JP3404572B2 - 血管形成の多細胞インビトロ・アッセイ - Google Patents
血管形成の多細胞インビトロ・アッセイInfo
- Publication number
- JP3404572B2 JP3404572B2 JP2000514134A JP2000514134A JP3404572B2 JP 3404572 B2 JP3404572 B2 JP 3404572B2 JP 2000514134 A JP2000514134 A JP 2000514134A JP 2000514134 A JP2000514134 A JP 2000514134A JP 3404572 B2 JP3404572 B2 JP 3404572B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- angiogenesis
- endothelial cells
- vitro assay
- fibroblasts
- culture
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
- 230000033115 angiogenesis Effects 0.000 title claims abstract description 64
- 238000000099 in vitro assay Methods 0.000 title claims abstract description 30
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 claims abstract description 56
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 claims abstract description 35
- 238000003556 assay Methods 0.000 claims abstract description 28
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 claims abstract description 10
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 claims abstract description 9
- 230000005012 migration Effects 0.000 claims abstract description 9
- 238000013508 migration Methods 0.000 claims abstract description 9
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 claims abstract description 5
- 230000003993 interaction Effects 0.000 claims abstract description 5
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 56
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 24
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 19
- 210000003606 umbilical vein Anatomy 0.000 claims description 15
- 230000012010 growth Effects 0.000 claims description 14
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 claims description 14
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 13
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 12
- 238000012800 visualization Methods 0.000 claims description 12
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 claims description 11
- 210000001626 skin fibroblast Anatomy 0.000 claims description 11
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 claims description 9
- 239000002356 single layer Substances 0.000 claims description 9
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 8
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 8
- 108010069381 Platelet Endothelial Cell Adhesion Molecule-1 Proteins 0.000 claims description 7
- 238000011161 development Methods 0.000 claims description 7
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 claims description 7
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 claims description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 6
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 claims description 6
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 claims description 6
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 claims description 5
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims description 5
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 5
- 238000012216 screening Methods 0.000 claims description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 5
- 108010047303 von Willebrand Factor Proteins 0.000 claims description 5
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 claims description 4
- 230000002500 effect on skin Effects 0.000 claims description 4
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 claims description 4
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 claims description 3
- 230000002491 angiogenic effect Effects 0.000 claims description 3
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 claims description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 3
- 238000010191 image analysis Methods 0.000 claims description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 3
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 claims description 3
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 claims description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 2
- 108060003393 Granulin Proteins 0.000 claims 2
- 102000037602 Platelet Endothelial Cell Adhesion Molecule-1 Human genes 0.000 claims 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 claims 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 claims 1
- 230000002900 effect on cell Effects 0.000 claims 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims 1
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 claims 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 claims 1
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 claims 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 abstract description 8
- 230000011712 cell development Effects 0.000 abstract 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 abstract 1
- 210000005239 tubule Anatomy 0.000 description 26
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 16
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 14
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 11
- 108010073929 Vascular Endothelial Growth Factor A Proteins 0.000 description 9
- 102000005789 Vascular Endothelial Growth Factors Human genes 0.000 description 9
- 108010019530 Vascular Endothelial Growth Factors Proteins 0.000 description 9
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 9
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 8
- 102100024616 Platelet endothelial cell adhesion molecule Human genes 0.000 description 8
- 238000003501 co-culture Methods 0.000 description 7
- 210000002536 stromal cell Anatomy 0.000 description 7
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 description 6
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 description 6
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 description 6
- 239000000463 material Substances 0.000 description 6
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 5
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 5
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 5
- 210000002469 basement membrane Anatomy 0.000 description 5
- 230000036770 blood supply Effects 0.000 description 5
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 5
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 5
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 5
- 238000011160 research Methods 0.000 description 5
- WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N Haematoxylin Chemical compound C12=CC(O)=C(O)C=C2CC2(O)C1C1=CC=C(O)C(O)=C1OC2 WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 4
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 3
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 3
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 3
- 239000003636 conditioned culture medium Substances 0.000 description 3
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 3
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 3
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 3
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 3
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 3
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 3
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 3
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 3
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 2
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 229920000742 Cotton Polymers 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010054218 Factor VIII Proteins 0.000 description 2
- 102000001690 Factor VIII Human genes 0.000 description 2
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 2
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 2
- 230000005754 cellular signaling Effects 0.000 description 2
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 2
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 2
- 238000001493 electron microscopy Methods 0.000 description 2
- 230000003511 endothelial effect Effects 0.000 description 2
- 230000006870 function Effects 0.000 description 2
- 229940034998 human von willebrand factor Drugs 0.000 description 2
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 2
- 230000014399 negative regulation of angiogenesis Effects 0.000 description 2
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 2
- 239000002547 new drug Substances 0.000 description 2
- 230000026341 positive regulation of angiogenesis Effects 0.000 description 2
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 2
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 2
- 102100036537 von Willebrand factor Human genes 0.000 description 2
- 229960001134 von willebrand factor Drugs 0.000 description 2
- 230000029663 wound healing Effects 0.000 description 2
- QRXMUCSWCMTJGU-UHFFFAOYSA-N 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate Chemical compound C1=C(Br)C(Cl)=C2C(OP(O)(=O)O)=CNC2=C1 QRXMUCSWCMTJGU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010067225 Cell Adhesion Molecules Proteins 0.000 description 1
- 102000016289 Cell Adhesion Molecules Human genes 0.000 description 1
- 208000032170 Congenital Abnormalities Diseases 0.000 description 1
- 206010010356 Congenital anomaly Diseases 0.000 description 1
- 206010012689 Diabetic retinopathy Diseases 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- 102000016942 Elastin Human genes 0.000 description 1
- 108010014258 Elastin Proteins 0.000 description 1
- 229920002683 Glycosaminoglycan Polymers 0.000 description 1
- 101000782195 Homo sapiens von Willebrand factor Proteins 0.000 description 1
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- 238000012404 In vitro experiment Methods 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 102000012750 Membrane Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108010090054 Membrane Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 1
- 101710204736 Platelet endothelial cell adhesion molecule Proteins 0.000 description 1
- 201000004681 Psoriasis Diseases 0.000 description 1
- 206010040943 Skin Ulcer Diseases 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 1
- 206010052428 Wound Diseases 0.000 description 1
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 210000003484 anatomy Anatomy 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000003149 assay kit Methods 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 230000007698 birth defect Effects 0.000 description 1
- 230000017531 blood circulation Effects 0.000 description 1
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 1
- 208000030224 brain astrocytoma Diseases 0.000 description 1
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 1
- 239000002771 cell marker Substances 0.000 description 1
- 230000012292 cell migration Effects 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 210000003711 chorioallantoic membrane Anatomy 0.000 description 1
- 229940105778 coagulation factor viii Drugs 0.000 description 1
- 239000002537 cosmetic Substances 0.000 description 1
- 230000003831 deregulation Effects 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- KAKKHKRHCKCAGH-UHFFFAOYSA-L disodium;(4-nitrophenyl) phosphate;hexahydrate Chemical compound O.O.O.O.O.O.[Na+].[Na+].[O-][N+](=O)C1=CC=C(OP([O-])([O-])=O)C=C1 KAKKHKRHCKCAGH-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 238000009509 drug development Methods 0.000 description 1
- 238000007876 drug discovery Methods 0.000 description 1
- 229920002549 elastin Polymers 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 229960000301 factor viii Drugs 0.000 description 1
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 1
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 1
- 230000003352 fibrogenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000000834 fixative Substances 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 208000005017 glioblastoma Diseases 0.000 description 1
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 1
- 230000035876 healing Effects 0.000 description 1
- 210000003494 hepatocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000002513 implantation Methods 0.000 description 1
- 238000010874 in vitro model Methods 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000003041 ligament Anatomy 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 239000003226 mitogen Substances 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 1
- 210000004738 parenchymal cell Anatomy 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000002135 phase contrast microscopy Methods 0.000 description 1
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 1
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 1
- 230000004043 responsiveness Effects 0.000 description 1
