CN107320776A - 一种可促真皮再生的凝胶及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种可促真皮再生的凝胶及其制备方法，所述凝胶包含以下质量百分比的原料：脱细胞基质0.1～10份和消化液90～99.9份，所述脱细胞基质采用人源或非人源性去细胞组织器官基质经脱细胞处理工艺除去可能造成免疫反应的残余细胞、DNA等物质得到，所述消化液为浓度为含有胃蛋白酶的盐酸溶液。本发明的可促真皮再生的凝胶作为创面缺损的永久性真皮替代物，除具有一定力学强度、呈半透明状、可降解外，还同时具备纳米纤维多孔结构、去细胞生物活性成分，不仅利于后期组织再生情况观察，还能营造有利于皮肤再生的微环境，提供必要的营养成分，诱导细胞迁移爬行，对于调节细胞的行为具有积极效应。

Description

一种可促真皮再生的凝胶及其制备方法
技术领域
本发明涉及医学材料技术领域，具体而言，涉及一种可促真皮再生的凝胶及其制备方法。
背景技术
皮肤作为人体覆盖面积最大的器官，起到保护人体不受外界和微生物的侵害、维持体内水分、电解质、营养物质的作用，其重要性不言而喻。皮肤分为三层：表皮层、真皮层及皮下组织，其作为人体最外层组织极易因物理、机械或热力等外界因素所造成人体皮肤、粘膜、组织的缺损或破环。创伤按照创面的愈合时间分为急性创面和慢性难愈合创面。
针对慢性难愈合创面，目前大多敷料对创面仅起到物理遮挡保护、吸收渗液、营造湿润微环境乃至杀菌的作用。虽然这类敷料作为临时性皮肤保护物已经在临床上得到良好效果，但是这类产品一般为不可吸收材料构成，需要更换，并进行进一步的植皮手术才能完成皮肤的再生修复。此外，目前国内外的永久性真皮代用品主要包括异体真皮替代物、合成基质真皮替代物及脱细胞真皮基质。这些产品虽具有较佳皮肤再生修复效果，但是仍存在免疫反应、潜伏感染、缺乏皮肤组织功能性等不足。因此具有皮肤组织再生诱导功能，完整构建皮肤组织的结构和功能性的生物可吸收皮肤组织再生材料是今后皮肤再生修复的主要技术发展方向。
发明内容
有鉴于此，本发明提供的一种可促真皮再生的凝胶及其制备方法，更好的克服了上述现有技术存在的问题和缺陷，该可促真皮再生的凝胶作为创面缺损的永久性真皮替代物，除具有一定力学强度、呈半透明状、可降解外，还同时具备纳米纤维多孔结构、去细胞生物活性成分，不仅利于后期组织再生情况观察，还能营造有利于皮肤再生的微环境，提供必要的营养成分，诱导细胞迁移爬行，对于调节细胞的行为具有积极效应。
一种可促真皮再生的凝胶，所述凝胶为互穿的纳米纤维多孔结构；用于形成所述凝胶的原料以重量份数计包括：脱细胞基质0.1～10份和消化液90～99.9份，所述消化液为含有胃蛋白酶的盐酸溶液。
进一步地，所述原料以重量份计还包括：交联剂0.15～300份。
进一步地，所述交联剂为1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亚胺或1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亚胺与N-羟基琥珀酰亚胺的混合物。
本发明还提供了一种可促真皮再生的凝胶的制备方法，所述可促真皮再生的凝胶为如上述的可促真皮再生的凝胶，所述制备方法包括以下步骤：
(1)将所述脱细胞基质冷冻干燥，打碎成粉末，所述脱细胞基质采用人源或非人源性去细胞组织器官基质经脱细胞处理工艺除去会造成免疫反应的残余细胞、DNA物质得到；
(2)用所述消化液室温下消化脱细胞基质粉末，然后将消化后溶液进行离心，离心得到作为脱细胞基质预凝胶溶液的的上清液；
(3)用0.1M NaOH溶液调节所述脱细胞基质预凝胶溶液中消化液的pH，使pH＞8，再用0.1M HCl溶液调节至中性，加入10×PBS，混匀后静置培养，生成凝胶pDSM-gel；其中，所述10×PBS的用量为所述脱细胞基质预凝胶溶液体积的1/8～1/10。
进一步地，步骤(1)中，所述脱细胞处理工艺具体包括将人源或非人源的器官或组织基质经除去多余脂肪和肌肉组织后，剪成小块，然后在4～8℃下加入水溶液经振荡、漂洗、萃取，脱去组织中的细胞，洗去会造成免疫反应的DNA物质。
