CN102057037B - 平滑肌干细胞的分离方法 - Google Patents

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Abstract

本发明是分离平滑肌干细胞的方法，是分离来自哺乳动物平滑肌的平滑肌干细胞的方法，包括：使哺乳动物平滑肌细胞与用荧光色素标记的抗CD45抗体、抗CD34抗体及抗CD49f抗体接触，分离不与抗CD45抗体结合、而与抗CD34抗体及抗CD49f抗体结合的细胞。

Description

平滑肌干细胞的分离方法
技术领域
本发明涉及具有特定的表面标记物的来自平滑肌的组织干细胞、其新的分离方法及培养方法以及其应用。
背景技术
近年来逐渐明确存在于各种器官·组织内的固有生物体(组织)干细胞负责各器官·组织的维持和再生。迄今已报道了来自各种组织的干细胞，并且分离出了干细胞。
作为截至目前被分离的干细胞，例如可以举出骨骼肌干细胞、心肌干细胞、肝脏干细胞、神经干细胞、胰脏干细胞、表皮干细胞、脂肪组织干细胞等。作为其分离方法，多采用边缘群(side population，SP)法，本发明人以前使用SP法分离了人子宫的平滑肌干细胞(参见专利文献1)。
再生医疗作为修复因疾患或外伤等损伤或丧失的人体细胞或组织、使其功能恢复的医疗，目前受到极大的关注。认为只要能够分离鉴定上述组织干细胞，使其复制增殖，再生医疗就是可能的。
专利文献1日本特开2007-202435号公报
发明内容
本发明的目的在于提供平滑肌干细胞、特别是子宫肌干细胞，进而其目的在于提供上述干细胞的应用。
平滑肌的1种即子宫肌能够以年为单位发生妊娠导致的显著的细胞尺寸增大(hypertrophy)和细胞数增加(hyperplasia)，该剧烈变化可以在女性的一生中反复20次以上。子宫肌是非常独特的组织，已知其在妊娠·分娩时表现为显著的增大和细胞数增加，在产褥期急剧发生细胞凋亡。
本发明人着眼于从妊娠到产褥期的细胞数增加及细胞凋亡的一系列事件，考虑在作为子宫肌的主要构成组织的子宫平滑肌中存在组织干细胞的可能性。本发明人以前发明了采用SP法分离人子宫的平滑肌干细胞的方法(日本特开2007-202435号公报)。但是，因为SP法在与DNA染料的反应后经过照射UV激光进行拣选的过程，所以也包括细胞的损伤，无法确保分离的干细胞的安全性·无菌性。
因此，本发明人作为细胞损伤少、且能够确保分离细胞的安全性或无菌性的方法，尝试了使用表面标记物的分离。即，采集正常子宫肌层，通过酶处理得到分散细胞，通过流式细胞仪拣选Lin(CD31，CD45，血型糖蛋白A)阴性细胞后，区分为CD34阳性／CD49f阳性细胞(双阳性细胞；DP／Lin-)及其他细胞(nonDP)。最终通过FACS，作为子宫肌DP／Lin-(DP／Lin-)而从该分散细胞中分离出特征在于CD31、CD45及血型糖蛋白A为阴性、CD34及CD49f为阳性的双阳性细胞(DP／Lin-)。
另一方面，本发明人发现以仅CD34及CD49f的表达为指标，可以将特征在于CD34及CD49f为阳性的双阳性细胞(DP)作为子宫肌DP进行分离。此时还发现可以事先选择CD45为阴性的细胞、作为子宫肌DP从中分离特征在于CD34及CD49f为阳性的双阳性细胞(DP)。
然后，解析DP／Lin-、DP及DP／Lin-以外的子宫肌细胞的表达基因，确认了具有干细胞的特征。进而，发现DP／Lin-及DP在体外能够分化诱导为骨·脂肪·软骨细胞，将DP／Lin-及DP移植给免疫缺陷小鼠时，能够再构筑子宫肌样组织，确认了分离的细胞为子宫平滑肌干细胞。
即，本发明如下所述。
[1]分离平滑肌干细胞的方法，其是分离来自哺乳动物平滑肌的平滑肌干细胞的方法，包括：使哺乳动物平滑肌细胞与用荧光染料标记的抗CD31抗体、抗CD45抗体、抗血型糖蛋白A抗体、抗CD34抗体及抗CD49f抗体接触，分离不与抗CD31抗体、抗CD45抗体及抗血型糖蛋白A抗体结合、而与抗CD34抗体及抗CD49f抗体结合的细胞。
[2]分离平滑肌干细胞的方法，其是分离来自哺乳动物平滑肌的平滑肌干细胞的方法，包括：使哺乳动物平滑肌细胞与用荧光染料标记的抗CD34抗体及抗CD49f抗体接触，分离与抗CD34抗体及抗CD49f抗体结合的细胞。
