DE10105420B4

DE10105420B4 - In vitro Zellinteraktionskultursystem für Medikamententestung und -entwicklung

Info

Publication number: DE10105420B4
Application number: DE10105420A
Authority: DE
Inventors: Thomas Dr.med. Häupl; Christian Dr.rer.nat. Kaps; Michael Dr.rer.nat. Sittinger; Heike Dipl.-Chem. Smolian
Original assignee: OLIGENE GmbH; TRANSTISSUE TECHNOLOGIES GmbH
Current assignee: OLIGENE GMBH, 10117 BERLIN, DE; TRANSTISSUE TECHNOLOGIES GMBH, 10117 BERLIN, DE
Priority date: 2001-01-31
Filing date: 2001-01-31
Publication date: 2006-03-30
Anticipated expiration: 2021-02-01
Also published as: WO2002061420A2; DE10105420A1; WO2002061420A3

Abstract

In vitro Zellinteraktionskultursystem aus einer ersten Zellkultur bestehend aus pelletierten und vorkultivierten Zellen, ausgenommen menschliche embryonale Stammzellen und Keimblattzellen, und aus einer zweiten Kultur, die auf die erste Kultur aufgebracht ist, bestehend aus Zellen, die ein erkranktes oder gesundes Gewebe simulieren.

Description

Die Erfindung betrifft ein in vitro Zellinteraktionssystem für die Medikamententestung und -entwicklung in Gestalt interaktiver Zellkulturen. Mit den Techniken der dreidimensionalen Gewebezüchtung (Tissue Engineering) werden komplexe in vitro Testsysteme aufgebaut, die den in vivo Verhältnissen im gesunden wie im chronisch erkrankten Gewebe am Beispiel des Gelenks sehr nahe kommen. Sie werden für Studien zu den Wechselwirkungen von bekannten und in Entwicklung befindlichen Medikamenten mit dem zu untersuchenden Gewebe eingesetzt. Ferner werden sie zur Identifizierung neuer therapeutischer Angriffspunkte verwendet.

1. Hintergrund

1.1. Arthritis und Arthrose

Die Knorpelzerstörung bei Arthritis und Arthrose ist bislang nur unzulänglich therapeutisch beeinflussbar. Die zugrundeliegenden Pathomechanismen sind bei beiden Erkrankungen nur unzureichend geklärt (van den Berg, 1998 – Literaturverzeichnis am Ende der Ausführungsbeispiele).

Bei der Arthritis wird eine primär vom Synovialgewebe ausgehende Entzündung mit aktiver Invasion des entzündeten Synovialgewebes (Pannusgewebe) in den Knorpel als Grundlage der Gelenkzerstörung angesehen (Gay, 1993). Dabei wurden zahlreiche immunologisch spezifische und unspezifische zelluläre Reaktionen beschrieben sowie Entzündungsvermittler, entsprechende Rezeptoren, knorpelzerstörende Enzyme und zunehmend auch intrazelluläre Regelkreise und Aktivierungswege.

Die Arthrose wird als primär abnutzungsbedingt gesehen mit einer vom Knorpel ausgehenden Gelenkzerstörung, bei der eine Synovitis als sekundär induzierter Prozess interpretiert wird.

Die Differenzierung zwischen beiden Erkrankungen erfolgt anhand anamnestischer und klinischer Beurteilung, systemischer Entzündungsparameter sowie bildgebender Verfahren. Histologische Methoden kommen erst in zweiter Linie zum Einsatz, und verlässliche molekularbiologische Parameter fehlen derzeit völlig.

Demzufolge besteht bislang keine adäquate Möglichkeit, die therapeutische Einflussnahme und Wirksamkeit der eingesetzten Medikamente oder auch physikalischen Maßnahmen auf molekularer Ebene zu überprüfen.

Ferner besteht eine sehr lückenhafte Vorstellung über die bedeutsamen Entzündungsabläufe. Ein umfassender Überblick über sämtliche pathophysiologischen Fehlregulationen fehlt und kann erst mit der Verfügbarkeit der Daten über das vollständige menschliche Genom in Aussicht gestellt werden.

Mit der Kenntnis der tatsächlichen molekularen Veränderungen bei Arthritis und Arthrose im Knorpel wie im Synovialgewebe könnten die tatsächlich bedeutsamen Pathomechanismen aufgedeckt werden. Durch die Untersuchung des Wirkungsprofils bekannter derzeit im Einsatz befindlicher Medikamente ließe sich erkennen, ob diese Pathomechanismen ausreichend therapeutisch beeinflusst werden. Schließlich können durch eine hierarchische Gliederung nach der Bedeutsamkeit der einzelnen pathophysiologischen Entzündungs- und Stoffwechselwege wichtige und neue oder ergänzende therapeutische Angriffspunkte erkannt werden und daraus neue oder ergänzende Therapiestrategien und Wirkstoffe entwickelt werden.

1.2. Therapie chronischer Gelenkerkrankungen

Bislang etablierte Therapien bei Arthritis und Arthrose bedienen sich im wesentlichen einer entzündungshemmenden Strategie durch Cyclooxygenase-Inhibition, Einsatz von Steroiden und Hemmung allgemeiner zellulärer Syntheseleistungen z.B. über Folsäureantagonisierung, Nukleinsäuresynthesehemmung oder Alkylantienwirkung (Gotzsche, 2000). Modernere Therapieformen, die Angriffspunkte auf molekularer Ebene suchen unter Verwendung von spezifischen Antikörpern, löslichen Rezeptoren, natürlichen Antagonisten oder daraus abgeleiteten Fusionsprodukten/Derivaten (bekannt auch unter der Bezeichnung Biologicals), sind derzeit erst in Entwicklung bzw. erst kurzfristig im Einsatz ohne wesentliche Langzeiterfahrung. Wie bereits unter 1.1. beschrieben, fehlen zu diesen, auf das bruchstückhafte molekulare Verständnis über die Entzündungsabläufe aufbauenden, Therapien ebenso wie zu den obengenannten "traditionellen" Therapeutika umfassende molekulare Studien zum Wirkungsmechanismus.