进一步地，步骤(1)中，还包括将所述脱细胞基质粉末过50～80目筛。
进一步地，步骤(2)中，所述消化时间为6～48h。
进一步地，步骤(2)中，所述离心的速度为20000～40000rpm，所述离心的时间为30～60min，所述离心在温度为4～8℃下进行。
进一步地，步骤(3)中，所述静置培养过程中的温度为37℃，所述静置培养时间为4～10min。
进一步地，在步骤(3)之后还包括将所述凝胶pDSM-gel在25～37℃下浸泡于交联剂中进行化学交联固定3～24h得到交联后的凝胶pDSM-gel。
与现有技术相比，本发明的一种可促真皮再生的凝胶及其制备方法的有益效果是：
1、本发明的可促真皮再生的凝胶成分与皮肤组织活性成分接近，可以为组织再生提供良好的生物功能。
2、本发明的可促真皮再生的凝胶初步成型条件为正常的人体生理条件，适宜体内应用，可直接注射使用，也可体外成型加交联剂固定后植入创面。
3、本发明的可促真皮再生的凝胶的力学性能和降解时间具有可控性，可以通过调节脱细胞基质的含量、消化时间、引入交联剂的方式增大凝胶模量，延长降解时间，来适用不同的类型创面修复需求。
4、本发明的可促真皮再生的凝胶有类似于真皮组织层的可吸收降解纳米纤维多孔结构，利于细胞迁移、粘附、增殖，能为创面营造一个可再生微环境。
5、本发明的可促真皮再生的凝胶成半透明状，利于在使用过程中观察创面血管化及肉芽再生的情况。
6、本发明的可促真皮再生的凝胶成胶机理可以用来负载一些含氨基、羧基的营养因子、药物等促进创面再生和修复的成分，起到不同的功能化及缓释作用。
为使本发明的上述目的、特征和优点能更明显易懂，下文特举较佳实施例，并配合所附附图，作详细说明如下。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为本发明实施例1制备得到的凝胶pDSM-gel的SEM图(放大500倍)；
图2为本发明实施例1制备得到的凝胶pDSM-gel的SEM图(放大15000倍)；
图3为本发明实施例2制备得到的凝胶pDSM-gel(EDC/NHS)的SEM图(放大500倍)；
图4为本发明实施例2制备得到的凝胶pDSM-gel(EDC/NHS)的SEM图(放大15000倍)；
图5为本发明实施例1制备得到的凝胶pDSM-gel和本发明实施例2制备得到的凝胶pDSM-gel(EDC/NHS)的力学强度测试图；
图6为本发明实施例1制备得到的凝胶pDSM-gel与成纤维细胞共培养1天的活细胞图；
图7为本发明实施例1制备得到的凝胶pDSM-gel与成纤维细胞共培养1天的死细胞图；
图8为本发明实施例1制备得到的凝胶pDSM-gel与成纤维细胞共培养5天的活细胞图；
图9为本发明实施例1制备得到的凝胶pDSM-gel与成纤维细胞共培养5天的死细胞图。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面结合实施例的方式对本发明的技术方案做详细说明，在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。
但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施的限制。
除非另有限定，本文使用的所有技术以及科学术语具有与本发明所属领域普通技术人员通常理解的相同的含义。当存在矛盾时，以本说明书中的定义为准。
如本文所用之术语：
“由……制备”与“包含”同义。本文中所用的术语“包含”、“包括”、“具有”、“含有”或其任何其它变形，意在覆盖非排它性的包括。例如，包含所列要素的组合物、步骤、方法、制品或装置不必仅限于那些要素，而是可以包括未明确列出的其它要素或此种组合物、步骤、方法、制品或装置所固有的要素。
连接词“由……组成”排除任何未指出的要素、步骤或组分。如果用于权利要求中，此短语将使权利要求为封闭式，使其不包含除那些描述的材料以外的材料，但与其相关的常规杂质除外。当短语“由……组成”出现在权利要求主体的子句中而不是紧接在主题之后时，其仅限定在该子句中描述的要素；其它要素并不被排除在作为整体的所述权利要求之外。
