CN102274510A

CN102274510A - 碳纳米管-壳聚糖-藻蓝蛋白纳米粒的制备方法

Info

Publication number: CN102274510A
Application number: CN 201110197971
Authority: CN
Inventors: 张学武; 廖晓霞
Original assignee: South China University of Technology SCUT
Current assignee: South China University of Technology SCUT
Priority date: 2011-07-15
Filing date: 2011-07-15
Publication date: 2011-12-14
Anticipated expiration: 2031-07-15
Also published as: CN102274510B

Abstract

本发明提供碳纳米管-壳聚糖-藻蓝蛋白纳米粒的制备方法，该纳米粒材料使用羧化碳纳米管，通过水溶性壳聚糖非共价修饰碳纳米管，制备得到水溶性的多壁碳纳米管-壳聚糖(MWCNT-CS)复合物，并在此基础上将复合物再与高纯度的螺旋藻藻蓝蛋白偶合，得到生物医学材料碳纳米管-壳聚糖-藻蓝蛋白纳米粒(MWCNT-CS-PC)。本方法制备工艺简单，获得的生物医学材料水溶性和生物相容性好，在可见光和近红外光区都具有良好的吸收特性，有望应用于癌细胞的光动力和光热治疗。

Description

碳纳米管-壳聚糖-藻蓝蛋白纳米粒的制备方法

技术领域

本发明涉及碳纳米管复合材料的制备方法，特别是涉及碳纳米管-壳聚糖-藻蓝蛋白纳米粒的制备方法。

背景技术

藻蓝蛋白（Phycocyanin，以下简称PC）是一种普遍存在于蓝藻、红藻、隐藻和少数甲藻中的捕光色素蛋白，在螺旋藻中的含量高达7%~20%。PC作为无毒副作用的天然色素蛋白，可取代合成染料应用于食品、化妆品以及医药中。有研究表明，PC具有抗肿瘤活性，可提高免疫机能。特别是PC经可见光区激光照射后，可对人类癌细胞产生光动力杀伤效应，即有光动力治疗(Photodynamic therapy，PDT)的潜力。

碳纳米管（carbon nanotube，以下简称CNT）是由碳原子形成的石墨烯片层卷曲而成的无缝中空碳管，分为单壁碳纳米管（single-wall carbon nanotube，以下简称SWCNT）和多壁碳纳米管（multi-wall carbon nanotube，以下简称MWCNT）。CNT在生物医药中的应用是一个新兴和前沿的领域，也是纳米生物技术的一个研究热点。因为CNT独特的性质，人们开始挖掘它的各种应用价值，包括在肿瘤治疗中的应用。CNT的一个特点是可以跨越细胞膜和生物体内的多种屏障，到达多种器官并进入到细胞的内部。CNT的另外一个特点就是经近红外光照射后，能释放大量的振动能。所释放的这些能量可以使组织产生局部热量，从而使CNT具有可能应用于癌症治疗的潜力，即光热治疗(Photothermal therapy，PTT)。

然而，原始状态的CNT进入生物体之后，不能溶解于生理体液中，反而容易聚集在细胞、器官和组织中，可能会引起不良反应，因此CNT在中性溶液中的溶解与分散一直是人们所关心的重要问题。最近的研究表明，通过共价或者非共价改性解决CNT的水溶性问题，不仅生物相容性得到提高，而且CNT可以经肾脏途径代谢，通过尿液排除体外。

发明内容

为解决上述相关技术的不足和缺陷，同时拓展CNT在生物医学领域的应用，本发明的目的是提供碳纳米管-壳聚糖-藻蓝蛋白纳米粒的制备方法。

本发明中所采用的壳聚糖（Chitosan，以下简称CS）是甲壳质经脱乙酰反应后的产品，其结构单元上有一个高反应的氨基，可以方便的引入其他功能性基团。CS作为一种常见的天然高分子，在生物材料的研究中得到了广泛的应用，其良好的生物相容性已经得到认可。通过CS对CNT非共价改性，一方面，有望改善CNT的生物相容性，另外一方面可方便的引入其他功能性分子，为扩大CNT在生物医学领域的应用奠定了基础。