1.3. Entwicklung von Medikamenten durch in vitro Testung

Die Untersuchung von pathologischen Veränderungen ist bei Primärmaterial von erkrankten Patienten vielen individuellen Besonderheiten unterworfen. Meist kann deshalb nur ein in der Mittelung scheinbar bedeutsamer Krankheitsmechanismus, der sich aus der statistischen Gruppierung der Untersuchungsergebnisse von Patienten ergibt, als therapeutischer Angriffspunkt herausgearbeitet werden. Eine in vitro Simulation dagegen erlaubt über die Vereinfachung eine weitaus größere Vereinheitlichung von Interaktionsbedingungen von Geweben und damit auch eine tiefergehendere Beurteilung der molekularen Vorgängen. Durch die Testung von Medikamenten lassen sich in einem Kulturmodell damit auch zuverlässiger die molekularen Wirkungsmechanismen der Therapeutika erarbeiten und dementsprechend Lücken im Wirkungsprofil dieser Medikamente oder Kombinationstherapien erschließen. Damit können gezielt neue Angriffspunkte für Medikamente erkannt und entsprechende Medikamente entwickelt werden. Ferner kann die Hierarchie der pathophysiologischen Abläufe im in vitro Modell besser abstrahiert werden und dadurch eine möglichst zentrale Einflussnahme angestrebt werden. Diese Möglichkeiten, die eine in vitro Medikamententestung mit in vivo ähnlichen Gewebebedingungen erlaubt, sind vor allem für die Erforschung von chronisch entzündlichen, degenerativen (d.h. durch Alterung hervorgerufene) oder durch pathologische Umbauvorgänge (z.B. Lungenfibrose, Leberzirrhose) geprägte Erkrankungen und die zugehörige Medikamentenentwicklung bedeutsam.

2. Grundzüge der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, Testsysteme zu entwickeln, die den Verhältnissen im gesunden wie im erkrankten Gewebe am Beispiel des Gelenks nahe kommen.

Die Aufgabe wurde durch die Bereitstellung eines in vitro Zellinteraktionssystem – gemäß den Merkmalen des Patentanspruchs 1 – gelöst. Es besteht aus einer ersten Zellkultur mit pelletierten und vorkultivierien Zellen und aus einer zweiten Kultur, die auf die erste Kultur aufgebracht ist und die Zellen enthält, die ein erkranktes oder gesundes Gewebe simulieren. Insbesondere besteht die erste Zellkultur aus pelletierten und vorkultivierten mesenchymalen Zellen und die zweite Kultur aus humanen, immortalisierten Synovialtibroblasten-Zelllinien.

Die Patentansprüche 2 bis 16 stellen bevorzugte Ausführungsformen des erfindungsgemäßen in vitro Zellinteraktionssystems dar.

Die Patentansprüche 17 bis 21 betreffen die erfindungsgemäße Verwendung des in vitro Zellinteraktionssystems.

2.1. In vitro Pannus und in vitro Interaktionskultur

2.1.1. Technik der interaktiven Kultivierung und Medikamententestung

Es werden Kulturen der ersten Zell- bzw. Gewebeart hergestellt, indem die Zellen in einem Kulturgefäß als mehrschichtige Zellhaufen abzentrifugiert werden oder durch ein beigemischtes Substrat wie z.B. Agarose in eine dreidimensionale Anordnung überführt werden. Diese Kulturen werden 2 bis 3 Wochen in Kultur gehalten, um zu reifen und einen entsprechenden Gewebeverband aufzubauen.

Die zweite Zell- bzw. Gewebeart wird auf die erste Kultur aufgebracht, z.B. durch Pipettieren und/oder Aufzentrifugieren. Die therapeutische Beeinflussung kann unmittelbar erfolgen oder nach einer Inkubationszeit von Tagen bis Wochen.

Die Analyse der Medikamenteneffekte erfolgt in Abhängigkeit von der zu untersuchenden Wirkung nach Stunden bis Wochen. Zum Einsatz können verschiedene unter 2.2. beschriebene Analysetechniken kommen.

2.1.2. Beschreibung der ersten Zellkomponente (Knorpelkultur)

2.1.2.1. Primäre Zellen

Für den Aufbau eines in vitro Pannus Interaktionsgewebes werden entweder primäre Knorpelgewebe oder Zellen verwendet, die zu Knorpel differenzieren können. Dabei können Gewebe oder Zellen verschiedener Spezies von einzelnen Individuen oder auch gepoolt eingesetzt werden, z.B. vom Schwein oder vom Rind. Auch können primäre Zellen genetisch verändert werden oder von genetisch mutierten Individuen zum Einsatz kommen (Spontanmutationen, gezielte knock-out oder transgene Mutationen, z.B. der Maus), wenn ein primär pathologischer Gewebeverband simuliert werden soll. Insbesondere können auch vor Aufbau des Organverbandes die dazu verwendeten Zellen bereits therapeutisch manipuliert werden, um die Differenzierung zum spezifischen Organverband zu ermöglichen oder spätere Entzündungsinduktionen oder Tumorinfiltrationen durch ein Sekundärgewebe zu beeinflussen. Ferner kann eine physikalische Einflussnahme auf diese Primärkultur z.B. Druck- und Scherbelastungen bei Knorpel- oder Knochenkulturen ausgeübt werden, deren Einflussnahme im weiteren Verlauf durch die im Kapitel 2.2 beschriebenen Messmethoden aufgenommen werden.