当量、浓度、或者其它值或参数以范围、优选范围、或一系列上限优选值和下限优选值限定的范围表示时，这应当被理解为具体公开了由任何范围上限或优选值与任何范围下限或优选值的任一配对所形成的所有范围，而不论该范围是否单独公开了。例如，当公开了范围“1～5”时，所描述的范围应被解释为包括范围“1～4”、“1～3”、“1～2”、“1～2和4～5”、“1～3和5”等。当数值范围在本文中被描述时，除非另外说明，否则该范围意图包括其端值和在该范围内的所有整数和分数。
“和/或”用于表示所说明的情况的一者或两者均可能发生，例如，A和/或B包括(A和B)和(A或B)；
本发明提供了一种可促真皮再生的凝胶，所述凝胶为互穿的纳米纤维多孔结构；用于形成所述凝胶的原料以重量份数计包括：脱细胞基质0.1～10份如0.1份、0.5份、1份、2份、5份、8份或10份等，和消化液90～99.9份如90份、92份、95份、97份、98份、99份或99.9份等。所述脱细胞基质采用人源或非人源组织器官基质经脱细胞处理工艺除去会造成免疫反应的残余细胞、DNA等物质得到，所述消化液为含有胃蛋白酶的盐酸溶液。优先地，所述含有胃蛋白酶的盐酸溶液的浓度为0.01M。
需要说明的是，上述脱细胞基质为取自真皮、脂肪、小肠粘膜的脱细胞基质，其脱细胞基质成分及含量与人体的皮肤组织相似或利于创面再生。所述脱细胞基质的主要成分为胶原、弹性蛋白、非胶原糖蛋白、氨基聚糖和蛋白聚糖，其中脱细胞基质中的胶原、多糖等组分会在物理成胶的过程中通过蛋白折叠自组装的方式形成互穿的纳米纤维多孔结构
可以理解的是，上述互穿的纳米纤维多孔结构利于细胞迁移、粘附、增殖，能为创面营造一个可再生微环境，达到了双重仿生诱导目的。其中，所述纳米纤维直径为40～130nm如40nm、60nm、80nm、100nm、1200nm或130nm等。
优选地，所述原料以重量份数计还包括：交联剂0.15～300份。
优选地，所述交联剂为1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亚胺(EDC)或1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亚胺与N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的混合。
本发明还提供了一种可促真皮再生的凝胶的制备方法，所述可促真皮再生的凝胶为如上述的可促真皮再生的凝胶，所述制备方法包括以下步骤：
(1)将所述脱细胞基质冷冻干燥，打碎成粉末，所述脱细胞基质采用人源或非人源性去细胞组织器官基质经脱细胞处理工艺除去会造成免疫反应的残余细胞、DNA物质得到；
(2)用所述消化液室温下消化脱细胞基质粉末，然后将消化后溶液进行离心，离心得到作为脱细胞基质预凝胶溶液的上清液；
(3)用0.1M NaOH溶液调节所述脱细胞基质预凝胶溶液中消化液的pH，使pH＞8，再用0.1M HCl溶液调节至中性，加入10×PBS，混匀后静置培养，生成凝胶pDSM-gel；其中，所述10×PBS的用量为所述脱细胞基质预凝胶溶液体积的1/8～1/10如1/8、1/9或1/10等。
需要说明的是，上述PBS一般使用浓度与生理盐水渗透压相近，10×一般是指原PBS盐浓度的十倍，可在4℃下用pH值为7.4的PBS缓冲溶液调整至溶液所需的体积和浓度。
优选地，步骤(1)中，所述脱细胞处理工艺包括将人源或非人源的器官或组织基质经除去多余脂肪和肌肉组织后，剪成小块，然后在4～8℃如4℃、5℃、6℃、7℃或8℃下加入水溶液经振荡、漂洗、萃取，脱去组织中的细胞，洗去会造成免疫反应的DNA物质。
优选地，步骤(1)中，还包括将所述脱细胞基质粉末过50～80目如50目、60目、70目或80目筛。