本发明多提供的碳纳米管-壳聚糖-藻蓝蛋白纳米粒是由羧基化碳纳米管、水溶性壳聚糖和藻蓝蛋白复合而成，其制备步骤如下：

（1）将羧基化多壁碳纳米管()分散在磷酸缓冲液中，经超声振荡30分钟～90分钟后，再加入水溶性壳聚糖，超声振荡并充分搅拌均匀后，得混合溶液；然后静置分层，将分层后的上层液离心分离，得到的上层液即为壳聚糖修饰的水溶性多壁碳纳米管溶液；所述羧基化多壁碳纳米管和水溶性壳聚糖的质量比为1:1～1:10；

（2）向步骤（1）得到的水溶性多壁碳纳米管溶液中加入相当于羧基化多壁碳纳米管质量1～5倍的碳二亚胺盐酸盐和相当于羧基化多壁碳纳米管质量1～6倍的N-羟基琥珀酰亚胺，避光下充分搅拌，继续保持避光条件，再加入藻蓝蛋白粉末，于10℃～25℃恒温振荡8小时～15小时；将振荡后溶液过滤，所得滤饼即为碳纳米管-壳聚糖-藻蓝蛋白纳米粒；所述藻蓝蛋白粉末与羧基化多壁碳纳米管的质量比为1:1～1:10。

为进一步实现本发明目的，步骤（1）所述的羧基化多壁碳纳米管纯度为90%~99%，直径为10 nm～20nm，长度为0.5μm～2μm，羧化率：1wt%～10 wt%（重量百分率）。

为进一步实现本发明目的，步骤（1）所述水溶性壳聚糖的羧化度为0.1%～1%，分子量为500～10000。

为进一步实现本发明目的，步骤（1）所述藻蓝蛋白的纯度为4.0～6.0(A620/A280, 在波长620 nm 与280 nm的吸光度之比)。

为进一步实现本发明目的，步骤（1）所述的磷酸缓冲液为磷酸钠缓冲液或2mM～5mM（毫摩尔）磷酸钾缓冲液。

为进一步实现本发明目的，步骤（2）得到的振荡后混合溶液采用分子量为10kD～100kD（千道尔顿）的超滤管超滤。

以上操作步骤如无特别说明，均按本领域常规操作。

与现有技术相比，本发明具有如下优点：

（1）本发明所制备的纳米粒复合材料将具有藻蓝蛋白的光动力治疗潜力；

（2）本发明所制备的纳米粒复合材料将具有碳纳米管的光热治疗潜力；

（3）本发明引入水溶性壳聚糖进行修饰，增加了该纳米例复合材料的生物相容性；

（4）本发明的制备方法工艺简单，易于大量制备，且制备出的碳纳米粒复合材料稳定性好。

附图说明

图1（a）为实施例1所制备的中间样品MWCNT-CS的Zeta电位分布曲线图；

图1（b）为实施例1所制备的产品碳纳米管-壳聚糖-藻蓝蛋白纳米粒MWCNT-CS-PC的Zeta电位分布曲线图；

图2（a）为实施例1所制备的中间样品MWCNT-CS的粒度分布曲线图；

图2（b）为实施例1所制备的产品MWCNT-CS-PC的粒度分布曲线图；

图3（a）为MWCNT表面形貌的FESEM图;

图3（b）为实施例1所制备的中间样品MWCNT-CS表面形貌的FESEM图;

图3（c）为实施例1所制备的产品MWCNT-CS-PC表面形貌的FESEM图;

图4为实施例1所制备的中间样品MWCNT-CS和产品MWCNT-CS-PC的紫外可见全波长扫描谱图；

图5 为多壁碳纳米管MWCNT以及实施例1所制备的中间样品MWCNT-CS和产品MWCNT-CS-PC的红外谱图；

图6 为MWCNT以及实施例1所制备的中间样品MWCNT-CS和产品MWCNT-CS-PC的拉曼谱图；

图7（a）为MWCNT的TGA曲线图；

图7（b）为壳聚糖CS的TGA曲线图；

图7（c）为藻蓝蛋白C-PC的TGA曲线图；

图7（d）为MWCNT-CS-PC的TGA曲线图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步的详细描述，但具体实施方式不应理解为是对本发明保护范围的限定。