2.1.2.2. Stammzellen

Die Verwendung von mesenchymalen Stammzellen im interaktiven Pannusmodell eröffnet die Möglichkeit, genetisch und physiologisch identische Knorpelkulturen zu etablieren, welches zu einer Minimierung individueller Unterschiede hinsichtlich des Ansprechens auf bestimmte Therapien führt. Des weiteren können unter Verwendung von Stammzellen nicht nur die Wirkungen verschiedener Therapien auf bereits ausgebildeten Knorpel untersucht, sondern vielmehr auch die Effekte von Therapeutika auf sich entwickelnde Knorpelstrukturen und Gewebe vergleichbar mit der embryonalen Entwicklung analysiert werden. Dieses führt zu der Möglichkeit, eine Substanz nicht nur hinsichtlich ihres Therapiepotentials zu testen, sondern vor allem Aussagen über teratogene Eigenschaften dieser Substanz zu treffen. Ferner werden therapeutische Möglichkeiten zur Stimulation des regeneratorischen Potentials prüfbar.

2.1.2.3. Zelllinien und "engineered cells"

Umfangreiche Untersuchungen mit humanen Zellen werfen immer wieder Probleme der ausreichenden Verfügbarkeit von Zellen definierter Herkunft, Differenzierung und Etablierung unter definierten Bedingungen auf. Die Verwendung von genetisch und physiologisch homogenen Zellpopulationen wird durch den Einsatz von Zelllinien oder transformierten Primärzellen aus Patienten erreicht, welche unter definierten Kulturbedingungen zur Ausbildung homogener und reproduzierbarer künstlicher Gewebestrukturen führen. Zudem eröffnet die Verwendung von Zelllinien oder transformierten Zellen die Möglichkeit, diese relativ unkompliziert gentechnisch zu verändern. Durch entsprechend gestaltete gentechnische Veränderungen der immortalisierten Knorpelzellen kann der Einfluss distinkter Faktoren oder Gene auf die zu untersuchenden Zell-Zell-Interaktionen unter standardisierten Bedingungen eingehend untersucht werden. Als Beispiel wäre hier die Expression von Inhibitoren Matrix-abbauender Enzyme von Seiten der Knorpelkultur zu nennen. Hiermit ergeben sich Ansatzpunkte zur Testung gentherapeutisch einsetzbarer Moleküle im Modell rheumatischer Erkrankungen.

2.1.3. Beschreibung der zweiten Zellkomponente ("Pannus")

2.1.3.1. Einzelkomponenten

Bei der Arthritis sind verschiedene Zellen des Synovialgewebes am Entzündungsprozess beteiligt. Diese umfassen ortsständige fibroblastoide Zellen der Synovialmembran, eingewanderte makrophagozytäre Zellen, T-Zellen, B-Zellen, Endothelzellen und Granulozyten. Die Bedeutung jeder einzelnen Zellpopulation für die Chronifizierung des Entzündungsprozesses ist noch nicht geklärt.

Im in vitro Pannus Modell können zunächst die Wirkungen einzelner dieser Zellkomponenten auf die Knorpelkultur untersucht werden. Dabei können etablierte Zelllinien entsprechender Herkunft (monozytär, makrophagozytär, T-zellulär, B-zellulär, endothelial, fibroblastoid, etc.) oder auch von Patienten gewonnene und aufgereinigte Zellen zum Einsatz kommen.

Für die Synovialzellkomponente des in vitro Pannusmodells dienen zum einen primäre Patientenmaterialien – Synovialgewebe – von gesunden Spendern bzw. von Patienten mit Osteoarthrose (OA) oder rheumatoider Arthritis (RA) als Gewebekultur, wobei primäre Zellisolierungen im Modell zum Einsatz kommen.

Um auch bei dieser Zellpopulation die Schwierigkeit der unzureichenden Verfügbarkeit von humanen Zellen definierter Herkunft, Differenzierung und Etablierung unter definierten Bedingungen zu umgehen, ist es möglich, primäre Zell-Linien und immortalisierte (spontan/aktiv immortalisiert) Zell-Linien bzw. Vorläuferzell-Linien (z.B. Fibroblasten, Makrophagen, Monozyten, Granulozyten, B-/T-Zellen, dendritische Zellen, Endothelzellen, HSE (Aicher et al.) bzw. K4IM (Haas et al.) (Transfektion mit einem SV40 T-Antigen Expressionsvektor), U937, Jurkat, infizierte Zelllinien) als Einzelkomponenten oder in definierter Kombination anzuwenden.

2.1.3.2. Kombinationen

Die verschiedenen Zellpopulationen des Synovialgewebes können schrittweise kombiniert und deren Interaktion mit dem primären Knorpelgewebe im in vitro Pannus Modell untersucht werden.

2.1.4. Beschreibung der interaktiven Kultur

Dieses Kulturmodell basiert auf einer Co-Kultur unterschiedlicher Zellpopulationen (z.B. Chondrozyten und synoviale Zellen), die in einer dreidimensionalen Matrix, die der spezifischen zellulären Mikroumgebung Rechnung trägt, kultiviert werden. So lassen sich wesentliche pathogenetische zelluläre Wechselwirkungen beim Prozess der Matrixdestruktion bei der rheumatoiden Arthritis unter in vitro Bedingungen simulieren und untersuchen (Schultz, 1997; Sittinger, US-Patent 5,932,459; Schultz, Druckschrift DE 19540487 A1 ).