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 1
- 210000000329 smooth muscle myocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000004872 soft tissue Anatomy 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 210000002435 tendon Anatomy 0.000 description 1
- 230000025366 tissue development Effects 0.000 description 1
- 230000017423 tissue regeneration Effects 0.000 description 1
- 230000008733 trauma Effects 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 230000007306 turnover Effects 0.000 description 1
- 210000001644 umbilical artery Anatomy 0.000 description 1
- 238000009827 uniform distribution Methods 0.000 description 1
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 1
- 210000003556 vascular endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
- 239000003357 wound healing promoting agent Substances 0.000 description 1
- 230000037314 wound repair Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
- G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
- G01N33/502—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing non-proliferative effects
- G01N33/5029—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing non-proliferative effects on cell motility
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
- G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
- G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
- G01N33/5011—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing antineoplastic activity
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
- G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
- G01N33/5044—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics involving specific cell types
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
- G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
- G01N33/5044—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics involving specific cell types
- G01N33/5064—Endothelial cells
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
【０００１】本発明は、血管形成のインビトロ・アッセ
イ、特に血管形成の多細胞インビトロ・アッセイに関す
る。
イ、特に血管形成の多細胞インビトロ・アッセイに関す
る。
【０００２】脊椎動物における、分化細胞の殆どのポビ
ュレーションは、細胞の死および再生によるターンオー
バーに従う。肝臓の肝実質細胞および血管に一列に並ぶ
内皮細胞のような幾つかの充分に分化した細胞は、単純
に分裂して同じ分化タイプの娘細胞を生じる。そのよう
な細胞の増殖速度は、トータルの細胞数を維持するよう
にコントロールされる。従って、肝臓の大部分が破壊さ
れた場合、残りの肝実質細胞は、その損失を回復するよ
うに、それらの分裂速度を増加する。
ュレーションは、細胞の死および再生によるターンオー
バーに従う。肝臓の肝実質細胞および血管に一列に並ぶ
内皮細胞のような幾つかの充分に分化した細胞は、単純
に分裂して同じ分化タイプの娘細胞を生じる。そのよう
な細胞の増殖速度は、トータルの細胞数を維持するよう
にコントロールされる。従って、肝臓の大部分が破壊さ
れた場合、残りの肝実質細胞は、その損失を回復するよ
うに、それらの分裂速度を増加する。
【０００３】内皮細胞は、全ての血管に一列に並ぶ細胞
の単層を形成し、血流と周辺組織との間での交換を制御
している。新しい血管は、これらの内皮細胞の外殖によ
り既存の小血管壁から発生し、該内皮細胞は、培養中で
単離されたときでも中空の毛細管を形成する能力を有す
る。インビボでは、傷害された細胞および幾つかの腫瘍
は、近隣の内皮細胞に毛細血管の新芽を構築するよう刺
激する因子を分泌することによって、血液供給を引き寄
せる。血液供給を引き寄せ得ない腫瘍は、それらの増殖
を著しく制限される。
の単層を形成し、血流と周辺組織との間での交換を制御
している。新しい血管は、これらの内皮細胞の外殖によ
り既存の小血管壁から発生し、該内皮細胞は、培養中で
単離されたときでも中空の毛細管を形成する能力を有す
る。インビボでは、傷害された細胞および幾つかの腫瘍
は、近隣の内皮細胞に毛細血管の新芽を構築するよう刺
激する因子を分泌することによって、血液供給を引き寄
せる。血液供給を引き寄せ得ない腫瘍は、それらの増殖
を著しく制限される。
【０００４】新しい血管が、既存の小血管から出芽する
毛細血管として創始するプロセスは、血管形成(angioge
nesis)と呼ばれる。従って、血管形成は、正常な組織発
生と修復および幾つかの病理学的状態の進行において主
要な役割を果たすと見ることができる。
毛細血管として創始するプロセスは、血管形成(angioge
nesis)と呼ばれる。従って、血管形成は、正常な組織発
生と修復および幾つかの病理学的状態の進行において主
要な役割を果たすと見ることができる。
【０００５】一旦、血管系が充分に発生すると、血管の
内皮細胞は通常は静止状態を維持して、新しい血管を形
成しない。疾病や外傷が起きた場合、新しい血管の形成
は、自然な創傷治癒につれて正常に進行し得るか、或い
は、慢性皮膚潰瘍でのように不充分であり得るか増殖の
脱調節があって、腫瘍形成、糖尿病性網膜症、乾癬およ
び炎症でのように、血管密度の異常な増加が後から起こ
る。非治癒創傷での不適切な血管形成の阻害または血管
形成の増強は、従って、薬物発見プログラムにとって極
めて重要なターゲットである。しかしながら、新薬開発
を導く、この領域での研究は、血管形成のインビトロモ
デルの欠如により妨げられてきた。
内皮細胞は通常は静止状態を維持して、新しい血管を形
成しない。疾病や外傷が起きた場合、新しい血管の形成
は、自然な創傷治癒につれて正常に進行し得るか、或い
は、慢性皮膚潰瘍でのように不充分であり得るか増殖の
脱調節があって、腫瘍形成、糖尿病性網膜症、乾癬およ
び炎症でのように、血管密度の異常な増加が後から起こ
る。非治癒創傷での不適切な血管形成の阻害または血管
形成の増強は、従って、薬物発見プログラムにとって極
めて重要なターゲットである。しかしながら、新薬開発
を導く、この領域での研究は、血管形成のインビトロモ
デルの欠如により妨げられてきた。
【０００６】血管形成は、広範囲の増殖因子、細胞外マ
トリックス分子、酵素および様々な細胞タイプを包含す
る極めて複雑なプロセスである。そのような複雑な関連
性は、インビボでのプロセス全体をモデル化するインビ
トロ・アッセイを開発するのに主要な困難を生じた。血
管形成は、増殖、移動および分化という３相に亜分類さ
れ得る。これらの相それぞれを別々にモデル化するアッ
セイは、存在する。単純なインビトロ・テストは、或る
範囲の細胞タイプの増殖の変化を測定し、基底膜タンパ
ク質の上での移動を評価する。タンパク質マトリックス
の提供に依存する最近のインビトロアッセイ・システム
は、分化する内皮細胞の能力を効果的に測定する。
トリックス分子、酵素および様々な細胞タイプを包含す
る極めて複雑なプロセスである。そのような複雑な関連
性は、インビボでのプロセス全体をモデル化するインビ
トロ・アッセイを開発するのに主要な困難を生じた。血
管形成は、増殖、移動および分化という３相に亜分類さ
れ得る。これらの相それぞれを別々にモデル化するアッ
セイは、存在する。単純なインビトロ・テストは、或る
範囲の細胞タイプの増殖の変化を測定し、基底膜タンパ
ク質の上での移動を評価する。タンパク質マトリックス
の提供に依存する最近のインビトロアッセイ・システム
は、分化する内皮細胞の能力を効果的に測定する。
【０００７】分化を測定するアッセイ・システムは、内
皮細胞によるヒモ様構造の形成を包含する。全てのその
ようなシステムは、その上に細胞が移動して細管を形成
する外因性基底膜タンパク質の細胞への供給に依存す
る。細胞移動は、2-16時間という比較的に短時間で起こ
り、３次元構造を生じる。タンパク質に加えて、システ
ムの多くは、増殖因子の提供を要求し、許容し得る細管
形成を生じる。細管が形成される時間スケールは、分化
の阻害に関する優れたテストを提供するが、増強をテス
トするときにはそれほど有用ではない。
皮細胞によるヒモ様構造の形成を包含する。全てのその
ようなシステムは、その上に細胞が移動して細管を形成
する外因性基底膜タンパク質の細胞への供給に依存す
る。細胞移動は、2-16時間という比較的に短時間で起こ
り、３次元構造を生じる。タンパク質に加えて、システ
ムの多くは、増殖因子の提供を要求し、許容し得る細管
形成を生じる。細管が形成される時間スケールは、分化
の阻害に関する優れたテストを提供するが、増強をテス
トするときにはそれほど有用ではない。
【０００８】上述のアッセイ・システムは、血管形成の
モデル化に最も近くなるが、それらのいずれも血管形成
に要求される３つの段階全てを組合せるものではない。
モデル化に最も近くなるが、それらのいずれも血管形成
に要求される３つの段階全てを組合せるものではない。
【０００９】３次元細胞培養システムの従来技術には、
外因性マトリックスが主として基底膜タンパク質の役割
を模倣するよう利用する例があり、基底膜タンパク質そ
れ自体は、マトリックスがその代わりに利用されるよう
に要求されない。マトリックスは、細胞がそれに接着す
るのを可能にし、その結果、１層以上で増殖する。マト
リックスは、ストロマ細胞が、開口部を貫いて伸張可能
にするよう好適なサイズの開口部を有していなければな
らない。従って、正しいタイプのマトリックスは、培養
される細胞に依存して、選択されなければならない。該
システムは、多量の分化した組織を提供するために使用
され得、または生理学的もしくは病理学的条件の研究の
ためのモデル・システムとして使用され得る。
外因性マトリックスが主として基底膜タンパク質の役割
を模倣するよう利用する例があり、基底膜タンパク質そ
れ自体は、マトリックスがその代わりに利用されるよう
に要求されない。マトリックスは、細胞がそれに接着す
るのを可能にし、その結果、１層以上で増殖する。マト
リックスは、ストロマ細胞が、開口部を貫いて伸張可能
にするよう好適なサイズの開口部を有していなければな
らない。従って、正しいタイプのマトリックスは、培養
される細胞に依存して、選択されなければならない。該
システムは、多量の分化した組織を提供するために使用
され得、または生理学的もしくは病理学的条件の研究の
ためのモデル・システムとして使用され得る。
【００１０】WO96/39101は、生分解性または非生分解性
の３次元の支持体フレームワーク上でのストロマ細胞の
増殖を開示しており、ストロマ細胞は、正常ヒト組織で
産生されるように、該フレームワーク上でヒト細胞外マ
トリックスを合成し、そして３次元フレームワーク上に
堆積する。細胞外マトリックスは、グリコサミノグリカ
ン鎖のネットワークからなる水和ゲル中で編み合わされ
た様々な繊維形成タンパク質を含む。繊維形成タンパク
質は、例えば、コラーゲンおよびエラスチンであり得
る。幾つかのプロセッシング工程の後、プロセッシング
された細胞外マトリックスは、患者の皮内または皮下に
注射され、軟組織を強化し、先天的異常、後天的欠陥ま
たは美容上の欠陥を修復または矯正し得る。
の３次元の支持体フレームワーク上でのストロマ細胞の
増殖を開示しており、ストロマ細胞は、正常ヒト組織で
産生されるように、該フレームワーク上でヒト細胞外マ
トリックスを合成し、そして３次元フレームワーク上に
堆積する。細胞外マトリックスは、グリコサミノグリカ
ン鎖のネットワークからなる水和ゲル中で編み合わされ
た様々な繊維形成タンパク質を含む。繊維形成タンパク
質は、例えば、コラーゲンおよびエラスチンであり得
る。幾つかのプロセッシング工程の後、プロセッシング
された細胞外マトリックスは、患者の皮内または皮下に
注射され、軟組織を強化し、先天的異常、後天的欠陥ま
たは美容上の欠陥を修復または矯正し得る。
【００１１】他方、WO96/40175も、特に様々な異なる細