实施例1

生物医学材料碳纳米管-壳聚糖-藻蓝蛋白纳米粒的制备方法，步骤如下：

（1）称取40mg直径为10nm的羧基化碳纳米管粉末（羧化率为1wt%），加入150ml 5mM PBS溶液中，超声分散60分钟，然后加入170mg 水溶性壳聚糖CS，继续超声振荡60分钟，超声后对混合溶液磁力搅拌1小时。静置分层6小时后，取上层液体在10000r/min的转速下高速离心，离心后的上层液即为中间样品：壳聚糖修饰的水溶性多壁碳纳米管均一溶液（MWCNT-CS）。采用30kD的超滤管超滤去除MWCNT-CS中富余的CS，将所得滤饼冷冻干燥，作为表征分析的样品；

（2）在搅拌条件下，向制得的水溶性多壁碳纳米管溶液中加入70mg碳二亚胺盐酸盐（EDC-HCl）和160mg N-羟基琥珀酰亚胺（NHS），避光继续搅拌30分钟，在避光条件下加入35 mg高纯度PC粉末，于20℃恒温振荡15h。振荡后溶液采用80kD的超滤管超滤去除多余的PC、EDC-HCl和NHS。所得滤饼即为碳纳米管-壳聚糖-藻蓝蛋白纳米粒样品（MWCNT-CS-PC）。将样品冷冻干燥用于表征分析。

对步骤（1）和（2）所得的样品进行稳定性实验，分别将制备得到的MWCNT-CS和MWCNT-CS-PC以及MWCNT分散到水中，静置一周后， MWCNT发生了明显的聚沉现象，而经CS非共价修饰的MWCNT-CS和MWCNT-CS-PC在水中表现出很好的分散性，即使放置几个月也不会发生明显的聚沉现象，表现出良好的水溶性和稳定性。

采用激光粒度仪分别对步骤（1）和（2）所得的样品进行Zeta电位值及平均粒径进行检测。通常情况下，Zeta 电位绝对值越高，体系分散稳定性越好。从图1（a）和图1（b）可以看出，MWCNT-CS-PC在水溶液中的Zeta电位分布峰为62.2mV，MWCNT-CS的Zeta 电位分布峰为49.6mV，说明MWCNT-CS-PC在水溶液中具有较好的稳定性。据文献报道，碳纳米管在水溶液中的Zeta点位分布峰非常低，为1.945mV。这也解释了MWCNT极易发生团聚沉降，而MWCNT-CS和MWCNT-CS-PC分散性很好的原因。从激光粒度仪检测得到的MWCNT-CS和MWCNT-CS-PC的粒度分布见图2（a）和图2（b）。MWCNT-CS和MWCNT-CS-PC水溶液中超过90%颗粒的尺寸小于200nm，其平均粒径分别为185.6nm和233nm。这样尺寸范围内的MWCNT，有利于其在生物体系中的研究。

分别对步骤（1）和（2）所得的样品进行场发射扫描电镜分析，采用 Scanning electron microscope，SEM，JEOL JSM-7401F，将样品的稀溶液点到导电硅片上，待溶剂挥发后观察。从图3（a）至图3（c）中可以看出，MWCNT、MWCNT-CS、MWCNT-CS-PC都呈管状结构，但是MWCNT表面没有任何覆盖物，比较光滑，而MWCNT-CS和MWCNT-CS-PC则由于CS的包覆和PC的连接而显得相对粗糙。另外，由于聚合物链间的相互作用，使得形成的纳米粒复合物有一定程度的缠结。在管径方面，MWCNT<MWCNT-CS<MWCNT-CS-PC，这与激光粒度仪所得的粒度分布结果一致。这表明MWCNT表面存在CS和PC。此外，由于CS覆盖层的静电排斥作用，使被包裹的MWCNT的团聚减少。