2.2. Analyse der Interaktionskultur

Die Analyse der interaktiven Zellkulturen zielt auf die physiologischen und pathogenetischen Wechselwirkungen ab, denen die im System eingesetzten Zellkomponenten sich gegenseitig bedingend ausgesetzt sind. Für das Modell der rheumatischen Arthritis bedeutet dieses beispielsweise, die Untersuchung der Knorpeldestruktion und -integrität als Maß der Aktivität aggressiver Synovialzellen, die Bestimmung der Aktivität Matrix-degradierender Proteine sowie die histologische Untersuchung der Interaktionskulturen als Maß für die Invasivität der Synovialfibroblasten und die beidseitige Aufnahme des Zytokinexpressionsprofils als Maß der entzündlichen Reaktion oder deren Unterbindung durch medikamentöse Behandlung.

Im Einzelnen sollen hier die histomorphologischen Veränderungen zur Evaluierung der Zellinvasion histochemisch, immunhistochemisch und durch in situ-Hybridisierungen zur Bestimmung von die Invasion unterstützenden Genprodukten analysiert werden. Durch die Verwendung von biochemischen Substratanalysen werden mittels Enzym-Substrat-Zymographien die proteolytischen Aktivitäten von Matrixmetallo-Proteinasen wie MMP-1, MMP-2, MMP-3 und MMP-9 nachgewiesen. Die quantitative Bestimmung von inflammatorischen Zytokinen erfolgt mittels Zytokin-ELISA für die Zytokine IL-1beta, IL-1alpha, IL-6, TNF-alpha,IL-10, IL-4, IL-13, IL-8, IL-2, IL-5, IL-18, IL-16, IL-17 und IL-11.

Zur globalen Beschreibung der physiologischen und pathogenetischen Wechselwirkungen, denen die Komponenten des zellulären Interaktionsmodell unterliegen, wie Apoptose/Nekrose (Bc1-Familie, TNF-Familie, Fas-Familie, decoy receptor-Familie, Bax-Familie BH3-Familie, IAP-Familie), Entzündungsvermittlung (TNF-Familie, Interleukine, Interferone, Cyclooxigenase), Entzündungshemmung (TIMP, Interleukine, Oncostatine), Gewebesdestruktion (Matrixmetalloproteinasen, Nitric Oxide Synthase (NOS),) und Gewebeintegrität (Knorpelmatrixmoleküle, wie Kollagene, Proteoglykane, Hyaluronsäurestoffwechsel, link-Protein, Cartilage Oligomeric Matrix Protein) sollen "high-throughput"-Verfahren der DNA Chip Technologie, Protein Chip Technologie und PCR eingesetzt werden. Die bioinformatische Analyse und Bewertung der durch die Chip Technologien zu erwartenden Expressionsprofile ermöglicht die Spezifizierung von Genfamilien und Entzündungs-relevanten Signalwegen, die als Ansatzpunkte für die Entwicklung neuer therapeutischer Substanzen und Strategien dienen.

2.3. Übertragbarkeit auf andere Krankheitsmodelle

2.3.1. In vitro Knochen und Implantate

In der Rekonstruktionschirugie dienen unter anderem anorganische Materialen in Form von Knochenprothesen (Hüftgelenkprothesen, Titanimplantate, Hydroxyapatitimplantate) zum Ersatz von degenerierten Knochenstrukturen (Hofmann, 1994). In der klinischen Anwendung treten hierbei vor allem Probleme hinsichtlich der mechanischen Stabilität der Knochen-Prothesen-Verbindungen und entzündlichen Reaktivität der Implantate selbst auf (Boss, 1994).

Mittels des interaktiven Zellsystems kann hier in vitro die Interaktion von anorganischen Materialien und organisch gewachsenem Knochen in vitro nachgestellt werden, um neue Prothesenmaterialien bereits im Vorfeld in vitro auf ihre Knochenverträglichkeit, ihre Bio- und Osteokompatibilität zu testen. Des weiteren können Verfahren zur Verankerung der Prothese im Knochen durch Untersuchungen der Prothesenoberfläche bezüglich des Einwachsens von Knochenzellen, der Deposition von Knochenmatrix und der Verwendung von osteoinduktiven Faktoren zur Wachstumsstimulation von Knochenzellen durchgeführt werden. Durch Kokultivierung von künstlichen Knochenkulturen mit immunkompetenten Zellen der hämatopoetischen Linie als Knochenmarkzellen oder auch als isolierte Zellkultur kann der Einfluss des Prothesenmaterials auf diese immunkompetenten Zellen im Hinblick auf die Induktion von Entzündungsmediatoren und knochendegenerativen Faktoren eingehender unter definierten Bedingungen in vitro analysiert werden.

2.3.2. Andere chronisch entzündliche und tumoröse Krankheitsmodelle

Ähnlich den ausgeführten Beschreibungen zum in vitro Pannus können chronische Entzündungssituationen bei Tumorerkrankungen (Interaktion von Entzündungszellen mit Tumorgewebe), chronisch-entzündlichen Darmerkrankungen, Myokarditiden, Lungenfibrosen, Hepatitiden, Pankreatitiden, Entzündung und Destruktion der Langerhans Inseln bei Diabetes mellitus Typ I, Myositiden oder Osteomyelitiden durch den Aufbau von interagierenden dreidimensionalen Gewebekulturen wie oben beschrieben in vitro nachgestellt werden.