[3][2]所述的分离平滑肌干细胞的方法，其是分离来自哺乳动物平滑肌的平滑肌干细胞的方法，包括：使哺乳动物平滑肌细胞与用荧光染料标记的抗CD45抗体、抗CD34抗体及抗CD49f抗体接触，分离不与抗CD45抗体结合、而与抗CD34抗体及抗CD49f抗体结合的细胞。
[4][1]～[3]中任一项所述的分离平滑肌干细胞的方法，其中，使用流式细胞仪拣选细胞。
[5][1]所述的分离平滑肌干细胞的方法，包括：将哺乳动物平滑肌细胞通过流式细胞仪拣选为Lin(CD31，CD45，血型糖蛋白A)阳性细胞(Lin+)和Lin阴性细胞(Lin-)，采集Lin阴性细胞，进而采集CD34阳性且CD49f阳性的细胞。
[6][2]所述的分离平滑肌干细胞的方法，其中，包括：从哺乳动物平滑肌细胞中通过流式细胞仪采集CD34阳性且CD49f阳性的细胞。
[7][3]所述的分离平滑肌干细胞的方法，其中，包括：从哺乳动物平滑肌细胞中通过流式细胞仪采集CD45阴性细胞，进而采集CD34阳性且CD49f阳性的细胞。
[8][1]～[7]中任一项所述的分离平滑肌干细胞的方法，其中，平滑肌为子宫肌。
[9][1]～[8]中任一项所述的分离平滑肌干细胞的方法，其中，哺乳动物为人。
[10]平滑肌干细胞，通过[1]～[9]中任一项所述的方法分离，CD31、CD45及血型糖蛋白A为阴性，CD34及CD49f为阳性。
[11]平滑肌干细胞，通过[1]～[9]中任一项所述的方法分离，CD34及CD49f为阳性。
[12]平滑肌干细胞，通过[1]～[9]中任一项所述的方法分离，CD45为阴性，CD34及CD49f为阳性。
[13][10]～[12]中任一项所述的平滑肌干细胞，其中，进而ABCG2为阳性。
[14][10]～[13]的平滑肌干细胞，具有通过移植到平滑肌中分化成平滑肌的能力。
[15]来自子宫肌的[14]的平滑肌干细胞，具有通过移植到子宫肌中分化成子宫肌的能力。
[16]平滑肌组织再生用组合物，包含[10]～[15]中任一项所述的平滑肌干细胞。
本说明书包括作为本申请的优先权基础的日本专利申请2008—103867号的说明书和／或附图中记载的内容。
附图说明
图1—1是表示用被荧光标记的抗体实施了染色的子宫肌分散细胞的流式细胞仪解析结果的图。
图1—2是表示DP／Lin-、nonDP／Lin-及Lin+中的ABCG2的RT-PCR表达解析结果的图。图中，组织是指通过机械·酶处理进行分散时的子宫肌细胞(DP／Lin-、nonDP／Lin-及Lin+)，NC表示以蒸馏水为模板的阴性对照。
图2是将细胞增殖活性表示为指标的关于在正常氧浓度20％或低氧浓度2％下培养的DP／Lin-及其他组分的增殖的图。
图3是表示在骨细胞诱导培养基下培养的DP／Lin-(图3A)及nonDP／Lin-(图3B)的碱性磷酸酶染色显微镜像的照片。
图4是表示在脂肪细胞诱导培养基下培养的DP／Lin-(图4A)及nonDP／Lin-(图4B)的油红O染色显微镜像的照片。
图5是表示在软骨细胞诱导培养基下培养的DP／Lin-的甲苯胺蓝染色显微镜像的照片。
图6是表示移植了DP／Lin-的NOG妊娠小鼠子宫的荧光免疫染色像的照片。
图7是表示移植了nonDP／Lin-的雌激素(E2)缓释小粒移植NOG小鼠子宫的荧光免疫染色像的照片。
图8是表现移植了DP／Lin-、DP／Lin-及Lin+的NOG小鼠子宫因雌激素(E2)缓释小粒移植、妊娠而产生的人细胞的比例的图。
图9是表示未进行使用Lin标记物的初拣选的子宫肌分散细胞的流式细胞仪解析结果的图，所述Lin标记物实施了利用经荧光标记的抗体的染色。
图10是表示以DP(Double positive；CD49f(+)CD34(+))组分中的CD31的表达为指标的细胞亚组分的细胞分布的图。
图11是表示DP组分、CD49f(-)CD34(+)组分及CD34(-)组分中的分化标记物基因的表达解析结果的图。
图12是表示DP组分的细胞群落形成状态的照片。
图13是表示DP组分、CD49f(-)CD34(+)组分、CD34(-)组分、DP组分中的CD31(+)亚组分(DP31+)及DP组分中的CD31(-)亚组分(DP31-)的群落形成能力的图。
图14是表示将DP组分移植到重度免疫缺陷小鼠子宫内的结果的照片。
具体实施方式