胞を培養するのに使用されるためのストロマ細胞に基づ
く３次元細胞培養システム、ならびに細管、腱、靱帯お
よび矯正的構造物の形成に使用されるための組織を開示
している。マトリックスのために使用されるこのタイプ
の材料は、人工ポリマー様コラーゲンのような生分解性
のものであり得る。
胞を培養するのに使用されるためのストロマ細胞に基づ
く３次元細胞培養システム、ならびに細管、腱、靱帯お
よび矯正的構造物の形成に使用されるための組織を開示
している。マトリックスのために使用されるこのタイプ
の材料は、人工ポリマー様コラーゲンのような生分解性
のものであり得る。
【００１２】EP0358506に開示される３次元組織培養シ
ステムは、ストロマ細胞の３次元での増殖が、長期間の
培養で、単層システムでよりも細胞の活発な増殖を維持
するという事実に基づく。骨髄、皮膚、肝臓、膵臓など
の組織は全て、そのような３次元システム中で増殖し得
ることが示されている。得られた培養物は、生理学また
は病理学的状態を研究するモデル・システムとして使用
され得ることも記載されている。該マトリックスは、任
意の材料または材料の混合物(例えば、就中、処理され
たナイロン、ゼラチン、セルロースおよび綿)から作製
され得、それら材料は一般に、メッシュに織られて３次
元構造を形成する。生分解性マトリックス上で培養され
たそれらの細胞は、in situで患者にインプラントされ
得る。非生分解性マトリックス上で培養されたそれらの
細胞は、培養物から得られ、続いて、使用されなければ
ならない。
ステムは、ストロマ細胞の３次元での増殖が、長期間の
培養で、単層システムでよりも細胞の活発な増殖を維持
するという事実に基づく。骨髄、皮膚、肝臓、膵臓など
の組織は全て、そのような３次元システム中で増殖し得
ることが示されている。得られた培養物は、生理学また
は病理学的状態を研究するモデル・システムとして使用
され得ることも記載されている。該マトリックスは、任
意の材料または材料の混合物(例えば、就中、処理され
たナイロン、ゼラチン、セルロースおよび綿)から作製
され得、それら材料は一般に、メッシュに織られて３次
元構造を形成する。生分解性マトリックス上で培養され
たそれらの細胞は、in situで患者にインプラントされ
得る。非生分解性マトリックス上で培養されたそれらの
細胞は、培養物から得られ、続いて、使用されなければ
ならない。
【００１３】最後に、US5160490は、インビトロで長期
間にわたり、様々な異なる細胞および組織を培養するの
に使用さ得る３次元培養システムを記載している。所望
の組織からの細胞は、予め確立されたマトリックス上で
接種され増殖される。ストロマ支持体マトリックスは、
３次元マトリックス上で活発に増殖するストロマ細胞を
含む。再度、EP0358506にあるように、マトリックス
は、任意の材料または材料の混合物(例えば、就中、処
理されたナイロン、ゼラチン、セルロースおよび綿)か
ら作製され得、それら材料は一般に、メッシュに織られ
て３次元構造を形成する。その後で患者にインプラント
するために、生分解性マトリックスは、ゼラチンのよう
に使用されるべきである。他方、培養物が長時間にわた
り維持される場合は、ナイロンメッシュタイプのマトリ
ックスが好ましい。
間にわたり、様々な異なる細胞および組織を培養するの
に使用さ得る３次元培養システムを記載している。所望
の組織からの細胞は、予め確立されたマトリックス上で
接種され増殖される。ストロマ支持体マトリックスは、
３次元マトリックス上で活発に増殖するストロマ細胞を
含む。再度、EP0358506にあるように、マトリックス
は、任意の材料または材料の混合物(例えば、就中、処
理されたナイロン、ゼラチン、セルロースおよび綿)か
ら作製され得、それら材料は一般に、メッシュに織られ
て３次元構造を形成する。その後で患者にインプラント
するために、生分解性マトリックスは、ゼラチンのよう
に使用されるべきである。他方、培養物が長時間にわた
り維持される場合は、ナイロンメッシュタイプのマトリ
ックスが好ましい。
【００１４】これらの文献のいずれも、血管形成の組合
せ段階をモニターするための、これらシステムの使用に
ついて何ら言及していない。さらに、モデルとして使用
するための３次元システムの使用は、実際には、可視化
および定量化とも、極めて困難なものにする。従って、
本出願が、２次元アッセイに関するものであり、従来技
術の３次元アッセイよりも可視化および定量的画像化を
目的として非常により好適であるという点で、これらの
従来技術文献に勝る利点を有することが、開示から全く
明らかである。
せ段階をモニターするための、これらシステムの使用に
ついて何ら言及していない。さらに、モデルとして使用
するための３次元システムの使用は、実際には、可視化
および定量化とも、極めて困難なものにする。従って、
本出願が、２次元アッセイに関するものであり、従来技
術の３次元アッセイよりも可視化および定量的画像化を
目的として非常により好適であるという点で、これらの
従来技術文献に勝る利点を有することが、開示から全く
明らかである。
【００１５】全ての引用された文献が、インビトロで延
長された時間、様々な異なる組織の培養を援助する基底
膜タンパク質を明らかに模倣する更なる外因性マトリッ
クスの使用を記載していることは容易に判り得る。本発
明の全体的な目的は、そのようなシステムの使用から外
れることであり、インビトロでインビボ血管形成プロセ
スをモデル化した単純な二重培養システムを提供するこ
とである。
長された時間、様々な異なる組織の培養を援助する基底
膜タンパク質を明らかに模倣する更なる外因性マトリッ
クスの使用を記載していることは容易に判り得る。本発
明の全体的な目的は、そのようなシステムの使用から外
れることであり、インビトロでインビボ血管形成プロセ
スをモデル化した単純な二重培養システムを提供するこ
とである。
【００１６】本発明の目的は、血管形成の３つの段階全
てに依存する血管形成のインビトロ・アッセイを提供す
ることによって、上述の不利な点を取り除く又は軽減す
ることであり、血管形成の刺激および阻害の両方を調べ
るために使用され得る。
てに依存する血管形成のインビトロ・アッセイを提供す
ることによって、上述の不利な点を取り除く又は軽減す
ることであり、血管形成の刺激および阻害の両方を調べ
るために使用され得る。
【００１７】本発明の１つの局面によると、血管形成の
組合せ段階(combined stages)、即ち、細胞発生の増
殖、移動および分化の段階をモデル化するための多細胞
インビトロ・アッセイが提供され、そこでは、該アッセ
イは、内皮細胞およびそれとの相互作用を発揮する他の
細胞タイプとの二重培養物を提供して、インビトロでの
血管形成の組合せ段階を発揮することを包含する。
組合せ段階(combined stages)、即ち、細胞発生の増
殖、移動および分化の段階をモデル化するための多細胞
インビトロ・アッセイが提供され、そこでは、該アッセ
イは、内皮細胞およびそれとの相互作用を発揮する他の
細胞タイプとの二重培養物を提供して、インビトロでの
血管形成の組合せ段階を発揮することを包含する。
【００１８】本発明の１つの局面によれば、そのような
アッセイは、線維芽細胞および内皮細胞の二重培養物の
使用に依存し、標準培養培地における以外の更なる増殖
因子を要求しない。これらの細胞タイプの相互作用は、
それらの間での細胞シグナリング・メカニズムに依存す
ると仮定されている。更なる増殖因子に依存しないこと
は、本標題の過去の研究を考慮すると、驚くべきことで
あり予測しなかったことである。
アッセイは、線維芽細胞および内皮細胞の二重培養物の
使用に依存し、標準培養培地における以外の更なる増殖
因子を要求しない。これらの細胞タイプの相互作用は、
それらの間での細胞シグナリング・メカニズムに依存す
ると仮定されている。更なる増殖因子に依存しないこと
は、本標題の過去の研究を考慮すると、驚くべきことで
あり予測しなかったことである。
【００１９】本発明の他の局面によると、血管形成を促
進または阻害するための薬剤をスクリーニングする方法
が提供され、該方法は、内皮細胞と他の細胞タイプ(好
ましくは、線維芽細胞のような間質細胞)との共同培養
物を培養すること、それとの相互作用を起こさせて血管
形成の組合せ段階を発揮させること、及び目的の複数の
テスト容器を用意して該培養物にコントロールされた量
の該薬剤を提供すること、および容器を観察して血管形
成をモニターすること、を包含する。スクリーニング方
法は、容易に自動化され得、血管形成は公知の自動化さ
れたカウント技術、画像分析またはスペクトログラフに
よってモニターされ得る。
進または阻害するための薬剤をスクリーニングする方法
が提供され、該方法は、内皮細胞と他の細胞タイプ(好
ましくは、線維芽細胞のような間質細胞)との共同培養
物を培養すること、それとの相互作用を起こさせて血管
形成の組合せ段階を発揮させること、及び目的の複数の
テスト容器を用意して該培養物にコントロールされた量
の該薬剤を提供すること、および容器を観察して血管形
成をモニターすること、を包含する。スクリーニング方
法は、容易に自動化され得、血管形成は公知の自動化さ
れたカウント技術、画像分析またはスペクトログラフに
よってモニターされ得る。
【００２０】好ましくは、アッセイは、下記の、
(a)二重細胞培養物を維持するのに好適であり、その中
で少なくとも内皮細胞の増殖を維持するのに好適な培養
培地を有する増殖容器をセットアップする工程、 (b)ヒト線維芽細胞およびヒト内皮細胞の二重培養物を
播き、その予め決められた標的比率を得る工程、 (c)いかなる外因性増殖因子も提供することなく、それ
をインキュベートする工程、 (d)コンフルエントな単層が得られるまで初期増殖相か
らの細胞の経過をモニターする工程、 (e)細胞発生の増殖、移動および分化の段階を通して、
一定時間毎に培養培地を交換する工程、を包含する。
で少なくとも内皮細胞の増殖を維持するのに好適な培養
培地を有する増殖容器をセットアップする工程、 (b)ヒト線維芽細胞およびヒト内皮細胞の二重培養物を
播き、その予め決められた標的比率を得る工程、 (c)いかなる外因性増殖因子も提供することなく、それ
をインキュベートする工程、 (d)コンフルエントな単層が得られるまで初期増殖相か
らの細胞の経過をモニターする工程、 (e)細胞発生の増殖、移動および分化の段階を通して、
一定時間毎に培養培地を交換する工程、を包含する。
【００２１】好ましくは、線維芽細胞は、ヒト成人皮膚
線維芽細胞であり、内皮細胞は、ヒト臍帯静脈内皮細胞
(HUVEC)である。
線維芽細胞であり、内皮細胞は、ヒト臍帯静脈内皮細胞
(HUVEC)である。
【００２２】ヒト成人皮膚線維芽細胞のヒト臍帯静脈内
皮細胞(HUVEC)に対する二重培養物中の細胞比率は、好
ましくは、約2:1〜8:1である。
皮細胞(HUVEC)に対する二重培養物中の細胞比率は、好
ましくは、約2:1〜8:1である。
【００２３】有利には、二重培養物の培養培地は、48時
間毎に変えられる。
間毎に変えられる。
【００２４】本発明の他の局面によれば、線維芽細胞お
よび内皮細胞を維持するのに好適な培養培地が提供さ
れ、二重培養物としての予め決められた比率で該細胞を
播かれた容器を含むアッセイ・キットが提供され、ここ
で、細胞はそれぞれ好ましくは、ヒト成人皮膚線維芽細
胞およびヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)であり、該容器
中の細胞の生存度は、取引先に送られる約24時間前にモ
ニターされる。
よび内皮細胞を維持するのに好適な培養培地が提供さ
れ、二重培養物としての予め決められた比率で該細胞を
播かれた容器を含むアッセイ・キットが提供され、ここ
で、細胞はそれぞれ好ましくは、ヒト成人皮膚線維芽細
胞およびヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)であり、該容器
中の細胞の生存度は、取引先に送られる約24時間前にモ
ニターされる。
【００２５】好ましくは、容器は、ヒト成人皮膚線維芽
細胞のヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)に対する約2:1〜8:
1の細胞比率で含む。
細胞のヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)に対する約2:1〜8:
1の細胞比率で含む。
【００２６】多細胞インビトロ・アッセイに使用するた
めの好ましいテスト・キットは、ヒト成人皮膚線維芽細
胞およびヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)を約2:1〜8:1の
細胞比率で有する二重培養物を播かれた培養容器を含
み、該キットはさらに、内皮細胞増殖を維持し得る増殖
培地、固定液、ブロッキング緩衝液、洗浄用緩衝液、好
適に可視化するための試薬および抗体を含む。
めの好ましいテスト・キットは、ヒト成人皮膚線維芽細
胞およびヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)を約2:1〜8:1の
細胞比率で有する二重培養物を播かれた培養容器を含
み、該キットはさらに、内皮細胞増殖を維持し得る増殖
培地、固定液、ブロッキング緩衝液、洗浄用緩衝液、好
適に可視化するための試薬および抗体を含む。
【００２７】好ましくは、可視化するための試薬は、フ
ォンビルブラント・イムノアッセイまたはPECAM-1イム
ノアッセイに使用されるものである。
ォンビルブラント・イムノアッセイまたはPECAM-1イム
ノアッセイに使用されるものである。
【００２８】本発明の更なる局面によると、多細胞イン
ビトロ・アッセイが提供され、該アッセイは、内皮細胞
および線維芽細胞、好ましくはヒト成人皮膚線維芽細胞
およびヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)の二重培養物を含
み、培養培地中で維持可能であり、該培養培地は内皮細
胞増殖を少なくとも維持し得、二重培養物はヒト成人皮
膚線維芽細胞のヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)に対する