2.3.3. Infektionsmodelle

Chlamydien sind obligat intrazelluläre Bakterien, welche unter anderem mit der reaktiven Arthritis assoziiert werden und unter Beteiligung von Makrophagen und Synovialzellen zu einer ausgeprägten Gewebeschädigung durch infektionsbedingte Apoptose, Entzündung und immunologische Reaktion führen (Beutler,1994; Sieper, 1999). In einem interaktiven Entzündungsmodell können unter definierten Bedingungen Synovialzellen, Makrophagen oder auch Knorpelzellen mit Chlamydien infiziert und mit Knorpelkulturen oder auch Synovialzellen kokultiviert werden. Diese interaktive Kultur erlaubt beispielsweise die Aufnahme der morphologischen, physiologischen und genetischen Veränderungen von infizierten Zellen und das Erstellen eines zelltyp-bedingten Zytokin-Sekretionsmusters. Des weiteren können in diesem Interaktionsmodell neue Medikamente hinsichtlich ihrer therapeutischen Wirksamkeit auf intrazelluläre Bakterien oder Modulation von Zytokinprofilen ausgelöst durch Chlamydien im zellulären Kontext einer Gelenkumgebung untersucht werden.

Ähnliche Ansätze können auch für andere infektinduzierte Arthritismodell z.B. mit Borrelia burgdorferi als extrazellulärem bzw. fakultativ auch intrazellulär diskutiertem Erreger oder mit Parvovirus B19 vorgenommen werden.

2.3.4. Artifizielle Entzündungsmodelle

Um Entzündung in den oben genannten Modellen zu induzieren oder zu verstärken, können verschiedene proinflammatorische Substanzen wie bestimmte Zytokine, Pflanzenlektine oder Lipopolysaccharide isoliert auf die erste oder zweite Gewebekultur oder deren Zellen oder die gesamte Interaktionskultur angewendet werden. Ferner kann durch gezielte gentechnische Einflussnahme auf eine oder mehrere der verwendeten Zellen, z.B. durch Überexpression von TNF-alpha, eine Entzündungssituation induziert oder verstärkt werden.

Die Merkmale der Erfindung gehen aus den Elementen der Ansprüche und aus der Beschreibung hervor, wobei sowohl einzelne Merkmale als auch mehrere in Form von Kombinationen vorteilhafte Ausführungen darstellen, für die mit dieser Schrift Schutz beantragt wird. Diese Merkmale setzen sich auch aus neuen – dem in vitro Zellinteraktionssystem für Medikamententestung und -entwicklung – und bekannten Elementen – den einzelnen Komponenten – zusammen, die in ihrer Kombination zu dem erfindungsgemäßen neuen vorteilhaften System führen.

Das erfindungsgemäße in vitro Zellinteraktionssystem besteht aus einer ersten Zellkultur aus pelletierten und vorkultivierten mesenchymalen Zellen (vorzugsweise artikuläre Chondrozyten des Schweins) und aus einer zweiten Zellkultur, die auf die erste Zellkultur aufzentrifugiert ist und aus humanen, immortalisierten Synovialfibroblasten-Zellinien (vorzugsweise "HSE oder K4IM, Haas, 1997") besteht. Es ist zur Untersuchung der Wirkungsweise von biologischen und chemischen Substanzen, Biomaterialien, mechanischphysikalischen Einflussnahmen und Gentransfersystemen für therapeutische Zwecke geeignet.

Das in vitro Zellinteraktionssystem wird unter Verwendung von

– beigemischten Substraten (vorzugsweise Agarose, Alginat, Fibrin, Hyaluronsäure, resorbierbaren und nicht-resorbierbaren Biomaterialien) und/oder einer vorher in das Kulturgefäß eingebrachten dreidimensionalen Matrix aus resorbierbaren oder nicht-resorbierbaren Biomaterialien statt der Pelletierungs- und/oder Zentrifugationstechnik
– von nativem Knorpel, chondroiden Zelllinien, chondroiden Tumorzelllinien, primären Chondrozyten, chondrogen induzierten mesenchymalen Stammzellen, chondrogen induzierten embryonalen Stammzellen, chondrogen induzierten Primärzellen, chondrogen induzierten und immortalisierten Primärzellen an Stelle von mesenchymalen Zellen
– von nativem gesunden oder nativem erkrankten Synovialgewebe, aufgereinigten Primärzellen aus gesundem oder erkranktem Synovialgewebe unter Verwendung individueller Populationen oder Kombinationen von Populationen oder auch unter Verwendung von Zelllinien oder Vorläuferzelllinien mit fibroblastoidem (vorzugsweise humane Vorhautfibroblasten – Chiang et al., Pirisi et al.), makrophagozytärem (vorzugsweise Mono Mac 6 – Ziegler-Heitbrock et al.), granulozytärem (vorzugsweise HL-60 – Kasugai et al., Gallagher et al.), dendritischem, monozytärem (vorzugsweise U937, Matsuo et al., Dong et al.), lymphozytärem (vorzugsweise Jurkat, EBV-transformierte B-Zellen, Janssen et al., Hansson et al.) oder endothelialem (vorzugsweise HUVEC, Moldovan et al.) Charakter einzeln oder in Kombination anstelle der humanen, immortalisierten Synovialfibroblasten-Zelllinien
– gentechnisch modifizierter Zellen, die sowohl in der ersten, in der zweiten, als auch in beiden Kulturen enthalten sein können
– von Zellen oder Geweben von Patienten mit akuten, chronischen und genetisch bedingten Gelenkerkrankungen
– von Zellen oder Geweben anderer Spezies (vorzugsweise Vertebraten, insbesondere der Maus oder Ratte) sowie genetisch manipulierter Tiere (vorzugsweise knock-out und transgene Tiere)
– einer ersten Zellkultur mit den Eigenschaften eines Organsystem in vitro (vorzugsweise Knochen, Niere, Leber, Haut, Darm) durch Verwendung entsprechender primärer Organzellen, davon abgeleiteten Zelllinien oder Stammzellen, die zur entsprechenden Organzelle differenziert werden anstelle von mesenchymalen Zellen
– von Zellkulturen mit den Eigenschaften, eine Infiltration, Destruktion und/oder Entzündungssituation der ersten Zellkultur zu induzieren (vorzugsweise durch Verwendung von primären Tumorzellen, Tumorzelllinien oder Zelllinien oder Vorläuferzelllinien mit fibroblastoidem, makrophagozytärem, granulozytärem, dendritischem, monozytärem, lymphozytärem oder endothelialem Charakter einzeln oder in Kombination anstelle von humanen immortalisierten Synovialfibroblasten-Zellinien)

hergestellt.