本发明的干细胞是从平滑肌中分离的来自平滑肌组织的干细胞。作为本发明的干细胞来源的平滑肌，可以举出子宫平滑肌、内脏平滑肌、血管平滑肌，优选为子宫平滑肌。可以采集它们的组织片，使细胞分散，从分散的细胞中分离干细胞，例如可以使用子宫肌瘤片。采集平滑肌的动物种类没有限定，可以使用小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠、兔、猫、狗、绵羊、猪、牛、马、山羊、猴、人等哺乳动物。
本发明中，“干细胞”是指具有自身复制能力、具有多能性的细胞。干细胞通常可以在组织受到伤害时将该组织再生。组织干细胞不同于胚性干细胞，是分化方向被限定的细胞，存在于组织中的特定位置，具有未分化的细胞内结构。因此，组织干细胞的多能性水平低。组织干细胞的核／细胞质比高，缺乏细胞内小器官。一般而言，组织干细胞具有多分化能力，细胞周期慢，在个体的一生以上维持增殖能力。本发明中，提到干细胞时是指包含至少一定量干细胞的细胞集团，例如包含90％以上、优选95％以上干细胞的细胞集团。
本发明的平滑肌干细胞是Lin-，CD34阳性且CD49f阳性的细胞。Lin-细胞是指分化抗原为阴性、不具有对应于由干细胞向特定系统的细胞的分化而表达的表面抗原的细胞，即在细胞表面没有表达上述表面抗原的细胞。本发明中是指CD31、CD45及血型糖蛋白A(GPA)为阴性的细胞。CD31是在几乎全部单核细胞、血小板及粒细胞中表达的抗原，CD45是在包括末梢血的淋巴细胞、单核细胞、粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞的全部白细胞中表达的抗原，GPA是与红细胞有关联的抗原。CD34是在未分化的干细胞中表达的细胞，CD49f是在血小板或巨核细胞中表达的细胞。本发明中，将CD34阳性且CD49f阳性的细胞称为双阳性(DP)细胞，将为Lin-、CD34阳性且CD49f阳性的细胞称为DP／Lin-细胞。本发明的平滑肌干细胞进一步表达作为干细胞标记物的ABCG2(ATP-binding cassettetransporter G2，ATP结合盒转运体G2)。
进而，本发明的平滑肌干细胞是CD34阳性且CD49f阳性的细胞。该细胞中，CD45、CD31及血型糖蛋白A可以是阴性，也可以是阳性。本发明中将该细胞均称为双阳性(DP)细胞。
本发明的干细胞可以基于平滑肌细胞的细胞表面的抗原特性进行分离。即，只要从平滑肌细胞中分离Lin-、CD34阳性且CD49f阳性的细胞即可。
另一方面，本发明的干细胞可以以仅CD34及CD49f的表达为指标从平滑肌细胞中分离CD34阳性且CD49f阳性的细胞。进而，此时，可以预先选择CD45阴性细胞，从中分离CD34阳性且CD49f阳性的细胞。
最初使细胞从平滑肌中分散。细胞分散可以通过将组织片进行切片，用胶原酶等酶处理来进行。分散的细胞优选分散至单一细胞的状态，例如可以使其通过细胞过滤网等，进而使用Ficoll-Paque(注册商标)等比重液进行密度梯度离心分离，进一步进行胰岛素处理等，由此使其作为单一细胞分散。
然后，可以使各自用不同的荧光染料标记的针对CD31、CD45、血型糖蛋白A、CD34及CD49f或进而ABCG2的抗体与分散的平滑肌细胞接触，而将具有表面抗原的平滑肌细胞染色，使用流式细胞仪或FACS拣选DP／Lin-细胞，由此分离本发明的平滑肌干细胞。此时，可以用流式细胞仪直接从平滑肌细胞中分离，也可以在用流式细胞仪进行拣选前使用结合了针对包含CD31、CD45及血型糖蛋白A的分化抗原中的1种以上抗原的抗体的磁珠，除去具有分化抗原的细胞，使用FACS从剩余的细胞中分离本发明的细胞。
另外，可以使各自用不同的荧光染料标记的针对CD34及CD49f、或CD45、CD34及CD49f的抗体与分散的平滑肌细胞接触以将具有表面抗原的平滑肌细胞染色，使用流式细胞仪或FACS拣选DP细胞，由此分离本发明的平滑肌干细胞。此时，可以从平滑肌细胞中用流式细胞仪直接分离CD34及CD49f阳性细胞，也可以在用流式细胞仪拣选前使用结合了针对CD45的抗体的磁珠除去具有CD45的细胞，从剩余的细胞中使用FACS分离本发明的细胞。