步骤（1）和（2）所得的样品进行紫外可见光吸收光谱（UV-vis）分析，采用日本日立公司的UV2300型紫外可见光谱仪，将样品分散在0.5mM PBS溶液中，将超声振荡下形成的均匀分散液倒入到比色池中进行全波长扫描分析。由于PC在620nm处具有最大特征吸收峰，可据此推断PC与MWCNT是否成功结合。从MWCNT-CS谱图(图4)可以看出，在620nm处无吸收峰，而MWCNT-CS-PC在此处有特征吸收峰，由此可知，藻蓝蛋白与碳纳米管成功结合。此外，MWCNT-CS和MWCNT-CS-PC的吸收谱图(图4)除了620nm处的区别外，大致相同，可知MWCNT的光学性质没有受到明显的影响。虽然MWCNT被修饰后其光学特性稍有变化，但是在808nm处依然有足够高的吸光强度，可作为热电偶联剂，在808nm的近红外激光辐照下产生足够的热量来杀伤癌细胞。

步骤（1）和（2）所得的样品进行红外光谱（FTIR）分析，采用美国 Thermo Nicolet公司的 Nexus670型傅立叶变换红外光谱扫描仪，粉末样品经充分干燥后与溴化钾一起研磨压制成片，然后将所制的片在红外灯下烘烤30分钟后放入仪器的样品室进行扫描测试。如图5所示。MWCNT在1712 cm^-1、3461cm^-1处出现吸收峰，分别对应于羧基和羟基，表明所购买的羧化碳纳米管表面有羧酸(-COOH)和羧酸根(-COO-)基团。这些活性基团都是亲水性基团，有助于MWCNT分散在水溶液中，同时这些功能基团将为CS非共价修饰MWNT提供一个静电反应的微环境。

CS是甲壳质经脱乙酰反应后的产品，其结构单元上有一个高反应活性的氨基，可以方便的引入其他功能性基团。在MWCNT-CS的红外谱图中，可见CS的特征吸收峰。位于1650cm^-1的峰是C=O振动吸收峰；位于1080cm^-1的峰是桥环C-O-C振动吸收峰，1520cm^-1的峰是N-H变性振动峰；位于1126cm^-1的峰是糖苷键的特征振动峰。位于3460cm^-1的峰是O-H伸缩振动峰，此处峰强度明显高于MWCNT；将MWCNT-CS和MWCNT的红外谱图进行对比，发现MWCNT-CS中MWCNT的吸收峰有部分消失殆尽，这主要因为MWCNT的红外吸收相对较弱，被吸收较强的CS吸收所覆盖。这表明CS成功的缠绕在MWCNT表面。

藻蓝蛋白C-PC在533 cm^-1、1654 cm^-1、3441cm^-1附近有较大的红外吸收峰，MWCNT-CS-PC纳米粒的红外谱图显示，在533 cm^-1、1654 cm^-1、3441cm^-1附近亦有较明显的吸收峰，可以看出该制备的纳米粒复合物中具有MWCNT、CS和PC各自对应的特征红外谱峰。实验结果表明最终制备得到了载有藻蓝蛋白的多壁碳纳米管，即MWCNT-CS-PC。

