为10-8s/cm。 
实施例2 
将0.01mg神经生长因子（NGF）和0.01mg层粘连蛋白（LN）溶于10ml磷酸缓冲液（0.05mol/L,pH7.4）中，制成的神经营养因子芯层溶液。将2g碳纳米管加入120mL混酸溶液中(浓H2SO4与浓HNO3体积比为3∶1)，超声（325w）分散2～3h，然后在室温磁力搅拌120h，进行氧化。通过0.22Ixm的聚碳酸酯滤纸真空抽滤混合物，再由去离子水洗涤至pH值为7。处理后的碳纳米在80℃真空干燥24h。所得样品研磨过筛后备用。将600mg壳聚糖溶解于10mL的稀醋酸溶液(pH＝2)中，然后加入400mg纯化后的碳纳米管，将混合液超声分散2h，然后加入聚乙烯醇(PVA)的2w/v%冰乙酸溶液并充分搅拌，得到碳纳米管浓度为4wt%的皮层溶液。同轴静电纺丝条件：设定芯层溶液的给液速率0.3mL/h，喷丝头直径为0.7mm，壳层溶液给液速率为1.3mL/h，喷丝头直径为1.5mm；电压为10kv，接收距离为 15cm；高速旋转滚筒的接受速率为4000rpm，得到卷曲的多孔型壳聚糖-碳纳米管膜。 
将制备的卷曲的多孔型壳聚糖-碳纳米管膜用8-0显微缝线缝合，制成多孔型壳聚糖-碳纳米神经导管。神经导管的长度为1.5cm,内径为1.4mm，管壁厚0.8mm。用BD-86A型四探针式电导率测试仪在室温下测定其电导率为10-5s/cm。 
实施例3 
将0.01mg成纤维细胞生长因子（FGF）溶于10ml磷酸缓冲液（0.05mol/L,pH7.4）中，配成神经营养因子芯层溶液。将2g碳纳米管加入120mL混酸溶液中(浓H2SO4与浓HNO3体积比为3∶1)，超声（350w）分散2～3h，然后在室温磁力搅拌120h，进行氧化。通过0.22Ixm的聚碳酸酯滤纸真空抽滤混合物，再由去离子水洗涤至pH值为7。处理后的碳纳米在80℃真空干燥24h。所得样品研磨过筛后备用。将700mg壳聚糖溶解于10mL的稀醋酸溶液(pH＝2)中，然后加入500mg纯化后的碳纳米管，将混合液超声分散2h，然后加入聚乙烯醇(PVA)的2w/v%冰乙酸溶液并充分搅拌，得到碳纳米管浓度为5wt%的皮层溶液。同轴静电纺丝条件：设定芯层溶液的给液速率0.3mL/h，喷丝头直径为0.6mm，壳层溶液给液速率为1.0mL/h，喷丝头直径为1.1mm；电压为10kv，接收距离为17cm；高速旋转滚筒的接受速率为4000rpm，得到卷曲的多孔型壳聚糖-碳纳米管膜。 
将制备的卷曲的多孔型壳聚糖-碳纳米管膜用8-0显微缝线缝合，制成多孔型壳聚糖-碳纳米神经导管。神经导管的长度为1.7cm,内径为1.2mm，管壁厚0.5mm。用BD-86A型四探针式电导率测试仪在室温下测定其电导率为10-3s/cm。 

Claims (4)

1. 一种复合生物神经导管的制备方法，其特征是： 包括下述步骤： 
a、芯层溶液的制备：将神经营养因子，如神经生长因子、层粘连蛋白用磷酸缓冲液（pH7.4）配成一定浓度的溶液；或将雪旺氏细胞、神经干细胞、脂肪干细胞用磷酸缓冲液(pH7.4)配成一定细胞密度的细胞悬液，即为芯层溶液；
b、壳层溶液的制备：分别制备壳聚糖溶液和碳纳米溶液，将两种溶液按比例混合后，采用超声（功率300-360w）处理，使碳纳米管与壳聚糖充分混合，并均匀分布，得到壳聚糖/碳纳米壳层溶液；
c、多孔型壳聚糖-碳纳米管膜的制备：采用同轴静电纺丝技术，将壳层和芯层溶液纺织成多孔型壳聚糖-碳纳米管膜，调节壳层和芯层给液速度，制得多孔型壳聚糖-碳纳米管膜；
d、将制备的多孔型壳聚糖-碳纳米管膜用8-0显微缝线缝合，制成复合生物神经导管。
2.根据专利要求1所述的复合生物神经导管的制备方法，其特征是所述的壳层溶液中碳纳米管的含量达3-5 wt%。
3.根据权利要求1所述的复合生物神经导管的制备方法，其特征是所述的壳层给液速率为1.0-1.3mL/h。
4.根据权利要求1所述的复合生物神经导管的制备方法，其特征是所述的芯层给液速率为0.1-0.3mL/h左右。
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