作为用于标记的荧光染料，可以举出Cy(商标)3、Cy5、TexasRed(注册商标)、APC(a11ophycocyanin，别藻蓝蛋白)、PE(phycoerythrin，藻红蛋白)、PE-Cy5、FITC(fluorescein isothiocyanate，异硫氰酸荧光素)、PerCP等。作为流式细胞仪、FACS，例如可以使用FACS vantage(Becton·Dickinson社制)、FACS Calibur(Becton·Dickinson社制)等。
分离的本发明的干细胞可以通过培养使其增殖。此时，使用的培养基没有限定，可以使用公知的培养基(例如DMEM(Dulbecco′smodified Eagle′s medium)培养基)。特别优选使用公知的干细胞培养用培养基。例如可以使用间充质干细胞培养用培养基间充质干细胞基础培养基(MSCBM))(Cambrex Bio Science社、现Poietics社)、间充质干细胞生长培养基(MSCGM)(Cambrex Bio Science社、现Poietics社)等。可以在培养基中适当添加胎牛血清等血清或青霉素、链霉素等抗生素及各种生理活性物质。另外，培养本发明的干细胞时，在培养氧浓度低于通常培养时的20％的条件下进行。优选在5％以下、更优选在2.5％以下、特别优选在2％的条件下进行。可以通过用该方法进行培养，使干细胞增殖。只要在组织培养用培养皿中播种细胞进行培养即可。
进而，可以将分离的本发明的干细胞在体外分化诱导成特定的组织细胞。因为本发明的干细胞具有多能性，所以基本上可以分化诱导成任意的组织细胞。用于各种组织的分化诱导培养基在市场上销售，可以使用上述市售培养基进行分化诱导。例如分化诱导成骨细胞时，只要使用BulletKit成骨细胞分化培养基(Cambrex Bio Science社、现Poietics社)即可，分化诱导为脂肪细胞时，只要使用BulletKit脂肪细胞分化培养基(Cambrex Bio Science社、现Poietics社)即可，分化诱导成软骨细胞时，只要使用BulletKit软骨细胞分化培养基(Cambrex Bio Science社)进行培养即可。另外，也可以将本发明的平滑肌干细胞分化诱导成子宫肌组织细胞等平滑肌组织细胞。此时，在氧浓度为通常的细胞培养条件、即在约20％的条件下进行。可以将分化为上述组织细胞的细胞进一步培养，构筑组织。
干细胞是否分化诱导为组织细胞可以通过调查各组织细胞中特有的标记物的表达来决定。例如分化为骨细胞可以根据是否有碱性磷酸酯酶染色阳性细胞来调查，分化为脂肪细胞可以根据是否有油红O染色阳性细胞来调查。进而，分化为软骨细胞可以根据是否有甲苯胺蓝染色阳性软骨小粒来调查。
进而，本发明包含使本发明的平滑肌干细胞永生化的细胞系。该细胞系兼具增殖能力及多能性，可以使其仅增殖需要数量进行利用。建立的细胞系可用作平滑肌的分化、发生等研究用工具。人的细胞因放射线或突变诱发物质或病毒而变成永生化细胞(有时为癌细胞)，特别是最近，作为不引发肿瘤化或染色体异常、比较保持原始的细胞特性地使其永生化的方法，进行的是将人端粒酶逆转录酶基因(hTERT)或SV40T基因等导入细胞内。
本发明的平滑肌干细胞可用于再生医疗等。例如可以将本发明的平滑肌干细胞用注射器通过注射移植给予到损伤的平滑肌部位，使得干细胞分化成平滑肌细胞，将损伤的平滑肌再生。另外，也可以如上所述将本发明的干细胞在体外进行分化诱导，构筑组织，将该组织移植。在上述再生医疗中，为了避免移植的细胞或组织被受体排斥，优选从要进行再生医疗的患者中采集组织片，从该组织片中分离本发明的平滑肌干细胞，进行利用。例如可以从因子宫肉瘤等疾患而切除了一部分子宫的患者的残留部分的子宫肌中采集组织片，从该组织片中分离子宫肌干细胞，用于上述患者的子宫再生。另外，如上所述，本发明的平滑肌干细胞也可以分化成其他组织。例如可以从平滑肌以外的特定组织被损伤的患者中，由子宫肌等平滑肌取出组织片，分离平滑肌干细胞，将该平滑肌干细胞分化诱导成被损伤的组织，由此可以用于平滑肌以外的组织的再生医疗。本发明也包括含本发明的干细胞的再生医疗用组合物、即再生医疗用制剂。