优选地，步骤(2)中，所述消化时间为6～48h如6h、10h、15h、20h、24h、28h、30h、35h、40h、45h或48h等；所述离心的速度为20000～40000rpm如20000rpm、25000rpm、30000rpm、35000rpm或40000rpm等，所述离心的时间为30～60min如30min、40min、50min或60min等，所述离心在温度为4～8℃如4℃、5℃、6℃、7℃或8℃下进行。
需要说明的是，上述消化时间与脱细胞基质浓度和脱细胞基质粉末直径有关，脱细胞基质浓度越高，脱细胞基质粉末直径越大消化时间越长，相反地，脱细胞基质浓度越低，脱细胞基质粉末直径越小消化时间越短。
步骤(2)中，所述离心之后还包括将所述上清液在-40～6℃如-40℃、-30℃、-20℃、-10℃、0℃、2℃或6℃下储存。
优选地，步骤(3)中，所述静置培养过程中的温度为37℃，所述静置培养时间为4～10min如4min、5min、6min、7min、8min、9min或10min等。
优选地，在步骤(3)之后还包括将所述凝胶pDSM-gel在25～37℃如25℃、28℃、30℃、32℃、35℃或37℃下浸泡于交联剂中进行化学交联固定3～24h如3h、5h、8h、10h、15h、18h、20h、22h或24h等，得到交联后的凝胶pDSM-gel。
优选地，所述交联剂为1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亚胺(EDC)或1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亚胺/N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的混合物。
需要理解的是，采用EDC或EDC与NHS的混合物作为交联剂可以将纳米纤维成分再次交联固定，以增加凝胶的力学支撑强度、延长降解时间，使纳米纤维结构得以长时间维持不受温度湿度等环境影响。
需要说明的是，由上述制备方法得到的凝胶不仅具有一定的力学强度有支撑作用外，宏观上具有一定的透明度，利于创面修复中排除颜色干扰观察创面血管化和肉芽组织再生情况；而且该凝胶可降解且降解时间可控，降解产物可以为细胞增殖、分化等提供营养，同时该凝胶具备纳米纤维多孔结构、去细胞生物活性成分，不仅利于后期组织再生情况观察，还能营造有利于皮肤再生的微环境，提供必要的营养成分，诱导细胞迁移爬行，对于调节细胞的行为具有积极效应。
需要说明的是，本发明利用脱细胞基质预凝胶经物理自组装成胶机理或交联剂交联机理，将利于皮肤组织再生的营养因子(如EGF、VEGF、TGF等)或促进修复的药物通过物理缠结包裹或交联的作用很好的固定在凝胶内部，随该凝胶的缓慢降解达到一种持续缓释的效果。
为了便于理解本发明，下面结合实施例来进一步说明本发明的技术方案。申请人声明，本发明通过以下实施例来说明本发明的详细工艺设备和工艺流程，但本发明并不局限于这些具体的工艺设备和工艺流程，即不意味着本发明应依赖下述详细工艺设备和工艺流程才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
实施例1
一种可促真皮再生的凝胶的制备方法如下：
(1)取新鲜猪小肠粘膜下层，用刀刮去表面的多余脂肪和肌肉组织，剪成小块，于低温下4℃加入水溶液经振荡、漂洗、萃取，脱去组织中的细胞，洗去可能造成免疫反应的DNA等物质，获得脱细胞基质；
(2)将步骤(1)获得的脱细胞基质冷冻干燥，再用粉碎机把脱细胞基质磨成粉末，并分别用60目、80目的滤筛除去较大、较小颗粒，得到脱细胞基质粉末直径约为200μm。
(3)把1份上述脱细胞基质粉末加入99份浓度为0.01M的含胃蛋白酶的盐酸溶液中，在室温(25℃)下消化12h，以30000rpm离心速度进行离心除去未消化大颗粒物或杂质，取上清液在4℃下储存待用，获得的上清液即为脱细胞基质预凝胶溶液。
(4)首先用0.1M NaOH溶液调节上述脱细胞基质预凝胶溶液中消化液的pH大于8让胃蛋白酶失活，再用0.1M HCl溶液调节至中性(pH约为7.4)，低温下加入大约1/9脱细胞基质预凝胶溶液体积的10×PBS，混匀后于37℃下静置4分钟后即可形成凝胶pDSM-gel。