約2:1〜8:1の細胞比率で播かれ、ここで、該アッセイは
特に、薬物研究または腫瘍治療などで使用されるインビ
ボ血管形成をモデル化するために使用され、こうして供
試薬物による血管形成モデルの阻害が、腫瘍治療で使用
されるその好適性を示すことになる。供試薬物による血
管形成モデルの強化は、創傷治療剤として使用されるそ
の好適性を示すことになる。
ビトロ・アッセイが提供され、該アッセイは、内皮細胞
および線維芽細胞、好ましくはヒト成人皮膚線維芽細胞
およびヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)の二重培養物を含
み、培養培地中で維持可能であり、該培養培地は内皮細
胞増殖を少なくとも維持し得、二重培養物はヒト成人皮
膚線維芽細胞のヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)に対する
約2:1〜8:1の細胞比率で播かれ、ここで、該アッセイは
特に、薬物研究または腫瘍治療などで使用されるインビ
ボ血管形成をモデル化するために使用され、こうして供
試薬物による血管形成モデルの阻害が、腫瘍治療で使用
されるその好適性を示すことになる。供試薬物による血
管形成モデルの強化は、創傷治療剤として使用されるそ
の好適性を示すことになる。
【００２９】本発明によれば、血管形成の各段階、つま
り細胞発生の増殖、移動および分化の各段階のための、
検査およびモデル化を可能にする多細胞インビトロ・ア
ッセイが提供される。
り細胞発生の増殖、移動および分化の各段階のための、
検査およびモデル化を可能にする多細胞インビトロ・ア
ッセイが提供される。
【００３０】本発明は、ここで、下記の図面および更に
以下の実施例を参照して説明される。
以下の実施例を参照して説明される。
【００３１】図2aおよび2bの培養物は14日間培養され、
従って、図1cと直接比較可能である。
従って、図1cと直接比較可能である。
【００３２】図１−３での可視化は、DAB基質を用いた
フォンビルブラント因子イムノアッセイ、およびヘマト
キシリン対比染色による。
フォンビルブラント因子イムノアッセイ、およびヘマト
キシリン対比染色による。
【００３３】本発明によれば、二重培養物を用い、更な
る増殖因子を要求せずに好適な細胞シグナリング・メカ
ニズムに依存する、血管形成のためのインビトロ・アッ
セイが提供される。血管形成の刺激および阻害の両方と
も、この技術を用いて実証できる。
る増殖因子を要求せずに好適な細胞シグナリング・メカ
ニズムに依存する、血管形成のためのインビトロ・アッ
セイが提供される。血管形成の刺激および阻害の両方と
も、この技術を用いて実証できる。
【００３４】さらに、本発明のアッセイ・システムは、
血管形成の３つの段階全て、即ち、増殖、移動および分
化を組合せるものである。
血管形成の３つの段階全て、即ち、増殖、移動および分
化を組合せるものである。
【００３５】該アッセイ・システムは、ヒト臍帯静脈内
皮細胞(HUVEC)をヒト成人皮膚線維芽細胞と共に共同培
養することを包含する。提供された条件下で、細胞は、
一連の網状の細管を形成する。
皮細胞(HUVEC)をヒト成人皮膚線維芽細胞と共に共同培
養することを包含する。提供された条件下で、細胞は、
一連の網状の細管を形成する。
【００３６】ヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)は、好適な
販路から市販されており、この場合、低温保存された形
態で購入される。細管アッセイで使用する前に、細胞
を、2%のウシ胎児血清を含む任意の好適な市販されてい
る内皮増殖培地EGM中で、ルーチンに継代し培養する。H
UVECは、アッセイ中で2〜6継代で使用される。
販路から市販されており、この場合、低温保存された形
態で購入される。細管アッセイで使用する前に、細胞
を、2%のウシ胎児血清を含む任意の好適な市販されてい
る内皮増殖培地EGM中で、ルーチンに継代し培養する。H
UVECは、アッセイ中で2〜6継代で使用される。
【００３７】ヒト成人皮膚線維芽細胞は、地方病院から
得られた皮膚サンプルから屋内で培養する。細管アッセ
イで使用する前に、細胞を、ダルベッコ変法イーグル培
地プラス10%ウシ胎児血清中で、ルーチンに継代し培養
する。線維芽細胞は、アッセイ中で6〜10継代で使用さ
れる。
得られた皮膚サンプルから屋内で培養する。細管アッセ
イで使用する前に、細胞を、ダルベッコ変法イーグル培
地プラス10%ウシ胎児血清中で、ルーチンに継代し培養
する。線維芽細胞は、アッセイ中で6〜10継代で使用さ
れる。
【００３８】アッセイで使用される組織培養物で処理し
た容器は、EGMプラスおよびマイナス処理により、30分
間37℃で5% CO2加湿雰囲気でプレインキュベーションす
ることによって平衡化される。12-ウェルおよび24-ウェ
ルの組織培養処理されたプレートが通常使用されるが、
他のものが同等に使用され得、添加される体積は12-ウ
ェルプレートについてはウェル当り1 mlおよび24-ウェ
ルプレートについてはウェル当り0.5 mlである。細胞
は、線維芽細胞については任意の好適な市販されている
トリプシン溶液、HUVECについては任意の好適な市販さ
れているトリプシン-EDTA溶液を用いて回収される。細
胞を、EGM中に再懸濁し、カウントする。使用する直前
に、細胞を注射器および針(23G×1・1/4)を通して絞り出
し、優れた散布を確認する。
た容器は、EGMプラスおよびマイナス処理により、30分
間37℃で5% CO2加湿雰囲気でプレインキュベーションす
ることによって平衡化される。12-ウェルおよび24-ウェ
ルの組織培養処理されたプレートが通常使用されるが、
他のものが同等に使用され得、添加される体積は12-ウ
ェルプレートについてはウェル当り1 mlおよび24-ウェ
ルプレートについてはウェル当り0.5 mlである。細胞
は、線維芽細胞については任意の好適な市販されている
トリプシン溶液、HUVECについては任意の好適な市販さ
れているトリプシン-EDTA溶液を用いて回収される。細
胞を、EGM中に再懸濁し、カウントする。使用する直前
に、細胞を注射器および針(23G×1・1/4)を通して絞り出
し、優れた散布を確認する。
【００３９】２タイプの細胞を、要求された密度および
播種率(それは、線維芽細胞対HUVECが2:1〜8:1であり得
る)で完全に混合し、プレートに加える。増殖表面にわ
たり均一な分布を確実にするために、プレートを穏やか
に無作為に撹拌する。これは、ウェルの中心で細胞がた
まるのを妨げる。
播種率(それは、線維芽細胞対HUVECが2:1〜8:1であり得
る)で完全に混合し、プレートに加える。増殖表面にわ
たり均一な分布を確実にするために、プレートを穏やか
に無作為に撹拌する。これは、ウェルの中心で細胞がた
まるのを妨げる。
【００４０】細胞比率および播種密度は、このアッセイ
において、とりわけ重要性がある。これらは、使用され
るそれぞれのHUVEC系と共に変化し得、新しい系が導入
されるときはいつも、細管形成の条件を最適にするよう
確立されなければならない。
において、とりわけ重要性がある。これらは、使用され
るそれぞれのHUVEC系と共に変化し得、新しい系が導入
されるときはいつも、細管形成の条件を最適にするよう
確立されなければならない。
【００４１】共同培養物は、通常は、完全な培地交換を
約２日毎に行なって、14日間にわたりインキュベーショ
ンされる。痕跡の細管の発生は、約４日目からである
が、全ての細胞タイプを有するときに変化が起こり得、
細管がより早期に形成し得る。全プロセスは、播種密度
を増加しながら確立された比率を維持することによっ
て、７日間以下に加速し得る。これは、しかしながら、
あらゆる処置の効果が短期間よりむしろ長期間にわたっ
てより良く見られ得るので、常に望ましいわけではな
い。
約２日毎に行なって、14日間にわたりインキュベーショ
ンされる。痕跡の細管の発生は、約４日目からである
が、全ての細胞タイプを有するときに変化が起こり得、
細管がより早期に形成し得る。全プロセスは、播種密度
を増加しながら確立された比率を維持することによっ
て、７日間以下に加速し得る。これは、しかしながら、
あらゆる処置の効果が短期間よりむしろ長期間にわたっ
てより良く見られ得るので、常に望ましいわけではな
い。
【００４２】アッセイの進行をモニターするために、14
日間の増殖期間において４つの時点を通常使用する。こ
れは、要件に適合するように変更し得る。それぞれの時
点で、培地は増殖容器から捨てられ、細胞を、冷却(-20
℃）70%エタノール中で30分間室温で固定する。この時
点で、プレートは、リン酸緩衝整理食塩水中で実験が完
了するまで４℃で洗浄および貯蔵され得、そのときには
全ての培養物は同時に発生し、それぞれの時点は別々に
対処され得る。
日間の増殖期間において４つの時点を通常使用する。こ
れは、要件に適合するように変更し得る。それぞれの時
点で、培地は増殖容器から捨てられ、細胞を、冷却(-20
℃）70%エタノール中で30分間室温で固定する。この時
点で、プレートは、リン酸緩衝整理食塩水中で実験が完
了するまで４℃で洗浄および貯蔵され得、そのときには
全ての培養物は同時に発生し、それぞれの時点は別々に
対処され得る。
【００４３】今日まで、細管の可視化は、イムノアッセ
イにより、HUVEC系中の２つの細胞マーカーの１つを標
的化することを包含する。これらのマーカーは、糖タン
パク質フォンビルブラント因子および細胞接着分子PECA
M-1である。
イにより、HUVEC系中の２つの細胞マーカーの１つを標
的化することを包含する。これらのマーカーは、糖タン
パク質フォンビルブラント因子および細胞接着分子PECA
M-1である。
【００４４】ヒトのフォンビルブラント因子(因子VIII
R:Ag)は、多量体の血漿糖タンパク質である。それは、
容器壁への血小板付着を仲介し、凝固因子VIIIに関する
担体および安定化剤として機能する。該因子は、内皮細
胞によって構成的に合成される。血小板内皮細胞接着分
子つまりPECAM-1は、Igスーパーファミリーのメンバー
であり、内皮細胞の表面とくに細胞間結合部で構成的に
見い出される130-KDの内在性膜糖タンパク質である。そ
れは、血小板および白血球の表面でも発現される。
R:Ag)は、多量体の血漿糖タンパク質である。それは、
容器壁への血小板付着を仲介し、凝固因子VIIIに関する
担体および安定化剤として機能する。該因子は、内皮細
胞によって構成的に合成される。血小板内皮細胞接着分
子つまりPECAM-1は、Igスーパーファミリーのメンバー
であり、内皮細胞の表面とくに細胞間結合部で構成的に
見い出される130-KDの内在性膜糖タンパク質である。そ
れは、血小板および白血球の表面でも発現される。
【００４５】イムノアッセイ・プロセスは、酵素複合体
化された二次抗体が、細胞マーカーに結合した非標識一
次抗体と反応する、２段階の間接的方法を包含する。基
質溶液が加えられ、これは酵素複合体と反応して、不溶
性の着色した最終産物を生じる。この様にして、内皮細
管は可視化される。共同培養物は、ヘマトキシリン核染
色で対比染色され得る。これは、線維芽細胞単層の可視
化を助ける。
化された二次抗体が、細胞マーカーに結合した非標識一
次抗体と反応する、２段階の間接的方法を包含する。基
質溶液が加えられ、これは酵素複合体と反応して、不溶
性の着色した最終産物を生じる。この様にして、内皮細
管は可視化される。共同培養物は、ヘマトキシリン核染
色で対比染色され得る。これは、線維芽細胞単層の可視
化を助ける。
【００４６】細管の定量的評価は、手動によるカウント
からビデオ画像化およびコンピューター化された画像分
析にわたる様々な方法によって達成され得る。
からビデオ画像化およびコンピューター化された画像分
析にわたる様々な方法によって達成され得る。
【００４７】HUVEC細胞および線維芽細胞が、任意の外
因性成長因子を含まないが培養培地の完全な入れ替えを
２日毎に行って共同培養物中で共にインキュベートされ
るとき、細胞は、増殖段階を初めに通過し、それはコン
フルエントな単層が生じるまで継続する。１日目に、培
養物は、内皮細胞の小さな島と共に線維芽細胞のバック
グラウンドからなる(図1a)。内皮細胞は、増殖を続けな
がら移動相に入り、そこでそれらは線維芽細胞層内で移
動して、約７日目に糸様細管構造物を形成するのを見る
ことができる(図1b)。これらの構造物は、実質的に伸張
し集合して、約14日目にヒヨコ漿尿膜の毛細血管床に似
た網状のネットワークを形成する(図1c)。このプロセス
で形成された「血管」は、増殖相の間に形成されたHUVE
Cの島を起源とするのを、しばしば見ることができる。
高濃度の線維芽細胞は、そこからHUVECが移動してきた
領域で殆ど常に見られる。14日目までに、細管は、開存
管腔を有して、より広くより厚くなり、それらは位相差
顕微鏡で可視化され得る。
因性成長因子を含まないが培養培地の完全な入れ替えを
２日毎に行って共同培養物中で共にインキュベートされ
るとき、細胞は、増殖段階を初めに通過し、それはコン
フルエントな単層が生じるまで継続する。１日目に、培
養物は、内皮細胞の小さな島と共に線維芽細胞のバック
グラウンドからなる(図1a)。内皮細胞は、増殖を続けな
がら移動相に入り、そこでそれらは線維芽細胞層内で移
動して、約７日目に糸様細管構造物を形成するのを見る
ことができる(図1b)。これらの構造物は、実質的に伸張
し集合して、約14日目にヒヨコ漿尿膜の毛細血管床に似
た網状のネットワークを形成する(図1c)。このプロセス
で形成された「血管」は、増殖相の間に形成されたHUVE
Cの島を起源とするのを、しばしば見ることができる。
高濃度の線維芽細胞は、そこからHUVECが移動してきた
領域で殆ど常に見られる。14日目までに、細管は、開存
管腔を有して、より広くより厚くなり、それらは位相差
顕微鏡で可視化され得る。
【００４８】２つの細胞タイプの播種密度およびHUVEC
の線維芽細胞に対する比率は、共に極めて重要である。
HUVECが分裂する速度も、重要であるように見える。大
きく変動する倍加時間を有するHUVECを用いることによ
って、倍加時間が短く、従ってHUVECが非常に迅速に増
殖するとき、結果は、未分化HUVECの大きな島となる傾