进而，可以通过将来自人的本发明的干细胞移植给作为人以外的动物的免疫缺陷动物，得到部分地具有人的平滑肌组织的模型动物。例如通过将本发明的平滑肌干细胞移植到免疫缺陷动物的平滑肌中，本发明的干细胞分化成平滑肌，而在动物体内部分地构筑人平滑肌组织。在动物体内构筑人平滑肌组织只要测定细胞表达的人平滑肌特有的蛋白质，确认形态上具有平滑肌的特征即可。例如平滑肌为子宫肌时，只要确认波形蛋白(vimentin)阳性即来自人(红色)、并且αSMA阳性细胞(绿色)、形态上为子宫平滑肌即可。由此得到的部分地具有人平滑肌组织的动物可以作为具有人平滑肌组织的模型动物利用。例如平滑肌为子宫肌时，可以用于使子宫收缩或使子宫舒缓的药剂的筛选。另外，使本发明的平滑肌干细胞癌化进行移植时，可以制作具有人子宫癌等的模型动物，可以用于治疗剂的筛选。作为免疫缺陷动物，可以举出scid小鼠、NOG小鼠等免疫缺陷小鼠。
通过以下的实施例具体说明本发明，本发明不受下述实施例的限定。
实施例1子宫肌双阳性细胞(DP／Lin-细胞)的制备
(1)单一分散子宫肌细胞的制备
将从人子宫分离的子宫肌瘤片用剪刀剪成约2mm3的小片，将其以相对于1g组织片为10ml的比例移植到含有0.2％(w／v)的胶原酶(和光纯药、大阪)、0.05％(w／v)的DNaseI(GIBCO、美国加利福尼亚州)的DMEM培养基(含有1％的抗生素-抗真菌剂[GIBCO]、10％的胎牛血清[BioWest、美国福罗里达州]的Dulbecco’s modifiedEagle’s培养基[DMEM、Sigma-A1drich、美国密苏里州])中，在37℃下振荡16小时，进行酶促细胞分散处理。接下来，用400μm孔径的聚乙烯网进行过滤后，进而使细胞通过40μm孔径细胞过滤网(BDBiosciences、美国马萨诸塞州)，分散至单一细胞的状态。接下来，将上述分散的细胞重叠在Ficoll-Paque PLUS(Amersham Biosciences、美国新泽西州)上，以780×g实施15分钟的密度梯度离心，从表面层回收单一细胞的分散液。将其用0.05％(w／v)胰岛素-EDTA(Sigma-Aldrich)·0.05％(w／v)DNaseI溶液进行酶处理，通过吹打制成完全分散的细胞集团。
(2)用荧光标记抗体进行细胞染色
使上述分散的单一子宫肌细胞集团以2×106的浓度浮游在含2％胎牛血清、10mM HEPES及1％青霉素及链霉素的Hank's平衡化缓冲液(不含钙及镁、HBSS+)，加入荧光标记抗体，在4℃下使其反应30分钟。接下来于4℃进行离心后，使其浮游在2ml的上述Hank's液中，为了拣选死细胞用碘化丙啶(PI)进行染色。
使用的荧光标记抗体是PE结合抗CD31抗体(IgGl、BDBiosciences)、PE结合抗CD45抗体(IgGl、BD Biosciences)、PE结合抗Glycohporin A抗体(IgG2b、BD Biosciences)、APC结合抗CD34抗体(IgGl、BD Biosciences)及FITC结合抗CD49f抗体(IgG2a、BD Biosciences)。
(3)子宫肌双阳性细胞(DP／Lin-)的分离
基于荧光强度通过流式细胞仪将细胞集团二维展开。将上述进行了染色的分散细胞使用流式细胞仪(FACS Vantage SE，BectonDickinson社)及解析软件(Cell-Quest，Becton Dickinson社)进行解析。
图1表示该细胞分布图。由此边进行二维展开边收集1×105的细胞，拣选Lin(CD31，CD45，Glycophorin A)阳性细胞(Lin+)和阴性细胞(Lin-)后(图1—1A及B)，区分成CD34阳性／CD49f阳性细胞(双阳性细胞；DP／Lin-)及其他细胞(nonDP／Lin-)(图1-1C)。最终分取双阳性细胞(DP／Lin-)组分，作为子宫肌DP／Lin-细胞。
(4)分化标记物基因的表达解析
使用Trizo1(Invitrogen，加利福尼亚州)从上述分离的DP／Lin-、nonDP／Lin-及Lin+中提取总RNA，通过反转录聚合酶链反应(RT-PCR)解析ABCG2的信使RNA的表达。图1-2是其结果。需要说明的是，作为内标的GAPDH的表达水平在两者间没有差别。这表示DP／Lin-与其他组分相比将作为干细胞标记物的ABCG2高表达、处于分化度比较低的未成熟阶段，DP／Lin-具有与组织干细胞的特性一致的性质。
实施例2子宫肌双阳性细胞(DP／Lin-细胞)的培养
不是在通常的培养氧浓度即20％的条件下，而是在2％的低氧浓度下，在Multi-Gas Incubator(Astec社、福冈)中进行培养。