In weiteren Ausführungsformen wird das erfindungsgemäße in vitro Zellinteraktionssystem unter Zugabe von Erregern (Bakterien, Viren, Protozoen, Parasiten, Prionen) oder pathogenitätsvermittelnden Substanzen einschließlich körpereigener Entzündungs- und Destruktionsvermittler (vorzugsweise Zytokine, Arachidonsäurestoffwechselprodukte, Autoantigene, Hormone, matrixabbauende Enzyme) bzw. davon abgeleiteter Derivate (vorzugsweise Peptide, Proteinbruchstücke oder Fusionsproteine), körperfremder Entzündungs- und Destruktionsvermittler (vorzugsweise Lipopolysaccharide, Lektine, Fremdantigene von Bakterien, Viren, Protozoen, Parasiten, Prionen) oder dimerisierungvermittelnder Substanzen – vorzugsweise zur Dimerisierung von Rezeptoren, wie Quinazoline für EGFR (epidermal growth factor receptor) oder Tomudex für Bax-Proteine – hergestellt.

Die erfindungsgemäße Verwendung des in vitro Zellinteraktionssystems betrifft

– die Implantation und in vivo Verträglichkeitstestung (vorzugsweise Testung einer Tumorgenese /-induktion sowie pleiotroper Effekte auf Nachbargewebe oder den gesamten Organismus), ferner
– die Bestimmung von Stoffwechselaktivität, Vitalität, Enzymaktivitäten, Apoptose, Nekrose, Zellzusammensetzung, Gewebedestruktion, Gewebeinfiltration, Abbau- und Aufbauprodukten von extrazellulären Matrixmolekülen, extra- und intrazellulären Botenstoffen (vorzugsweise der Entzündungsvermittlung und -hemmung), Tumorgenese, Angiogenese, Neovaskularisierung, Gewebedifferenzierung, Gewebededifferenzierung, Wundheilung, Entzündung, Infektion, Autoimmunität,
– die Bestimmung des Genexpressions- und Proteinexpressionsprofils vorzugsweise unter Verwendung von ELISA, DNA-Array Hybridisierung, Protein-Array Hybridisierungen, PCR-Analytik, Gensubtraktionsverfahren (vorzugsweise Representational Difference Analysis und Differential Display PCR), Massenspektroskopie (MALDI TOF)).

Das erfindungsgemäße in vitro Zellinteraktionssystems eignet sich in seiner Verwendung gleichermaßen auch zur Identifizierung neuer therapeutischer Angriffspunkte.

Die Erfindung soll anhand von Ausführungsbeispielen näher erläutert werden, ohne auf diese Beispiele beschränkt zu sein.

Ausführungsbeispiele
Beispiel 1 (Vergleichsbeispiel): Rheumatoide Arthritis (In vitro Pannus)
Der in vitro Pannus ist dadurch gekennzeichnet, dass aggressive Zellen aus der Synovialmembran eines Patienten mit rheumatoider Arthritis mit Knorpelzellgewebe in vitro in Wechselwirkung treten (Invasion).
Die Herstellung des Knorpelzellgewebes erfolgt aus primären Chondrozyten, gewonnen aus porcinem artikulären Knorpel. Während der Kultivierung in Form von Pelletkulturen werden diese Zellen unter Neubildung von extrazellulärer Matrix in eine 3D-Struktur gebracht.
Diese Kulturen werden in einem weiteren Schritt zusammen, d.h. interaktiv mit RA-Synovialgewebszellkulturen kultiviert. Dafür werden die Synovialzellen in Suspension direkt auf die Chondrozyten-Pelletkulturen aufzentrifugiert.
Dieses dreidimensionale interaktive Zellkultursystem aus Chondrozyten mit synovialen Zellen kann hinsichtlich der pathogenetisch relevanten zellulären Wechselwirkungen anhand der in Kapitel 2.2. zusammengestellten Untersuchungsmethoden analysiert werden.
Beispiel 2: Knochen und implantierbare Materialien
Zur Testung implantierbarer Knochenprothesenmaterialien werden dreidimensionale künstliche Knochengewebe hergestellt, auf oder um das Prothesenmaterial herum angelagert und in vitro kultiviert. Für die Herstellung künstlicher Knochengewebe werden vermehrte Spongiosazellen, Periostzellen oder undifferenzierte mesenchymale Stammzellen aus dem Knochenmark, Blut oder Fett verwendet. Diese Zellen werden in dreidimensionale Trägerstrukturen mit Hilfe von Fibrinogen-/Thrombinlösung oder Kollagenmatrix fixiert und unter Einfluss von Dexamethason oder osteogenen Faktoren (z.B.: BMP) für zwei Wochen in vitro vorkultiviert oder direkt mit dem Prothesenmaterial in vitro für vier Wochen kokultiviert. Vorkultivierte Knochengewebe werden mit Hilfe von Fibrinogen/Thrombinlösung oder Kollagenmatrix an das zu testende Prothesenmaterial angelagert und für zwei Wochen kokultiviert. Die Analyse der Knochen-Implantat-Wechselwirkungen erfolgt nach dem im Kapitel 2.2. dargestellten Muster unter besonderer Berücksichtigung Knochenrelevanter Genfamilien.
Beispiel 3: Chlamydien Infektionsmodell
Zur Testung des Infektionsmodells zur reaktiven Arthritis werden dreidimensionale künstliche Knorpelgewebe hergestellt und mit Synovialfibroblasten, die mit Chlamydien infiziert wurden, kokultiviert. Hierzu werden artikuläre Knorpelzellen isoliert und dreidimensional als Pelletkulturen kultiviert. Nach einer zweiwöchigen Vorkultivierung der Zellen wird die zuvor mit Chlamydia trachomatis infizierte humane Synovialfibroblasten-Zelllinie K4IM auf das Knorpelpellet aufzentrifugiert und für weitere vier Tage kultiviert. Die Bestimmung der durch die Infektion mit Chlamydia trachomatis hervorgerufenen entzündlichen Reaktionen erfolgt mittels der im Kapitel 2.2. dargelegten Methoden.
Abkürzungsverzeichnis