实施例2
实施例2在实施例1的基础上，将得到的凝胶pDSM-gel在25℃下浸泡于1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亚胺(EDC)与N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的2-(N-吗啉)乙磺酸(MES)溶液中固定24小时得到凝胶pDSM-gel(EDC/NHS)。其中2-(N-吗啉)乙磺酸(MES)的浓度为0.05M；1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亚胺(EDC)在MES溶液中浓度为4.82wt％，其含量约为上述脱细胞基质质量10.5倍；N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)在MES溶液中浓度为0.72wt％，其含量约为上述脱细胞基质质量的1.6倍；且EDC与NHS的摩尔比为4:1。
实施例1制备得到的凝胶pDSM-gel在电子扫描显微镜下观察得到的结构如图1和图2所示，实施例2制备得到的凝胶pDSM-gel(EDC/NHS)在电子扫描显微镜下观察得到的结构如图3和图4所示。
由图2和图4中均可以看出清晰的纳米纤维网络结构，而实施例2制备得到的凝胶pDSM-gel(EDC/NHS)较实施例1制备得到的凝胶pDSM-gel的结构更为松散。两种凝胶的纳米纤维网络结构均主要由脱细胞基质中的胶原组分等物理缠结自组装形成，由图1、图2和图3、图4对比可知，化学交联剂EDC/NHS的MES溶液的加入未对形成的纳米纤维结构造成影响。
分别经实施例1制备得到的凝胶pDSM-gel和实施例2制备得到的凝胶pDSM-gel(EDC/NHS)用高级旋转流变仪进行力学性能测试，结果如图5所示。经测试得出，实施例1制备得到的凝胶pDSM-gel的储存模量为237±9Pa，实施例2制备得到的凝胶pDSM-gel(EDC/NHS)的储存模量为3902±55Pa。实施例2制备得到的凝胶pDSM-gel(EDC/NHS)的力学强度大于实施例1制备得到的凝胶pDSM-gel的化学强度，因此可以得出化学交联剂EDC/NHS的MES溶液的加入能进一步提高凝胶的力学强度。
分别将实施例1制备得到的凝胶pDSM-gel和实施例2制备得到的凝胶pDSM-gel(EDC/NHS)进行降解测试，14天后，实施例1制备得到的凝胶pDSM-gel降解45％，实施例2制备得到的凝胶pDSM-gel(EDC/NHS)降解18％，因此可以得出化学交联剂EDC/NHS的MES溶液的加入能延长凝胶的降解时间。
将实施例1制备得到的凝胶pDSM-gel与成纤维细胞共培养，图6和图7分别为共培养1天后的活细胞和死细胞图示，图8和图9分别为共培养5天后的活细胞和死细胞图示，由图8和图9可知，共培养5天后的成纤维细胞形态成正常梭形，几乎无死细胞存在，且细胞数量相较于第1天时明显增多。实施例2制备得到的凝胶pDSM-gel(EDC/NHS)同上，证明凝胶pDSM-gel与凝胶pDSM-gel(EDC/NHS)均具有良好的生物相容性和促细胞增殖的作用。
实施例3
一种可促真皮再生的凝胶的制备方法如下：
(1)取新鲜猪小肠粘膜下层，用刀刮去表面的多余脂肪和肌肉组织，剪成小块，于低温下7℃加入水溶液经振荡、漂洗、萃取，脱去组织中的细胞，洗去可能造成免疫反应的DNA等物质，获得脱细胞基质；
(2)将步骤(1)获得的脱细胞基质冷冻干燥，再用粉碎机把脱细胞基质磨成粉末，并分别用50目的滤筛除去较大颗粒，得到脱细胞基质粉末直径约为300μm。
(3)把0.1份上述脱细胞基质粉末加入99.9份浓度为0.01M的含胃蛋白酶的盐酸溶液中，在室温(25℃)下消化6h，以20000rpm离心速度进行离心除去未消化大颗粒物或杂质，取上清液在4℃下储存待用，获得的上清液即为脱细胞基质预凝胶溶液。