结果，在20％氧浓度下进行培养时，即使经过3周，细胞与其他组分相比也没有增殖，而在2％的低氧浓度下培养1周时，形成细胞群落，在2周时，细胞增殖至几乎铺满(图2)。
实施例3子宫肌双阳性细胞(DP／Lin-细胞)的分化诱导分析
为了研究上述培养DP／Lin-是否具有作为干细胞特性之一的多分化能力，将DP／Lin-分别在可分化诱导成脂肪细胞、骨细胞及软骨细胞的培养基中进行培养，研究是否能够分化成不同的细胞系谱。
作为用于骨细胞的分化诱导培养基，使用Prekit成骨细胞分化培养基(Cambrex Bio Science社制、三光纯药销售、制品编号PT-3002)，作为用于脂肪细胞的分化诱导培养基，使用PreKit脂肪细胞分化培养基(Cambrex Bio Science社制、三光纯药销售、制品编号PT-3004)。作为用于软骨细胞的分化诱导培养基，使用PreKit软骨细胞分化培养基(Cambrex Bio Science社制、三光纯药销售、制品编号PT-4121)。将上述培养后的DP／Lin-和DP／Lin nonDP／Lin-以约5×103／孔的浓度播种到96孔平板上，在MSCGM培养基下以2％(低氧浓度)的氧浓度培养约2～3周直至铺满。在用于以下的分化诱导的培养开始时，将氧浓度恢复至通常水平即20％，进行分化诱导。
向骨分化
上述培养DP／Lin-被分化诱导为骨细胞。每3～4日更换上述骨细胞诱导培养基，培养2～3周。向骨细胞的分化以碱性磷酸酯酶染色阳性细胞的出现进行评价。结果，DP／Lin-时大量出现碱性磷酸酯酶染色阳性细胞(紫色)(图3A)，而non DP／Lin-时几乎没有确认出现碱性磷酸酯酶染色阳性细胞(图3B)。
向脂肪分化
上述培养DP／Lin-被分化诱导成脂肪细胞。首先，在用上述脂肪细胞基础培养基培养3日后，用脂肪细胞分化诱导培养基培养1～3日。以此为1个循环进行3个循环，最后用基础培养基培养最多1周后，进行清洗·固定，为了将脂肪滴染色而进行油红O染色。结果，DP／Lin-时出现油红O染色阳性细胞(红色)(图4A)，而nonDP／Lin-时几乎完全没有确认有油红O染色阳性细胞(图4B)。
向软骨分化
上述培养DP／Lin-被分化诱导成软骨细胞。每3～4日更换上述软骨细胞诱导培养基，用2～3周在15ml离心管内进行三维培养。向软骨细胞的分化用甲苯胺蓝染色阳性软骨小粒的出现进行评价。结果，DP／Lin-时出现甲苯胺蓝染色阳性软骨小粒(紫色)(图5)，而nonDP／Lin-时没有确认有软骨小粒。
实施例4向重度免疫缺陷小鼠移植子宫肌双阳性细胞(DP／Lin-细胞)的实验
将含有10％戊巴比妥(大日本药品制)的磷酸缓冲液(Sigma)以350μl对NOG(NOD／SCID／γC null)小鼠(财团法人实验动物中央研究所、川崎市)进行腹腔内注射，将其麻醉。将上述分离得到的约5×104个DP／Lin-及DP／Lin-使用29G的注射针注入NOG小鼠的各子宫角，然后饲养约4～5周。进行上述移植4～5周后，将移植后NOG小鼠分成3组，进行干细胞在生物体内的动态解析。首先，为了使第1组为高雌激素环境，皮下移植2片雌激素(E2)缓释小粒(InnovativeResearch of America、美国福罗里达州)。然后，第2组什么都不做。最后，使第3组与雄小鼠交配，在妊娠第18.5日供解析。
荧光组织染色
摘除子宫，包埋在Tissue-Tek OCT compound(Sakura Finetech、美国加利福尼亚州)中进行冻结，使用低温恒温器(LeicaMicrosystems、德国·Wetzler市)以6μm厚度进行连续切片。对于得到的冻结切片，用4％甲醛在室温下固定20分钟后，用磷酸缓冲液进行清洗。用含有0.2％Triton X-100的磷酸缓冲液进行10分钟细胞膜渗透处理后，在10％牛血清白蛋白溶液中浸渍30分钟以施行封闭处理。接下来，将进行了上述处理的切片与针对子宫平滑肌标记物即α-平滑肌肌动蛋白(αSMA)的抗体(clone1A4，200倍稀释、DAKOCytomatio、丹麦)在4℃下反应一整夜后，使用Alexa Fluor488(绿色荧光用)标记二次抗体(Molecular Probes、美国俄勒冈州)(稀释1000倍，37℃，1小时)以检测一次抗体。接下来，使其与被红色用荧光染料Cy3(Sigma-Aldrich)直接标记的、仅对人的细胞反应的波形蛋白抗体(clone V9)反应，进行荧光二重染色。进而，切片用核染色剂TOTO-3(Molecular Probes)进行对比染色。将各染色后的切片用TCS SP2共焦显微镜(Leica Microsystems)进行显微镜检查。