步骤（1）和（2）所得的样品进行拉曼光谱分析，采用Invia Raman Microscope，激光波长为512 nm。从图 6中可以看到MWCNT有两个显著的峰1570cm^-1和1340cm^-1，前者是G峰，是石墨晶体sp2结构的特征峰，反映高对称性和高定向性的石墨结构；后者为D峰，是石墨晶体颗粒减小而出现的无序态或缺陷态特征峰。非共价修饰的碳纳米管MWCNT-CS和MWCNT-CS-PC，其拉曼光谱在1570cm^-1附近也有强烈的共振拉曼光谱峰，即为G峰，是石墨碳的特征峰。可知，复合物中，MWCNT的特性依然存在。同时G峰与D峰强度的比值也反映了碳纳米管管状结构的损坏程度。从图6中可以得出羧化碳纳米管MWCNT中IG/ID=6.45，进一步非共价修饰后的碳纳米管纳米粒复合物MWCNT-CS中IG/ID=2.18，MWCNT-CS-PC中IG/ID=1.47。IG/ID越小，说明碳纳米管管壁上C的sp3杂化结构增加，缺陷较多，反应位点多。与MWCNT相比，复合物MWNT-CS和MWNT-CS-PC的拉曼光谱发生红移，分别由1340cm^-1红移至1334 cm^-1和1347cm^-1。在1570cm^-1附近，所制备的纳米粒复合物和碳纳米管的峰位置没有明显的改变，但峰强度和峰面积与碳纳米管相应峰的强度和峰面积之间有区别，这同样说明了碳纳米管和壳聚糖及藻蓝蛋白之间具有某种相互作用。

步骤（1）和（2）所得的样品进行热失重分析（TGA），采用德国Nicolet instrument公司的TASC 414/4型热重分析仪，氮气流速为20ml/min，升温速度为10℃/min。从图 7（a）至图 7（d）中可以看到, 原始MWCNT热性能比较稳定，在100℃到550℃范围内显示较少的质量损失，仅为1%左右。在550℃到800℃高温范围内才能观察到可见的质量降低趋势。对于纯壳聚糖，热降解分两步进行，在100℃之前，有一个小的失重过程，失重约为14%，这是物料含的结晶水和结合水产生的。壳聚糖在190℃到300℃之间发生强烈降解。对于藻蓝蛋白，热失重主要发生在250℃到375℃之间。对于复合物MWCNT-CS-PC，从100℃-150℃热稳定性较好，从150℃到400℃出现了一个明显的失重台阶，纳米粒复合物的质量迅速下降，质量损失将近45%，高于400℃部分的热重曲线的形状非常类似于原始MWCNT在该温度阶段的曲线走向，这意味着在400℃左右就已经基本完成了纳米粒复合物的分解。从图7（d）中可以估算出所制备的纳米粒复合物MWCNT-CS-PC中MWCNT的含量约为55%。

实施例2

（1）称取20mg直径为20nm的羧基化碳纳米管粉末（羧化率为5wt%），加入120ml 5mM PBS溶液中，超声分散60分钟，然后加入130mg 水溶性壳聚糖CS，继续超声振荡40分钟，超声后对混合溶液磁力搅拌70分钟。静置分层8小时后，取上层液体在10000r/min的转速下高速离心，离心后的上层液即为壳聚糖修饰的中间样品：水溶性多壁碳纳米管（MWCNT-CS）均一溶液。采用20kD的超滤管超滤去除MWCNT-CS中富余的CS，将所得滤饼冷冻干燥，作为表征分析的样品；

（2）在搅拌条件下，向制得的水溶性多壁碳纳米管溶液中加入70mg碳二亚胺盐酸盐（EDC-HCl）和120mg N-羟基琥珀酰亚胺（NHS），避光继续搅拌30分钟，在避光条件下加入15 mg高纯度PC粉末，于15℃恒温振荡12小时。振荡后的溶液采用30kD的超滤管超滤去除多余的PC、EDC-HCl和NHS。所得滤饼即为碳纳米管-壳聚糖-藻蓝蛋白纳米粒的样品（MWCNT-CS-PC）。将样品冷冻干燥用于表征分析。检测方法与结果基本同实施例1。

实施例3

（1）称取30mg直径为20nm的羧基化碳纳米管粉末（羧化率为10wt%），加入150ml 5mM PBS溶液中，超声分散40分钟，然后加入100mg 水溶性壳聚糖，继续超声振荡45分钟，超声后对混合溶液磁力搅拌0.5小时。静置10小时后，取上层液体在10000r/min的转速下高速离心，离心后的上层液即为壳聚糖修饰的中间样品：水溶性多壁碳纳米管（MWCNT-CS）均一溶液。采用30kD的超滤管超滤去除MWCNT-CS中富余的壳聚糖，将所得滤饼冷冻干燥，作为表征分析的样品；