(4)首先用0.1M NaOH溶液调节上述脱细胞基质预凝胶溶液中消化液的pH大于8让胃蛋白酶失活，再用0.1M HCl溶液调节至中性(pH约为7.4)，低温下加入大约1/8脱细胞基质预凝胶溶液体积的10×PBS，混匀后于37℃下静置7分钟后即可形成凝胶pDSM-gel。
实施例4
实施例4在实施例3的基础上，将得到的凝胶pDSM-gel在30℃下浸泡于1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亚胺(EDC)与N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的2-(N-吗啉)乙磺酸(MES)溶液中固定8小时得到凝胶pDSM-gel(EDC/NHS)。其中2-(N-吗啉)乙磺酸(MES)的浓度为0.05M；1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亚胺(EDC)在MES溶液中浓度为4.82wt％，其含量约为上述脱细胞基质质量10.5倍；N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)在MES溶液中浓度为0.72wt％，其含量约为上述脱细胞基质质量的1.6倍；且EDC与NHS的摩尔比为4:1。
实施例5
一种可促真皮再生的凝胶的制备方法如下：
(1)取新鲜猪小肠粘膜下层，用刀刮去表面的多余脂肪和肌肉组织，剪成小块，于低温下8℃加入水溶液经振荡、漂洗、萃取，脱去组织中的细胞，洗去可能造成免疫反应的DNA等物质，获得脱细胞基质；
(2)将步骤(1)获得的脱细胞基质冷冻干燥，再用粉碎机把脱细胞基质磨成粉末，并分别用80目的滤筛除去较大颗粒，得到脱细胞基质粉末直径约为250μm。
(3)把10份上述脱细胞基质粉末加入90份浓度为0.01M的含胃蛋白酶的盐酸溶液中，在室温(25℃)下消化48h，以40000rpm离心速度进行离心除去未消化大颗粒物或杂质，取上清液在4℃下储存待用，获得的上清液即为脱细胞基质预凝胶溶液。
(4)首先用0.1M NaOH溶液调节上述脱细胞基质预凝胶溶液中消化液的pH大于8让胃蛋白酶失活，再用0.1M HCl溶液调节至中性(pH约为7.4)，低温下加入大约1/8脱细胞基质预凝胶溶液体积的10×PBS，混匀后于37℃下静置8分钟后即可形成凝胶pDSM-gel。
实施例6
实施例6在实施例5的基础上，将得到的凝胶pDSM-gel在37℃下浸泡于1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亚胺(EDC)与N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的2-(N-吗啉)乙磺酸(MES)溶液中固定3小时得到凝胶pDSM-gel(EDC/NHS)。其中2-(N-吗啉)乙磺酸(MES)的浓度为0.05M；1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亚胺(EDC)在MES溶液中浓度为4.82wt％，其含量约为上述脱细胞基质质量10.5倍；N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)在MES溶液中浓度为0.72wt％，其含量约为上述脱细胞基质质量的1.6倍；且EDC与NHS的摩尔比为4:1。
上述实施例3和5制备得到的凝胶在电子扫描显微镜下观察得到的结构与实施例1类似，且随原料脱细胞基质的重量份数的增加纳米纤维结构越密集，随脱细胞基质的重量份数的减少纳米纤维之间越松散；上述实施例3和5制备得到的凝胶的力学强度实施例1相比随原料脱细胞基质的重量份数的增加而增强，均可降解，且降解时间随原料脱细胞基质的重量份数的增加而延长，并具有良好的生物相容性。
实施例4和6制备得到的凝胶在电子扫描显微镜下观察得到的结构与实施例2类似，且随原料脱细胞基质的重量份数的增加纳米纤维结构越密集，随脱细胞基质的重量份数的减少纳米纤维之间越松散；上述实施例4和6制备得到的凝胶的力学强度与实施例2相比随着原料脱细胞基质的重量份数的增加而增强，均可降解，且降解时间随着原料脱细胞基质的重量份数的增加而延长，并具有良好的生物相容性。