结果，如图6所示，在移植了DP／Lin-的子宫中出现波形蛋白阳性即来自人(红色)、并且为αSMA阳性细胞(绿色)、在形态上也为子宫平滑肌的组织(黄色)。另一方面，移植了nonDP／Lin-及Lin+的子宫没有确认到上述DP／Lin-中观察到的来自人的组织，如图7所示，存在来自人的细胞(红色)，但它们分布在小鼠平滑肌组织(绿色)的间隙内。
另外，可知DP／Lin-的增殖被雌激素片或妊娠刺激，来自人的细胞的比例定量增加(图8)。
这表示DP／Lin-具有构筑子宫平滑肌的能力，而nonDP／Lin-及Lin+不具有该能力，DP／Lin-特异性地具有子宫肌的组织干细胞特性。另外，判明DP／Lin-的增殖被雌激素(E2)缓释小粒或妊娠刺激。
实施例5制备子宫肌CD34阳性／CD49f阳性细胞(没有用Lin标记物进行初拣选的情况)
进一步，以200细胞／cm2的低细胞密度在培养皿内培养分离后的各种细胞组分，解析群落形成能力。解析时，可以用29G针擦过培养皿以把握一个个培养细胞的举动。
(1)单一分散子宫肌细胞的制备
将从人子宫中分离的子宫肌瘤片用剪刀切成约2mm3的小片，以相对于1g组织片为10ml的比例移植到含有0.2％(w／v)的胶原酶(和光纯药、大阪)、0.05％(w／v)的DNaseI(GIBCO、美国加利福尼亚州)的DMEM培养基(含有1％的抗生素-抗真菌剂[GIBCO]、10％的胎牛血清[BioWest、美国福罗里达州]的Dulbecco’s modifiedEagle’s培养基[DMEM、Sigma-A1drich、美国密苏里州])中，在37℃下振荡16小时，进行酶促细胞分散处理。接下来，用400μm孔径的聚乙烯网进行过滤后，进一步使细胞通过40μm孔径细胞过滤网(BD Biosciences、美国马萨诸塞州)，由此分散成单一细胞的状态。接下来，将上述分散后的细胞重叠在Ficoll-Paque PLUS(AmershamBiosciences、美国新泽西州)上，以780×g进行15分钟的密度梯度离心，从表面层中回收单一细胞的分散液。将其用0.05％(w／v)胰岛素-EDTA(Sigma-A1drich)·0.05％(w／v)DNaseI溶液进行酶处理，并通过吹打形成完全分散的细胞集团。
(2)用荧光标记抗体进行细胞染色
使上述分散后的单一子宫肌细胞集团以2×106的浓度浮游在含有2％胎牛血清、10mM HEPES及1％青霉素及链霉素的Hank's平衡化缓冲液(不含有钙及镁、HBSS+)中，加入荧光标记抗体，使其在4℃下反应30分钟。接下来在4℃下进行离心后，使其浮游在2ml的上述Hank’s液中，为了拣选死细胞，用碘化丙啶(PI)进行染色。荧光标记抗体使用实施例1中使用的抗体。
(3)子宫肌CD34阳性／CD49f阳性细胞的分离
对于PI(-)(活细胞)、CD45阴性及FSC(Forward scatter(前方散射光)；表示细胞的大小)150～500的细胞，基于荧光强度，通过流式细胞仪将细胞集团二维展开。使用流式细胞仪(FACS VantageSE，Becton Dickinson社)及解析软件(Cell-Quest，Becton Dickinson社)解析上述进行了染色的分散细胞。分级的细胞的分化标记物基因的表达解析用与实施例1同样的方法进行。进而，用与实施例2相同的方法研究群落形成能力。进而，用与实施例4同样的方法移植到重度免疫缺陷小鼠中。
图9表示细胞分布。图9A表示细胞集团整体的细胞分布，图9B、C及D分别表示DP(Double positive；CD49f(+)CD34(+))组分、CD49f(-)CD34(+)组分及CD34(-)组分的各组分的细胞分布。横轴表示CD49f的强度，纵轴表示CD34的强度。PI(-)的活细胞中的DP(Double positive)组分为9.8％，49f(-)34(+)组分为13.7％，34(-)组分为43.8％。从中分取DP(CD49f(+)CD34(+))组分。