（2）在搅拌条件下，向制得的水溶性多壁碳纳米管溶液中加入50mg碳二亚胺盐酸盐（EDC-HCl）和130mg N-羟基琥珀酰亚胺（NHS），避光继续搅拌50分钟，在避光条件下加入25 mg高纯度PC粉末，于25℃恒温振荡15小时。振荡后的溶液采用80kD的超滤管超滤去除多余的PC、EDC-HCl和NHS。所得滤饼即为碳纳米管-壳聚糖-藻蓝蛋白纳米粒的样品（MWCNT-CS-PC）。将样品冷冻干燥用于表征分析。检测方法与结果基本同实施例1。

实施例4

（1）称取50mg直径为10nm的羧基化碳纳米管粉末（羧化率为8wt%），加入150ml 5mM PBS溶液中，超声分散50分钟，然后加入170mg 水溶性壳聚糖，继续超声振荡80分钟，超声后对混合溶液磁力搅拌1.2小时。静置分层13小时后，取上层液体在10000r/min的转速下高速离心，离心后的上层液即为壳聚糖修饰的中间样品：水溶性多壁碳纳米管（MWCNT-CS）均一溶液。采用30kD的超滤管超滤去除MWCNT-CS中富余的壳聚糖，将所得滤饼冷冻干燥，作为表征分析的样品；

（2）在搅拌条件下，向制得的水溶性多壁碳纳米管溶液中加入80mg碳二亚胺盐酸盐（EDC-HCl）和170mg N-羟基琥珀酰亚胺（NHS），避光继续搅拌40分钟，在避光条件下加入40 mg高纯度PC粉末，于18℃恒温振荡11小时。振荡后的溶液采用100kD的超滤管超滤去除多余的PC、EDC-HCl和NHS，所得滤饼即为碳纳米管-壳聚糖-藻蓝蛋白纳米粒的样品（MWCNT-CS-PC）。将样品冷冻干燥用于表征分析。检测方法与结果基本同实施例1。

Claims

1.碳纳米管-壳聚糖-藻蓝蛋白纳米粒的制备方法，其特征在于由羧基化多壁碳纳米管、水溶性壳聚糖和藻蓝蛋白复合而成，具体包括如下步骤：

（1）将羧基化多壁碳纳米管分散在磷酸缓冲液中，经超声振荡30分钟～90分钟后，再加入水溶性壳聚糖，超声振荡并搅拌均匀得混合溶液；然后静置分层，将分层后的上层液离心分离，得到的上层液即为壳聚糖修饰的水溶性多壁碳纳米管溶液；所述羧基化多壁碳纳米管和水溶性壳聚糖的质量比为1:1～1:10；

（2）向步骤（1）得到的水溶性多壁碳纳米管溶液中加入相当于羧基化多壁碳纳米管质量1～5倍的碳二亚胺盐酸盐和相当于羧基化多壁碳纳米管质量1～6倍的N-羟基琥珀酰亚胺，避光充分搅拌后，保持避光条件，再加入藻蓝蛋白粉末，于10℃～25℃恒温振荡8小时～15小时；将振荡后溶液过滤，所得滤饼即为碳纳米管-壳聚糖-藻蓝蛋白复合物；所述藻蓝蛋白粉末与羧基化多壁碳纳米管的质量比为1:1～1:10。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述步骤（1）的多壁碳纳米管纯度为90%~99%，直径为10 nm～20nm，长度为0.5μm～2μm，羧化率：1wt%～10 wt%。

3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于所述步骤（1）的壳聚糖为水溶性壳聚糖，羧化度为0.1%～1%，分子量为500～10000。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于所述步骤（1）的藻蓝蛋白纯度为4.0～6.0。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于所述步骤（1）的磷酸缓冲液为磷酸钠缓冲液或2mM～5mM磷酸钾缓冲液。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于所述步骤（2）得到的振荡后混合液采用10kD～100kD的超滤管超滤。