• BMP: Bone Morphogenetic Protein
• EBV: Epstein-Barr-Virus
• EGFR: epidermal growth factor receptor
• ELISA: enzyme linked immunosorbent assay
• DNA: desoxyribonucleic acid; DNS: Desoxyribonukleinsäure
• HL-60: HL-60 ein promyelocytisches Zell-Linien-Derivat, s. S.J. Collins, et al. Peripheral blood leukocytes were obtained by leukopheresis from a 36-year-old Caucasian female with acute promyelocytic leukemia
• HSE: SV40 large T antigen immortalisierte humane Synovialfibroblastenlinien von einem Normalspender (Haas C, Aicher WK, Dinkel A, Peter HH, Eibel H)
• HUVEC: human umbilical vein endothelial cells – Endothelzellen aus der Nabelvene
• IAP-Familie: inhibitor of apoptosis proteins
• IL: Interleukin
• K4IM: SV40 large T Antigen immortalisierte humane Synovialfibroblastenlinien von einem Patienten mit Rheumatoider Arthritis (Haas C, Aicher WK, Dinkel A, Peter HH, Eibel H: Characterization of SV40T antigen immortalized human synovial fibroblasts: maintained expression patterns of EGR-1, HLA-DR and some surface receptors)
• MALDI-TOF: matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight
• MMP: Matrixmetalloproteinase
• MonoMac 6: humane Monozytenzelllinie
• NOS Nitric Oxide Synthase
• OA: Osteoarthrose
• RA: Rheumatoide Arthritis
• PCR: polymerase chain reaction – Polymerasekettenreaktion
• SV40 large T antigen: Simian Virus 40 (SV40) belongs to a group of DNA tumor viruses, large T antigen is an early viral oncoprotein
• TIMP: tissue type inhibitor of metalloproteinases
• TNF: Tumornekrosefaktor
• U937: s. Sundstrom and Nilsson 1974: from malignant cells obtained from the pleural effusion of a patient with histiocytic lymphoma, can be induced to terminal monocytic differentiation by supernatants from human mixed lymphocyte cultures, phorbol esters, vitamin D3, gamma interferon, tumor necrosis factor (TNF) and, retinoic acid.