图10表示以DP组分中的CD31的表达为指标的细胞亚组分的细胞分布。如图所示，DP组分根据CD31是否表达进一步分为2个亚组(DP31+及DP31-)。图10A表示细胞集团整体的细胞分布，图10B表示DP组分的细胞分布。图10C表示DP组分的CD31的表达谱，图10D表示CD31(+)组分的细胞分布，图10E表示CD31(-)组分的细胞分布。在单一子宫肌细胞集团的PI(-)的细胞中存在3.6％CD31阳性细胞，存在3.7％CD31阴性细胞。
图11表示DP组分、CD49f(-)CD34(+)组分及CD34(-)组分中的分化标记物基因的表达解析结果。如图11所示，DP组分与其他组分相比，ERα、ERβ及平滑肌分化标记物的表达水平低。另一方面，ABCG2强表达。
图12表示DP组分的细胞的第1日(A)、第7日(B)、第14日(C)及第21日(D)的群落形成状态。图12E及F表示增殖中的群落的状态。另外，图13表示DP组分、CD49f(-)CD34(+)组分、CD34(-)组分、DP组分中的CD31(+)亚组分(DP31+)及DP组分中的CD31(-)亚组分(DP31-)的群落形成能力。如图所示，DP组分与其他组分(CD49f(-)CD34(+)组分、CD34(-)组分)相比群落形成能力高。另外，在DP组分中的CD31(+)亚组分和CD31(-)亚组分之间没有确认到群落形成能力存在差别。
图14表示将DP组分移植到重度免疫缺陷小鼠子宫内的结果。如图所示，移植了DP组分的子宫出现波形蛋白阳性即来自人(红色)、并且为αSMA阳性细胞(绿色)、形态上也为子宫平滑肌的组织(黄色)。这表示DP组分的细胞具有构筑子宫肌样组织的能力。
由此可知，不用谱系(1ineage)标记物进行拣选、以CD34及CD49f的表达为指标即可分离子宫平滑肌干细胞。
产业上的可利用性
如实施例所示，本发明的特征在于CD31、CD45及血型糖蛋白A为阴性、CD34及CD49f为阳性的DP／Lin-及特征在于CD45为阴性、CD34及CD49f为阳性的DP具有1)未分化状态、2)多分化能力、3)自身组织构筑能力这样的组织干细胞特性，所以DP／Lin-及DP是子宫肌的组织干细胞，根据本方法在世界上首次成功分离子宫肌的组织干细胞。分离的DP／Lin-及DP在进行子宫肌的发生机制、负责妊娠·分娩中的子宫肌的增殖·退缩·功能表达的细胞机制、进而子宫肌瘤等来自子宫肌的疾患的病因解析或针对于此的药剂开发方面，成为有用的生物资源。另外，也期待DP／Lin-细胞及DP细胞作为其他脏器治疗中的细胞材料进行临床应用。
本说明书中引用的全部刊物、专利及专利申请直接作为参考引入本说明书中。

Claims (10)

1.分离平滑肌干细胞的方法，其是分离来自哺乳动物平滑肌的平滑肌干细胞的方法，包括：使哺乳动物平滑肌细胞与用荧光染料标记的抗CD31抗体、抗CD45抗体、抗血型糖蛋白A抗体、抗CD34抗体及抗CD49f抗体接触，分离不与抗CD31抗体、抗CD45抗体及抗血型糖蛋白A抗体结合、而与抗CD34抗体及抗CD49f抗体结合的细胞。
2.如权利要求1所述的分离平滑肌干细胞的方法，其中，使用流式细胞仪拣选细胞。
3.如权利要求1所述的分离平滑肌干细胞的方法，其中，包括：通过流式细胞仪将哺乳动物平滑肌细胞拣选为Lin阳性细胞和Lin阴性细胞，采集Lin阴性细胞，进而采集CD34阳性且CD49f阳性的细胞，其中Lin是CD31、CD45和血型糖蛋白A。
4.如权利要求1所述的分离平滑肌干细胞的方法，其中，平滑肌为子宫肌。
5.如权利要求1所述的分离平滑肌干细胞的方法，其中，哺乳动物为人。
6.分离的平滑肌干细胞，通过权利要求1所述的方法分离，CD31、CD45及血型糖蛋白A为阴性，CD34及CD49f为阳性。
7.如权利要求6所述的分离的平滑肌干细胞，其中，进而ABCG2为阳性。
8.如权利要求6所述的分离的平滑肌干细胞，具有通过移植到平滑肌中而分化成平滑肌的能力。
9.权利要求8所述的分离的平滑肌干细胞，其来自子宫肌，具有通过移植到子宫肌中而分化成子宫肌的能力。
10.平滑肌组织再生用组合物，包含权利要求6所述的分离的平滑肌干细胞。
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