向があることが見られ得る。これは、そのプロセスの間
に、線維芽細胞とHUVECとの間の細胞内シグナルが分化
プロセスを開始する臨界点があることを示す結果となる
であろう。
の線維芽細胞に対する比率は、共に極めて重要である。
HUVECが分裂する速度も、重要であるように見える。大
きく変動する倍加時間を有するHUVECを用いることによ
って、倍加時間が短く、従ってHUVECが非常に迅速に増
殖するとき、結果は、未分化HUVECの大きな島となる傾
向があることが見られ得る。これは、そのプロセスの間
に、線維芽細胞とHUVECとの間の細胞内シグナルが分化
プロセスを開始する臨界点があることを示す結果となる
であろう。
【００４９】実験は、例えば、新しい薬剤の効果をテス
トする試験下にあるサンプルによる、血管形成の阻害ま
たは刺激を明示するためのアッセイを使用する可能性を
示すためにも行われた。
トする試験下にあるサンプルによる、血管形成の阻害ま
たは刺激を明示するためのアッセイを使用する可能性を
示すためにも行われた。
【００５０】血管内皮増殖因子(VEGF)は、内皮細胞の認
められた分裂促進因子であり、血管形成を刺激する。イ
ンビトロ・システムの操作は、実験の最初およびそれぞ
れの培地交換の際に、ヒト組換えVEGFを添加することに
より確認した。結果として、細管形成は、多くのアーケ
ードのネットワークとともに非常に増強された(図2a)。
められた分裂促進因子であり、血管形成を刺激する。イ
ンビトロ・システムの操作は、実験の最初およびそれぞ
れの培地交換の際に、ヒト組換えVEGFを添加することに
より確認した。結果として、細管形成は、多くのアーケ
ードのネットワークとともに非常に増強された(図2a)。
【００５１】逆に、抗ヒト組換えVEGF中和抗体をVEGFと
ともに添加したとき、細管形成は顕著に低下した(図2
b)。該システムは、地方病院から入手されたU-87-NG(ヒ
ト神経膠芽細胞腫細胞系)およびヨーロピアン・コレク
ション・オブ・アニマル・セル・カルチャーズ(ECACC)
から入手されるGO-G-CCM(ヒト脳神経膠星状細胞腫)から
のものを含む様々な腫瘍細胞系からの馴化培地(血清を
含まない)を用いてもテストされた、というのも、腫瘍
細胞は血管形成をコントロールし得、続いて、増殖を援
助し得ることが仮定されているからである。U-87-NG
は、非常に小さな細管形成を伴うHUVECの塊状増殖を生
じたが(図3a)、GO-G-CCMはHUVEC増殖および細管形成を
大きく低下した(図3b)。
ともに添加したとき、細管形成は顕著に低下した(図2
b)。該システムは、地方病院から入手されたU-87-NG(ヒ
ト神経膠芽細胞腫細胞系)およびヨーロピアン・コレク
ション・オブ・アニマル・セル・カルチャーズ(ECACC)
から入手されるGO-G-CCM(ヒト脳神経膠星状細胞腫)から
のものを含む様々な腫瘍細胞系からの馴化培地(血清を
含まない)を用いてもテストされた、というのも、腫瘍
細胞は血管形成をコントロールし得、続いて、増殖を援
助し得ることが仮定されているからである。U-87-NG
は、非常に小さな細管形成を伴うHUVECの塊状増殖を生
じたが(図3a)、GO-G-CCMはHUVEC増殖および細管形成を
大きく低下した(図3b)。
【００５２】これらの結果は、アッセイの柔軟性、およ
び異なるモードの作用を有する材料への応答性を実証す
る。
び異なるモードの作用を有する材料への応答性を実証す
る。
【００５３】この様にして、アッセイは、血管形成の阻
害剤および増強剤をスクリーニングするために使用され
得る。
害剤および増強剤をスクリーニングするために使用され
得る。
【００５４】図５には、14日目での細管におけるコラー
ゲンIV発現の画像を示している。インビボでは、細胞外
マトリックス(ECM)タンパク質が、新脈管構造の毛細管
を発生させることによって貯蔵され、このインビトロ画
像は、コラーゲンIVが内皮細胞によって選択的に発現さ
れることを示す。このことは、該アッセイが、実際に、
血管のインビボ発生を模倣していることの更なる証拠で
ある。
ゲンIV発現の画像を示している。インビボでは、細胞外
マトリックス(ECM)タンパク質が、新脈管構造の毛細管
を発生させることによって貯蔵され、このインビトロ画
像は、コラーゲンIVが内皮細胞によって選択的に発現さ
れることを示す。このことは、該アッセイが、実際に、
血管のインビボ発生を模倣していることの更なる証拠で
ある。
【００５５】図６は、電子顕微鏡(初期倍率×7,500)を
通して見られる、細管アッセイ(14日目)における細胞層
の垂直クロスセクションの写真像を示す。これは、中心
管腔(矢印で示される)を包む幾つかの内皮細胞(矢頭で
示される)からなる細管を非常に明確に示す。これは、
アッセイが、中心「腔(cavity)」つまり管腔(lumen)を
有する細管を実際に作製している更なる証拠を示すもの
である。
通して見られる、細管アッセイ(14日目)における細胞層
の垂直クロスセクションの写真像を示す。これは、中心
管腔(矢印で示される)を包む幾つかの内皮細胞(矢頭で
示される)からなる細管を非常に明確に示す。これは、
アッセイが、中心「腔(cavity)」つまり管腔(lumen)を
有する細管を実際に作製している更なる証拠を示すもの
である。
【００５６】全ての細胞が、本発明のアッセイで現在使
用されるものに置き換えられる場合に機能する訳ではな
いということを示すために、コントロール研究もセット
アップされた。コントロール研究は、ヒト臍帯動脈平滑
筋細胞(HUASMC)、つまりインビボで内皮細胞と密接な関
連を形成する細胞とHUVECとの共同培養を示した。細管
は、形成されなかった。
用されるものに置き換えられる場合に機能する訳ではな
いということを示すために、コントロール研究もセット
アップされた。コントロール研究は、ヒト臍帯動脈平滑
筋細胞(HUASMC)、つまりインビボで内皮細胞と密接な関
連を形成する細胞とHUVECとの共同培養を示した。細管
は、形成されなかった。
【００５７】上記の発明は、実験のためのインビトロ・
モデルを用いて、インビボ血管形成のより正確な研究を
提供し、実験はそれに対する様々な外部因子の効果を見
るものと認識される。例えば、特定の薬剤(特に、腫瘍
治療の分野における)の効果の研究が、本発明によって
多大に援助される。該アッセイは、試験中の特定の薬剤
が血管形成を阻害して、それにより腫瘍増殖を阻害する
かどうか、或いは、それが血管形成を増強して、それに
より創傷治癒治療に適用性を有するかどうかを決定する
のに使用され得る。インビボでは、傷害を受けた組織お
よび幾つかの腫瘍は、近隣の内皮細胞を刺激して新しい
毛細血管新芽を構築する因子を分泌することにより、血
液供給を引き寄せる。従って、このアッセイを使うこと
により、特定の供試薬剤が内皮細胞の刺激を妨げて、そ
れにより腫瘍に血液供給を引き寄せるのを妨げ得るかど
うかが、示され得る。血液供給を引き寄せ得ない腫瘍
は、それらの成長を著しく制限される。本発明は、血管
形成それ自身の研究において、極めて有益なものでもあ
る。
モデルを用いて、インビボ血管形成のより正確な研究を
提供し、実験はそれに対する様々な外部因子の効果を見
るものと認識される。例えば、特定の薬剤(特に、腫瘍
治療の分野における)の効果の研究が、本発明によって
多大に援助される。該アッセイは、試験中の特定の薬剤
が血管形成を阻害して、それにより腫瘍増殖を阻害する
かどうか、或いは、それが血管形成を増強して、それに
より創傷治癒治療に適用性を有するかどうかを決定する
のに使用され得る。インビボでは、傷害を受けた組織お
よび幾つかの腫瘍は、近隣の内皮細胞を刺激して新しい
毛細血管新芽を構築する因子を分泌することにより、血
液供給を引き寄せる。従って、このアッセイを使うこと
により、特定の供試薬剤が内皮細胞の刺激を妨げて、そ
れにより腫瘍に血液供給を引き寄せるのを妨げ得るかど
うかが、示され得る。血液供給を引き寄せ得ない腫瘍
は、それらの成長を著しく制限される。本発明は、血管
形成それ自身の研究において、極めて有益なものでもあ
る。
【００５８】培養容器は、線維芽細胞対HUVECの好まし
い細胞比率が約2:1〜8:1で増殖する、生存可能な共同培
養物とともに播かれるとも考えられる。約24時間の共同
培養後、次に、バイアルは、キットの形態で好適にパッ
ケージ化されるであろう。キットは、共同培養物を生存
可能に維持するために、および(フォンビルブラント・
イムノアッセイまたはPECAM-1イムノアッセイにより)結
果を可視化するためにも要求される必要成分も含む。
い細胞比率が約2:1〜8:1で増殖する、生存可能な共同培
養物とともに播かれるとも考えられる。約24時間の共同
培養後、次に、バイアルは、キットの形態で好適にパッ
ケージ化されるであろう。キットは、共同培養物を生存
可能に維持するために、および(フォンビルブラント・
イムノアッセイまたはPECAM-1イムノアッセイにより)結
果を可視化するためにも要求される必要成分も含む。
【００５９】多細胞インビトロ・アッセイで使用される
ための好ましいテスト・キットは、約2:1〜8:1の細胞比
率のヒト成人皮膚線維芽細胞およびヒト臍帯静脈内皮細
胞(HUVEC)の二重培養物とともに播かれた培養容器、内
皮細胞増殖を維持可能にする量の増殖培地、固定液、ブ
ロッキング緩衝液、洗浄用緩衝液、並びにフォンビルブ
ラント・イムノアッセイまたはPECAM-1イムノアッセイ
による好適な可視化のための試薬および抗体を有する。
ための好ましいテスト・キットは、約2:1〜8:1の細胞比
率のヒト成人皮膚線維芽細胞およびヒト臍帯静脈内皮細
胞(HUVEC)の二重培養物とともに播かれた培養容器、内
皮細胞増殖を維持可能にする量の増殖培地、固定液、ブ
ロッキング緩衝液、洗浄用緩衝液、並びにフォンビルブ
ラント・イムノアッセイまたはPECAM-1イムノアッセイ
による好適な可視化のための試薬および抗体を有する。
【００６０】従って、キットは、フォンビルブラント・
イムノアッセイで使用されるために、下記の成分： (i)一次抗体 − ウサギ抗ヒトフォンビルブラント因子； (ii)二次抗体 − ヤギ抗ウサギIgG(全分子)西洋ワサビペルオキシダーゼ複合 体；および (iii)基質 − 不溶性末端産物を有する西洋ワサビペルオキシダーゼ基質 およびPECAM-1イムノアッセイで使用されるために、下記成分： (i)一次抗体 − マウス抗ヒトPECAM-1； (ii)二次抗体 − ヤギ抗ウサギIgG(全分子)アルカリ性ホスファターゼ複合体 ；および (iii)基質 − 不溶性末端産物を有するアルカリ性ホスファターゼ基質、 も含む。
イムノアッセイで使用されるために、下記の成分： (i)一次抗体 − ウサギ抗ヒトフォンビルブラント因子； (ii)二次抗体 − ヤギ抗ウサギIgG(全分子)西洋ワサビペルオキシダーゼ複合 体；および (iii)基質 − 不溶性末端産物を有する西洋ワサビペルオキシダーゼ基質 およびPECAM-1イムノアッセイで使用されるために、下記成分： (i)一次抗体 − マウス抗ヒトPECAM-1； (ii)二次抗体 − ヤギ抗ウサギIgG(全分子)アルカリ性ホスファターゼ複合体 ；および (iii)基質 − 不溶性末端産物を有するアルカリ性ホスファターゼ基質、 も含む。
【００６１】完成されたキットは、続いて、血管形成研
究、薬剤研究グループおよび／または創傷修復研究のよ
うな、それら自身の研究に使用されるために取引先に搬
出される。 ［図面の簡単な説明］
究、薬剤研究グループおよび／または創傷修復研究のよ
うな、それら自身の研究に使用されるために取引先に搬
出される。 ［図面の簡単な説明］
【図１】図1a-c：１、７および14日間をかけた細管の発
生を示す。 図1a：１日目。暗く染色されたHUVEC(茶色)がはっきり
と見られ、線維芽細胞(青色)単層の表面上に位置してい
る(×85)。 図1b：７日目。糸様細管が、コンフルエントな線維芽細
胞単層中に形成している(×34)。 図1c：14日目。厚みを増した解剖学的構造の血管の込み
入ったネットワークが形成され、多くは、高い線維芽細
胞濃度を有する領域から生じている(×34)。
生を示す。 図1a：１日目。暗く染色されたHUVEC(茶色)がはっきり
と見られ、線維芽細胞(青色)単層の表面上に位置してい
る(×85)。 図1b：７日目。糸様細管が、コンフルエントな線維芽細
胞単層中に形成している(×34)。 図1c：14日目。厚みを増した解剖学的構造の血管の込み
入ったネットワークが形成され、多くは、高い線維芽細
胞濃度を有する領域から生じている(×34)。
【図２】図2a：ヒト組換え血管内皮成長因子(VEGF)、10
ngml-1の添加による、細管形成の顕著な増加(×34)。 図2b：ヒト組換えVEGF、10ngml-1と組合せた抗ヒト組換
えVEGF中和抗体、10μgm-1添加による、細管形成の顕著
な増加(×34)。
ngml-1の添加による、細管形成の顕著な増加(×34)。 図2b：ヒト組換えVEGF、10ngml-1と組合せた抗ヒト組換
えVEGF中和抗体、10μgm-1添加による、細管形成の顕著
な増加(×34)。
【図３】図3a：U-87-MG馴化培地とともにインキュベー
ションすると、細管形成の阻害だけでなくHUVEC数の塊
状増加もまたもたらされる。幾つかの細管は、大きいHU
VEC“島"の縁で形成することに注目のこと(×34)。 図3b：GO-G-CCM馴化培地とともにインキュベーションす
ると、HUVEC増殖の顕著な減少を生じる。しかしなが
ら、存在するそれらの細胞は、小さい長さの細管を形成
した(×34)。
ションすると、細管形成の阻害だけでなくHUVEC数の塊
状増加もまたもたらされる。幾つかの細管は、大きいHU
VEC“島"の縁で形成することに注目のこと(×34)。 図3b：GO-G-CCM馴化培地とともにインキュベーションす
ると、HUVEC増殖の顕著な減少を生じる。しかしなが
ら、存在するそれらの細胞は、小さい長さの細管を形成
した(×34)。
【図４】図４：BCIP/NBT基質(アルカリ性ホスファター
ゼ適合性)を用い、PECAM-1イムノアッセイによって発色
された、14日目の細管形成の画像を示す(×34)。
ゼ適合性)を用い、PECAM-1イムノアッセイによって発色
された、14日目の細管形成の画像を示す(×34)。