本发明的可促真皮再生的凝胶制备技术，成型条件温和，保留了脱细胞基质的生物活性成分，根据创面需求可不同选择不同的成胶方式，如选择人体正常生理条件，直接注射体内原位成型使用，也可以体外成型制备特定形状后再植入体内使用。由凝胶pDSM-gel与成纤维细胞共培养1天、5天的活细胞和死细胞结果显示，该凝胶具有良好的生物相容性；经扫描电镜观察显示，凝胶成型后，具有良好的互穿型微观纳米纤维结构，对于后续的创面修复具有良好的促进作用；经高级旋转流变仪测试，该凝胶有一定的力学支撑作用，且经后续化学交联后，这种力学支撑作用得以加强。经化学降解实验测试，该凝胶具有可降解性，且经化学交联固定后，其降解时间得以延长。
上述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明配方及制备工艺可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种可促真皮再生的凝胶，其特征在于：所述凝胶为互穿的纳米纤维多孔结构；用于形成所述凝胶的原料以重量份数计包括：脱细胞基质0.1～10份和消化液90～99.9份，所述消化液为含有胃蛋白酶的盐酸溶液。
2.根据权利要求1所述的可促真皮再生的凝胶，其特征在于：所述原料以重量份数计还包括：交联剂0.15～300份。
3.根据权利要求2所述的可促真皮再生的凝胶，其特征在于：所述交联剂为1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亚胺或1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亚胺与N-羟基琥珀酰亚胺的混合物。
4.一种可促真皮再生的凝胶的制备方法，其特征在于：所述可促真皮再生的凝胶为如权利要求1-3任一项所述的可促真皮再生的凝胶，所述制备方法包括以下步骤：
(1)将所述脱细胞基质冷冻干燥，打碎成粉末，所述脱细胞基质采用人源或非人源性去细胞组织器官基质经脱细胞处理工艺除去会造成免疫反应的残余细胞、DNA物质得到；
(2)用所述消化液室温下消化脱细胞基质粉末，然后将消化后溶液进行离心，离心得到作为脱细胞基质预凝胶溶液的的上清液；
(3)用0.1M NaOH溶液调节所述脱细胞基质预凝胶溶液中消化液的pH，使pH＞8，再用0.1M HCl溶液调节至中性，加入10×PBS，混匀后静置培养，生成凝胶pDSM-gel；其中，所述10×PBS的用量为所述脱细胞基质预凝胶溶液体积的1/8～1/10。
5.根据权利要求4所述的可促真皮再生的凝胶的制备方法，其特征在于：步骤(1)中，所述脱细胞处理工艺具体包括将人源或非人源的器官或组织基质经除去多余脂肪和肌肉组织后，剪成小块，然后在4～8℃下加入水溶液经振荡、漂洗、萃取，脱去组织中的细胞，洗去会造成免疫反应的DNA物质。
6.根据权利要求4所述的可促真皮再生的凝胶的制备方法，其特征在于：步骤(1)中，还包括将所述脱细胞基质粉末过50～80目筛。
7.根据权利要求4所述的可促真皮再生的凝胶的制备方法，其特征在于：步骤(2)中，所述消化时间为6～48h。
8.根据权利要求4所述的可促真皮再生的凝胶的制备方法，其特征在于：步骤(2)中，所述离心的速度为20000～40000rpm，所述离心的时间为30～60min，所述离心在温度为4～8℃下进行。
9.根据权利要求4所述的可促真皮再生的凝胶的制备方法，其特征在于：步骤(3)中，所述静置培养过程中的温度为37℃，所述静置培养时间为4～10min。
10.根据权利要求4所述的可促真皮再生的凝胶的制备方法，其特征在于：在步骤(3)之后还包括将所述凝胶pDSM-gel在25～37℃下浸泡于交联剂中进行化学交联固定3～24h得到交联后的凝胶pDSM-gel。
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