Literaturverzeichnis

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Claims

In vitro Zellinteraktionskultursystem aus einer ersten Zellkultur bestehend aus pelletierten und vorkultivierten Zellen, ausgenommen menschliche embryonale Stammzellen und Keimblattzellen, und aus einer zweiten Kultur, die auf die erste Kultur aufgebracht ist, bestehend aus Zellen, die ein erkranktes oder gesundes Gewebe simulieren.
In vitro Zellinteraktionskultursystem nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die erste Zellkultur aus pelletierten und vorkultivierten mesenchymalen Zellen und die zweite Kultur aus humanen, immortalisierten Synovialfibroblasten-Zelllinien besteht.
In vitro Zellinteraktionskultursystem nach den Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, dass die pelletierten und vorkultivierten mesenchymalen Zellen der ersten Zellkultur aus artikulären Chondrozyten des Schweins und die Synovialfibroblasten-Zelllinien der zweiten Kultur aus den Zelllinien "HSE" und "K4IM" bestehen.
In vitro Zellinteraktionskultursystem nach den Ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass es beigemischte Substrate aus Agarose und/oder Alginat, Fibrin, Hyaluronsäure sowie resorbierbare und/oder nicht-resorbierbare Biomaterialien enthält.
In vitro Zellinteraktionskultursystem nach den Ansprüchen 1 und 4, dadurch gekennzeichnet, dass die erste Zellkultur aus nativem Knorpel und/oder chondroiden Zelllinien, chondroiden Tumorzelllinien, primären Chondrozyten, chondrogen induzierten mesenchymalen Stammzellen, chondrogen induzierten embryonalen Stammzellen, ausgenommen menschliche embryonale Stammzellen und Keimblattzellen, chondrogen induzierten Primärzellen, chondrogen induzierten und/oder immortalisierten Primärzellen besteht.
In vitro Zellinteraktionskultursystem nach den Ansprüchen 1, 4 und 5, dadurch gekennzeichnet, dass die zweite Zellkultur aus Zelllinien oder Vorläuferzelllinien mit fibroblastoidem, makrophagozytärem, granulozytärem, dendritischem, monozytärem, lymphozytärem oder endothelialem Charakter einzeln oder in Kombination anstelle der humanen, immortalisierten Synovialfibroblasten-Zellinien besteht.
In vitro Zellinteraktionskultursystem nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Zelllinien oder Vorläuferzelllinien mit 7.1. fibroblastoidem Charakter aus humanen Vorhautfibroblasten 7.2. makrophagozytärem Charakter aus Mono Mac 6 7.3. granulozytärem Charakter aus HL-60 7.4. monozytärem Charakter aus U937 7.5. lymphozytärem Charakter aus EBV-transformierten B-Zellen 7.6. endothelialem Charakter aus HUVEC bestehen.
In vitro Zellinteraktionskultursystem nach den Ansprüchen 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass die zweite Zellkultur auf die erste Zellkultur aufzentrifugiert ist.
In vitro Zellinteraktionskultursystem nach den Ansprüchen 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass es eine in das Kulturgefäß eingebrachte dreidimensionale Matrix aus resorbierbaren oder nicht-resorbierbaren Biomaterialien enthält, die mit einer 1. Kultur alleine oder in unmittelbarer oder zeitlich getrennter Abfolge mit einer 2. Kultur kombiniert wird.
In vitro Zellinteraktionskultursystem nach den Ansprüchen 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass es gentechnisch modifizierte Zellen enthält, die sowohl in der ersten, in der zweiten, als auch in beiden Kulturen enthalten sein können.
In vitro Zellinteraktionskultursystem nach den Ansprüchen 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass es Zellen oder Geweben anderer Spezies insbesondere 11.1. Vertebraten 11.1.1. der Maus 11.1.2. der Ratte sowie 11.2. genetisch manipulierter Tiere 11.2.1. von knock-out Tieren 11.2.2. von transgenen Tieren 11.2.3. von knock-out und transgenen Tieren enthält.
In vitro Zellinteraktionskultursystem nach den Ansprüchen 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass die erste Zellkultur mit den Eigenschaften eines Organsystems in vitro – insbesondere Knochen, Niere, Leber, Haut oder Darm – durch Verwendung entsprechender primärer Organzellen, davon abgeleiteten Zelllinien oder Stammzellen, die zur entsprechenden Organzelle differenziert werden, ausgestattet ist.
In vitro Zellinteraktionskultursystem nach den Ansprüchen 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass es Zellkulturen enthält, die über die Eigenschaften verfügen, eine Infiltration, Destruktion und/oder Entzündungssituation der ersten Zellkultur zu induzieren.
In vitro Zellinteraktionskultursystem nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass es zur Beeinflussung der ersten Zellkultur primäre Tumorzellen, Tumorzelllinien oder Zelllinien oder Vorläuferzelllinien mit fibroblastoidem, makrophagozytärem, granulozytärem, dendritischem, monozytärem, lymphozytärem oder endothelialem Charakter einzeln oder in Kombination miteinander enthält.
In vitro Zellinteraktionskultursystem nach den Ansprüchen 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass es zur Beeinflussung der Zellkulturen Erreger – insbesondere Bakterien, Viren, Protozoen, Parasiten und/oder Prionen – oder pathogenitätsvermittelnde Substanzen einschließlich körpereigener Entzündungs- und Destruktionsvermittler und/oder davon abgeleitete Derivate, körperfremde Entzündungs- und Destruktionsvermittler oder dimerisierungsvermittelnde Substanzen enthält.
In vitro Zellinteraktionskultursystem nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass es als Pathogenitäts-, Entzündungs- und/oder Destruktionsvermittler 16.1. Zytokine, Arachidonsäurestoffwechselprodukte, Autoantigene, Hormone und/oder matrixabbauende Enzyme und/oder 16.2. davon abgeleitete Derivate, insbesondere Peptide, Proteinbruchstücke und/oder Fusionsproteine 16.3. körperfremde Entzündungs- und Destruktionsvermittler, insbesondere Lipopolysaccharide, Lektine, Fremdantigene von Bakterien, Viren, Protozoen, Parasiten und/oder Prionen oder 16.4. dimerisierungvermittelnde Substanzen und/oder zur Dimerisierung von Rezeptoren geeignete Substanzen, insbesondere Quinazoline für EGFR (epidermal growth factor receptor) oder Tomudex für Bax-Proteine enthält.
Verwendung der In vitro Zellinteraktionskultursysteme nach den Ansprüchen 1 bis 16 zur Untersuchung der Wirkungsweise von biologischen und/oder chemischen Substanzen, Biomaterialien, mechanisch-physikalischen Einflussnahmen und/oder Gentransfersystemen für therapeutische Zwecke.
Verwendung nach Anspruch 17 zur Implantation und zur in vivo Verträglichkeitstestung, insbesondere Testung 18.1. einer Tumorgenese /-induktion sowie 18.2. pleiotroper Effekte auf Nachbargewebe oder den gesamten Organismus.
Verwendung nach den Ansprüchen 17 und 18 zur Bestimmung von Stoffwechselaktivität, Vitalität, Enzymaktivitäten, Apoptose, Nekrose, Zellzusammensetzung, Gewebedestruktion, Gewebeinfiltration, Abbau- und Aufbauprodukten von extrazellulären Matrixmolekülen, extra- und intrazellulären Botenstoffen – insbesondere der Entzündungsvermittlung und – hemmung – der Tumorgenese, Angiogenese, Neovaskularisierung, Gewebedifferenzierung, Gewebededifterenzierung, Wundheilung, Entzündung, Infektion und/oder Autoimmunität.
Verwendung nach den Ansprüchen 17 bis 19 zur Bestimmung des Genexpressions- und Proteinexpressionsprofils mit Hilfe solcher Techniken wie ELISA, DNA-Array Hybridisierung, Protein-Array Hybridisierungen, PCR-Analytik, Gensubtraktionsverfahren – insbesondere Representational Difference Analysis und/oder Differential Display PCR – und/oder Massenspektroskopie.
Verwendung nach den Ansprüchen 17 bis 20 zur Identifizierung neuer therapeutischer Angriffspunkte.