【図５】図５：14日目の細管におけるコラーゲンIV発現
の画像を示す(×85)。
の画像を示す(×85)。
【図６】図６：電子顕微鏡で見られる14日目の細管アッ
セイにおける細胞層の垂直クロスセクションの写真画像
(初期倍率×7,500)。
セイにおける細胞層の垂直クロスセクションの写真画像
(初期倍率×7,500)。
フロントページの続き
(72)発明者 ブロアー ステファン
イギリス国 ピーアール６ ７キューエ
ル ランカシャー コーリィ ウィット
ル レ ウッズ ハーヴェスト ドライ
ブ 40
(56)参考文献 特表 平４−501657（ＪＰ，Ａ)
特表 昭58−500695（ＪＰ，Ａ)
(58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名)
G01N 33/15
C12N 5/06
G01N 33/50
Claims (17)
- 【請求項１】 血管形成の組合せ段階、つまり細胞発生
の増殖、移動および分化の段階をモデル化するための多
細胞インビトロ・アッセイであって、ここで、該アッセ
イは、内皮細胞およびそれとの相互作用を発揮する線維
芽細胞との二重培養物を提供することを包含し、該細胞
は線維芽細胞の内皮細胞に対する比率が約2:1〜8:1であ
る二重培養物中で提供され、それにより該線維芽細胞は
単層を形成し、単層上で内皮細胞は血管形成の組合せ段
階を発揮し、それぞれの血管形成の段階が予め決められ
た時間にわたりモニターされ得る、多細胞インビトロ・
アッセイ。 - 【請求項２】 二重培養物が、更なる増殖因子も外因性
マトリックスタンパク質も含まない標準培養培地ならび
に内皮細胞および相互作用し得る線維芽細胞の混合物を
含む、請求項１に記載の血管形成の組合せ段階をモデル
化するための多細胞インビトロ・アッセイ。 - 【請求項３】 前記請求項のいずれか１つに記載の血管
形成の組合せ段階をモデル化するための、特に血管形成
を増進または阻害する薬剤をスクリーニングするための
多細胞インビトロ・アッセイであって、その中に二重培
養物を有する複数のテスト容器を提供すること、該培養
物に選択的にコントロールされた量のそのような薬剤を
提供すること、および容器を観察して血管形成の効果を
モニターすることを包含する、多細胞インビトロ・アッ
セイ。 - 【請求項４】 スクリーニング方法が自動化され、血管
形成が公知の自動化されたカウント技術によって観察さ
れる、請求項３に記載の血管形成の組合せ段階をモデル
化するための多細胞インビトロ・アッセイ。 - 【請求項５】 血管形成が画像分析によってモニターさ
れる、請求項３に記載の血管形成の組合せ段階をモデル
化するための多細胞インビトロ・アッセイ。 - 【請求項６】 血管形成がスペクトログラフ法によって
モニターされる、請求項３に記載の血管形成の組合せ段
階をモデル化するための多細胞インビトロ・アッセイ。 - 【請求項７】 線維芽細胞がヒト成人皮膚線維芽細胞で
あり、内皮細胞がヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)であ
る、前記請求項のいずれか１つに記載の血管形成の組合
せ段階をモデル化するための多細胞インビトロ・アッセ
イ。 - 【請求項８】 前記請求項のいずれか１つに記載の血管
形成の組合せ段階をモデル化するための多細胞インビト
ロ・アッセイであって、該方法は、 (a)二重細胞培養物を維持するのに好適であり、その中
で少なくとも内皮細胞の増殖を維持するのに好適な培養
培地を有する増殖容器をセットアップする工程、 (b)ヒト線維芽細胞およびヒト内皮細胞の二重培養物を
播いてその2:1〜8:1の標的比率を得る工程、 (c)いかなる外因性成長因子または外因性マトリックス
タンパク質も提供せずに、それをインキュベートする工
程、 (d)ヒト線維芽細胞のコンフルエントな単層が得られる
まで初期増殖相からの細胞の経過をモニターし、このと
き内皮細胞は血管形成の増殖、移動および分化段階を発
揮する、工程、 (e)血管形成の組合せ段階を通して一定時間ごとに培養
培地を交換する工程、 (f)血管形成の組合せ段階または予め決められた時間に
わたりそれに対するスクリーニング薬剤の効果をモニタ
ーする工程、 を包含する、多細胞インビトロ・アッセイ。 - 【請求項９】 線維芽細胞がヒト成人皮膚線維芽細胞で
あり、内皮細胞がヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)であ
る、請求項８に記載の血管形成の組合せ段階をモデル化
するための多細胞インビトロ・アッセイ。 - 【請求項１０】 二重培養物の培養培地が48時間ごとに
交換される、請求項８または９に記載の血管形成の組合
せ段階をモデル化するための多細胞インビトロ・アッセ
イ。 - 【請求項１１】 血管形成プロセスの研究および薬剤の
適用の可能性を治療的に評価するのに使用するための、
請求項１〜１０のいずれか１つに記載のインビボ血管形
成をモデル化するために好適な多細胞インビトロ・アッ
セイであって、培養培地中の約2:1〜8:1の比率の線維芽
細胞および内皮細胞の二重培養物を提供すること、該二
重培養物はアッセイを完了するのに充分な時間該培養培
地中で生存および維持可能である、評価されるべき薬剤
を二重培養物に導入すること、および細胞挙動に対する
特に血管形成に対するその効果を観察することを包含
し、それによって、該薬剤による血管形成の阻害または
増強が血管形成が依存する疾患およびプロセスの操作に
使用される可能性を示す、多細胞インビトロ・アッセ
イ。 - 【請求項１２】 線維芽細胞がヒト成人皮膚線維芽細胞
であり、内皮細胞がヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)であ
る、請求項１１に記載の薬剤の適用の可能性の治療的評
価に使用する、インビボ血管形成をモデル化するために
好適な多細胞インビトロ・アッセイ。 - 【請求項１３】 血管形成の組合せ段階をモデル化する
ための多細胞インビトロ・アッセイに使用するためのキ
ットであって、ここで、該キットは、ヒト成人皮膚線維
芽細胞およびヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)を維持しそ
の相互作用を可能にするのに好適な培養培地を提供さ
れ、二重培養物として約2:1〜8:1の予め決められた比率
で該細胞を播かれた容器を含み、ここで線維芽細胞の内
皮細胞に対する比率はより大きく、その結果、キットは
活性化されるとヒト成人皮膚線維芽細胞が単層を形成さ
せるよう誘導し、単層上でヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVE
C)は血管形成の組合せ段階を発揮する、キット。 - 【請求項１４】 キットが、二重培養物を播かれた培養
容器を含み、該キットはさらに、内皮細胞増殖を維持し
得る増殖培地、固定液、ブロッキング緩衝液、洗浄用緩
衝液、可視化するための試薬および抗体を含む、請求項
１３に記載のキット。 - 【請求項１５】 好適なマーカーの標的が可視化するた
めに使用される、請求項１４に記載のキット。 - 【請求項１６】 可視化するための試薬がフォンビルブ
ラント・イムノアッセイで使用されるものである、請求
項１４に記載のキット。 - 【請求項１７】 可視化するための試薬がPECAM-1イム
ノアッセイで使用されるものである、請求項１４に記載
のキット。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GBGB9720987.8A GB9720987D0 (en) | 1997-10-01 | 1997-10-01 | A multicellular in vitro assay of angiogenesis |
| GB9720987.8 | 1997-10-01 | ||
| PCT/GB1998/002908 WO1999017116A1 (en) | 1997-10-01 | 1998-09-25 | A multicellular in vitro assay of angiogenesis |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2001518621A JP2001518621A (ja) | 2001-10-16 |
| JP3404572B2 true JP3404572B2 (ja) | 2003-05-12 |
Family
ID=10819980
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2000514134A Expired - Fee Related JP3404572B2 (ja) | 1997-10-01 | 1998-09-25 | 血管形成の多細胞インビトロ・アッセイ |
Country Status (15)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP1023599B1 (ja) |
| JP (1) | JP3404572B2 (ja) |
| AT (1) | ATE218209T1 (ja) |
| AU (1) | AU732538B2 (ja) |
| CA (1) | CA2301171C (ja) |
| DE (1) | DE69805644T2 (ja) |
| DK (1) | DK1023599T3 (ja) |
| ES (1) | ES2174486T3 (ja) |
| GB (1) | GB9720987D0 (ja) |
| IL (1) | IL135386A0 (ja) |
| MY (1) | MY119061A (ja) |
| NO (1) | NO20001608L (ja) |
| NZ (1) | NZ502962A (ja) |
| WO (1) | WO1999017116A1 (ja) |
| ZA (1) | ZA988936B (ja) |
Families Citing this family (14)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6743576B1 (en) | 1999-05-14 | 2004-06-01 | Cytokinetics, Inc. | Database system for predictive cellular bioinformatics |
| US7151847B2 (en) | 2001-02-20 | 2006-12-19 | Cytokinetics, Inc. | Image analysis of the golgi complex |
| US6651008B1 (en) | 1999-05-14 | 2003-11-18 | Cytokinetics, Inc. | Database system including computer code for predictive cellular bioinformatics |
| US6436629B1 (en) * | 2000-10-27 | 2002-08-20 | The Regents Of The University Of California | Modulating angiogenesis |
| US7218764B2 (en) | 2000-12-04 | 2007-05-15 | Cytokinetics, Inc. | Ploidy classification method |
| US6599694B2 (en) | 2000-12-18 | 2003-07-29 | Cytokinetics, Inc. | Method of characterizing potential therapeutics by determining cell-cell interactions |
| US6956961B2 (en) | 2001-02-20 | 2005-10-18 | Cytokinetics, Inc. | Extracting shape information contained in cell images |
| US7016787B2 (en) | 2001-02-20 | 2006-03-21 | Cytokinetics, Inc. | Characterizing biological stimuli by response curves |
| ES2185493B1 (es) * | 2001-07-03 | 2004-06-16 | Madrid Genetics, S.L. | Metodo para evaluar in vitro en condiciones fisiologicas o patologicas relevantes la actividad biologica de compuestos a gran escala. |
| EP1646926A2 (en) | 2003-07-18 | 2006-04-19 | Cytokinetics, Inc. | Characterizing biological stimuli by response curves |
| US20050014217A1 (en) | 2003-07-18 | 2005-01-20 | Cytokinetics, Inc. | Predicting hepatotoxicity using cell based assays |
| US7235353B2 (en) | 2003-07-18 | 2007-06-26 | Cytokinetics, Inc. | Predicting hepatotoxicity using cell based assays |
| US7323318B2 (en) | 2004-07-15 | 2008-01-29 | Cytokinetics, Inc. | Assay for distinguishing live and dead cells |
| US8679836B2 (en) | 2007-10-01 | 2014-03-25 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Methods of monitoring angiogenesis and metastasis in three dimensional co-cultures |
Family Cites Families (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4539716A (en) * | 1981-03-19 | 1985-09-10 | Massachusetts Institute Of Technology | Fabrication of living blood vessels and glandular tissues |
| US4546500A (en) * | 1981-05-08 | 1985-10-15 | Massachusetts Institute Of Technology | Fabrication of living blood vessels and glandular tissues |
| US5863531A (en) * | 1986-04-18 | 1999-01-26 | Advanced Tissue Sciences, Inc. | In vitro preparation of tubular tissue structures by stromal cell culture on a three-dimensional framework |
| US5160490A (en) * | 1986-04-18 | 1992-11-03 | Marrow-Tech Incorporated | Three-dimensional cell and tissue culture apparatus |
| US5032508A (en) * | 1988-09-08 | 1991-07-16 | Marrow-Tech, Inc. | Three-dimensional cell and tissue culture system |
| US5804178A (en) * | 1986-11-20 | 1998-09-08 | Massachusetts Institute Of Technology | Implantation of cell-matrix structure adjacent mesentery, omentum or peritoneum tissue |
| US5830708A (en) * | 1995-06-06 | 1998-11-03 | Advanced Tissue Sciences, Inc. | Methods for production of a naturally secreted extracellular matrix |
-
1997
- 1997-10-01 GB GBGB9720987.8A patent/GB9720987D0/en not_active Ceased
-
1998
- 1998-09-25 DE DE69805644T patent/DE69805644T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1998-09-25 JP JP2000514134A patent/JP3404572B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1998-09-25 NZ NZ502962A patent/NZ502962A/en unknown
- 1998-09-25 CA CA002301171A patent/CA2301171C/en not_active Expired - Fee Related
- 1998-09-25 AU AU91785/98A patent/AU732538B2/en not_active Ceased
- 1998-09-25 AT AT98944120T patent/ATE218209T1/de not_active IP Right Cessation
- 1998-09-25 WO PCT/GB1998/002908 patent/WO1999017116A1/en active IP Right Grant
- 1998-09-25 IL IL13538698A patent/IL135386A0/xx unknown
- 1998-09-25 EP EP98944120A patent/EP1023599B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1998-09-25 ES ES98944120T patent/ES2174486T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1998-09-25 DK DK98944120T patent/DK1023599T3/da active
- 1998-09-30 MY MYPI98004483A patent/MY119061A/en unknown
- 1998-09-30 ZA ZA988936A patent/ZA988936B/xx unknown
-
2000
- 2000-03-28 NO NO20001608A patent/NO20001608L/no not_active Application Discontinuation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP1023599B1 (en) | 2002-05-29 |
| GB9720987D0 (en) | 1997-12-03 |
| EP1023599A1 (en) | 2000-08-02 |
| NO20001608D0 (no) | 2000-03-28 |
| WO1999017116A1 (en) | 1999-04-08 |
| CA2301171A1 (en) | 1999-04-08 |
| ZA988936B (en) | 1999-03-31 |
| AU9178598A (en) | 1999-04-23 |
| MY119061A (en) | 2005-03-31 |
| CA2301171C (en) | 2002-11-12 |
| DE69805644T2 (de) | 2002-09-12 |
| ES2174486T3 (es) | 2002-11-01 |
| AU732538B2 (en) | 2001-04-26 |
| IL135386A0 (en) | 2001-05-20 |
| NZ502962A (en) | 2001-01-26 |
| NO20001608L (no) | 2000-03-28 |
| DK1023599T3 (da) | 2002-07-08 |
| ATE218209T1 (de) | 2002-06-15 |
| DE69805644D1 (de) | 2002-07-04 |
| JP2001518621A (ja) | 2001-10-16 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US6475790B2 (en) | Assay for screening agents that alter angiogenesis | |
| Norrby | In vivo models of angiogenesis | |
| Montesano et al. | Tumor-promoting phorbol esters induce angiogenesis in vitro | |
| JP3404572B2 (ja) | 血管形成の多細胞インビトロ・アッセイ | |
| Folkman et al. | Long-term culture of capillary endothelial cells. | |
| Verbeek et al. | Induction of alpha-smooth muscle actin expression in cultured human brain pericytes by transforming growth factor-beta 1. | |
| Chen et al. | In vitro angiogenesis by human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) induced by three-dimensional co-culture with glioblastoma cells | |
| CN101268183B (zh) | 改变对外源和内源免疫原（包括同系和非同系细胞、组织或器官）的免疫应答的材料和方法 | |
| Keegan et al. | Purified tumour angiogenesis factor enhances proliferation of capillary, but not aortic, endothelial cells in vitro | |
| EP4123014A1 (en) | Cardiac organoid, manufacturing method therefor, and method for evaluating drug toxicity by using same | |
| CN102046188A (zh) | 在皮肤伤口愈合中使用干细胞的组合物和方法 | |
| Sato et al. | Development of capillary networks from rat microvascular fragments in vitro: the role of myofibroblastic cells | |
| KR20190112186A (ko) | 모낭 줄기 세포의 3d 오가노이드 시스템을 이용하여 모발을 재생시키기 위한 방법 및 시스템 | |
| CN102300984A (zh) | 用于制备血小板的方法 | |
| LUO et al. | Interleukin 1-induced calcium signalling in chondrocytes requires focal adhesions | |
| JPWO2005028638A1 (ja) | 細胞シートを作製するための支持体をコーティングするための組成物、細胞シート作製用支持体及び細胞シートの製造方法 | |
| US20040029270A1 (en) | Vitro human angiogenesis model | |
| Wang et al. | Vascular regeneration in adult mouse cochlea stimulated by VEGF-A165 and driven by NG2-derived cells ex vivo | |
| Iwig et al. | Cell shape-mediated growth control of lens epithelial cells grown in culture | |
| Schor et al. | The synthesis of subendothelial matrix by bovine aortic endothelial cells in culture | |
| Sondergaard et al. | Human thymus mesenchymal stromal cells augment force production in self-organized cardiac tissue | |
| Natale et al. | Discovery and development of tumor angiogenesis assays | |
| Levine et al. | Megakaryocyte interaction with subendothelial extracellular matrix is associated with adhesion, platelet-like shape change, and thromboxane A2 production | |
| Kanazawa et al. | Transformed growth phenotype of mouse mammary epithelium in primary culture induced by specific fetal mesenchymes | |
| Malik et al. | Organ, Histotypic and Organotypic Culture, and Tissue Engineering |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20080307 Year of fee payment: 5 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20090307 Year of fee payment: 6 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20100307 Year of fee payment: 7 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20100307 Year of fee payment: 7 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110307 Year of fee payment: 8 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110307 Year of fee payment: 8 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130307 Year of fee payment: 10 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20140307 Year of fee payment: 11 |
|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |