KR102590429B1 - 태반-유래 기질 및 이의 제조 방법 및 용도 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 태반-유래 기질, 이의 제조 방법 및 이의 사용 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한, 세포를 배양하고, 세포를 전달하고, 줄기 세포 또는 조직-특이적 전구 세포의 분화를 촉진하고, 태반-유래 기질을 사용하여 결함부의 흉터를 수복시키거나, 대체하거나, 재생시키거나, 충전시키거나, 감소시키거나 억제하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한, 표면 상을 태반-유래 기질로 코팅하거나 관심 부위로 태반-유래 기질을 주입하는 방법에 관한 것이다.
Description
관련 출원의 상호 참조
본 출원은 2015년 5월 29일 출원된 미국 가출원 번호 62/168,397의 이익을 청구하며, 이의 내용은 모든 목적에 있어서 그 전체가 참조로 본원에 통합된다.
발명의 분야
본 발명은 일반적으로 태반으로부터 유래된 기질 및 이의 제조 방법 및 용도에 관한 것이다.
세포외 기질(ECM)은 배양시 많은 세포 유형을 성장시키는데 필수적이며, 동물 질병 모델(예를 들어, 심허혈)에서 주입된 치료 후보물질을 보여준다. ECM은 동물 조직으로부터 다양한 방법에 의해 제조될 수 있다. 그러나, 이종발생성 ECM은 면역 반응을 유도하거나 이질균을 전염시켜 임상 유용성을 제한할 수 있다. 예를 들어, 치료 목적 및 생물학적 연구와 같은 임상 적용에 적합한 ECM의 요구가 여전히 존재한다.
본 발명은 태반 유래 기질 및 태반 유래 기질을 제조하거나 사용하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 제1 양태에 따르면, 태반-유래 기질을 제조하는 방법이 제공된다. 상기 방법은 (a) 적어도 태반 조직 조각을 탈세포화 또는 탈활력화시켜 탈세포화되거나 탈활력화된 태반 조직을 생성하는 단계, 및 (b) 분해 용액에서 탈세포화되거나 탈활력화된 태반 조직을 용해하여 태반-유래 기질을 생성하는 단계를 포함한다.
태반-유래 기질은 염기성 pH 예를 들어, 약 8.0 또는 그 초과를 가질 수 있다. 제조 방법은 태반-유래 기질의 pH를 8.0 또는 그 초과로 조절하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 태반-유래 기질은 콜라게나제를 실질적으로 비함유할 수 있다 (예를 들어, 약 10, 0.1, 0.01 또는 0.001 wt% 미만). 태반-유래 기질은 탈세포화되거나 탈활력화된 태반 조직 및 분해 용액을 필수적으로 포함하여 구성될 수 있다. 태반 조직은 포유동물 예를 들어, 인간, 소, 돼지, 쥣과 동물, 양, 말, 개 및 고양이, 바람직하게는, 인간으로부터 유래될 수 있다.
탈세포화 또는 탈활력화 단계는 태반 조직을 비-변성 세정제로 처리하는 것을 포함할 수 있다. 비-변성 세정제는 N-라우로일사르코시네이트, 폴리옥시에틸렌 알코올, 폴리옥시에틸렌 이소알코올, 폴리옥시에틸렌 p-t-옥틸페놀, 폴리옥시에틸렌 노닐페놀, 지방산의 폴리옥시에틸렌 에스테르, 및 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.
제조 방법은 분해와 동시에, 그 전에 또는 후에 탈세포화되거나 탈활력화된 태반 조직을 균질화시키는 것을 추가로 포함할 수 있다. 분해는 분해 용액에서 탈세포화되거나 탈활력화된 태반 조직을 균질화시키는 것을 포함할 수 있다. 탈세포화되거나 탈활력화된 태반 조직은 10초 내지 72시간 동안 균질화될 수 있다. 탈세포화되거나 탈활력화된 태반 조직은 4℃에서 균질화될 수 있다. 제조 방법은 균질화 전에 태반 조직을 절단하는 것을 추가로 포함할 수 있으며, 태반 조직의 단지 일부만이 균질화된다.
제조 방법에서, 태반-유래 기질은 하이드로겔 예를 들어, 열가역성 하이드로겔일 수 있다. 태반-유래 기질은 열가역성 하이드로겔일 수 있으며; 열가역성 하이드로겔의 용액에서 겔로 및/또는 겔에서 용액으로의 전이 온도는 4℃ 내지 40℃의 온도일 수 있다. 태반-유래 기질은 열가역성 하이드로겔일 수 있으며; 열가역성 하이드로겔은 약 37℃ 온도에서 겔일 수 있다.
한 구체예에서, 제조 방법은 태반 조직으로부터의 자연적 가교 이외에 추가적인 가교를 부가하는 것을 포함하지 않는다. 또 다른 구체예에서, 제조 방법은 태반 조직으로부터의 자연 담체 이외에 추가의 담체를 첨가하는 것을 포함하지 않는다. 또 다른 구체예에서, 제조 방법은 광활성제를 첨가하는 것을 포함하지 않는다. 추가의 구체예에서, 제조 방법은 비-자연 발생 결합에 의해 탈세포화되거나 탈활력화된 태반 조직 및/또는 태반-유래 기질을 가교시키는 것을 포함하지 않는다.
제조 방법은 상기 태반-유래 기질을 동결시키거나 동결-건조시켜 동결 또는 동결-건조된 태반-유래 기질을 생성하는 것을 추가로 포함할 수 있다.
제조 방법은 소정의 형상을 갖는 주형에서 태반-유래 기질을 위치시키는 것을 추가로 포함할 수 있으며, 이때 태반-유래 기질은 주형에서 동결 또는 동결-건조된다.
제조 방법은 상기 태반-유래 기질을 동결 또는 동결-건조시켜 스폰지 구조를 생성시키고, 선택적으로 스폰지 구조를 물 대체제로 처리하는 것을 추가로 포함할 수 있으며, 이때 동결 또는 동결-건조된 태반-유래 기질은 습식 상태로 저장된다. 물 대체제는 글리세롤(글리세린 USP), 아도니톨, 소르비톨, 리비톨, 갈락티톨, D-갈락토스, 1,3-디하이드록시프로판올, 에틸렌 글리콜, 트리에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, 글루코스, 수크로스, 만니톨, 자일리톨, 메소-에리트리톨, 아디프산, 프롤린, 하이드록시프롤린, 폴리에틸렌 글리콜, 알코올, 및 지질로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함할 수 있다. 스폰지 구조는 1μm 내지 4000μm의 평균 직경을 갖는 공극을 포함할 수 있다. 스폰지 구조의 평균 공극 부피는 10% 내지 95%일 수 있다.
제조 방법은 상기 태반-유래 기질을 동결 또는 동결-건조시켜 스폰지 구조를 생성시키고; 스폰지 구조를 용매에 용해시켜 태반-유래 용액을 생성하고; 태반-유래 용액을 전기방사하여 나노섬유를 생성시키는 것을 추가로 포함할 수 있다.
제조 방법은 다공성을 증가시키기 위해 음정수압 하에 태반-유래 기질의 스폰지 구조를 처리하는 것을 추가로 포함할 수 있다.
제조 방법은 태반-유래 기질을 전기방사하여 나노섬유를 생성하는 것을 추가로 포함할 수 있다.
제조 방법에서, 탈세포화되거나 탈활력화된 태반 조직은 37℃에서 분해될 수 있다. 분해 용액은 펩신, 산 또는 이들의 조합물을 포함할 수 있다. 산은 강산 예컨대, 염산염(HCl)일 수 있다. 한 구체예에서, 분해 용액은 펩신 및 HCl을 포함하며; 분해 용액 중 펩신의 농도는 400 내지 700단위/ml이며; 분해 용액 중 HCl의 농도는 0.01M 내지 1.0M이다. 분해 용액 중 탈세포화되거나 탈활력화된 태반 조직의 농도는 0.1 내지 40mg/mL일 수 있다. 태반-유래 기질에서 펩신 활성은 산성 pH (예를 들어, 약 1.5-2.0), 바람직하게는, pH 2.0에서 평가할 경우 분해 용액 중의 펩신 활성의 약 10, 5, 1 또는 0.1% 미만일 수 있다.
제조 방법에서, 탈세포화되거나 탈활력화된 태반 조직 중 태반 조직의 중량 백분율은 건조 상태에서 50% 내지 100%일 수 있다. 태반-유래 기질 중 태반 조직의 중량 백분율은 건조 상태에서 50% 내지 100%일 수 있다.
제조 방법에서, 탈세포화되거나 탈활력화된 태반 조직 중의 DNA 양은 탈세포화 또는 탈활력화 단계 전에 태반 조직에서의 DNA 양과 비교하여 적어도 90% 감소될 수 있다. 태반-유래 기질은 태반-유래 기질의 건조 중량 mg 당 10μg, 1μg, 500ng, 200ng 또는 100ng 이하의 DNA를 포함할 수 있다.
제조 방법은 이식 전 태반-유래 기질을 저장하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 태반-유래 기질은 건조 상태로 저장될 수 있다. 태반-유래 기질은 냉동보존에 의해 저장될 수 있다.
제조 방법은 하나 이상의 처리 용액으로 상기 태반-유래 기질을 처리하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 처리 용액은 이온성, 효소적, 또는 화학적 가교제, 광활성제, 또는 폴리머를 포함할 수 있다. 이온성 가교제는 칼슘, 바륨, 알루미늄, 스트론튬, 구리, 아연, 마그네슘, 망간, 코발트, 및 철로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상을 포함할 수 있다. 효소적 가교제는 트랜스글루타미나제, 에틸렌디아민, 리실 옥시다제 패밀리, 헥사메틸렌 디이소시아네이트(HMDIC), 디메틸 수베르이미데이트(DMS), 및 디메틸-3-3'-디티오비스프로피온이미데이트(DTBP)로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상을 포함할 수 있다. 화학적 가교제는 글루타르알데하이드, 글리세르알데하이드, 게니핀, 글루코스 또는 리보스, 폴리(에틸렌 글리콜) 디에폭사이드 크로스링커, 폴리(에틸렌 글리콜) 디글리시딜 에테르, EDC 및 NHS, 및 아크릴 아지드로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상을 포함할 수 있다. 폴리머는 자연 또는 변형된 콜라겐, 젤라틴, 아가로스, 변형된 히알루론산, 피브린, 키틴, 비오틴, 아비딘, 탈광물화된 골 기질, MATRIGEL®, 프로테오글리칸, 라미닌, 피브로넥틴, 엘라스틴, 헤파린, 글리세롤, 수크로스 옥타설페이트, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리메틸메타크릴레이트, 폴리우레탄, 아크릴로일모르폴린, N,N-디메틸 아크릴아미드, N-비닐 피롤리돈 및 테트라하이드로푸르푸릴 메타크릴레이트, 하이드록시아파타이트, 폴리우레탄, 및 폴리락트산으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함할 수 있다.
제조 방법은 탈세포화되거나 탈활력화된 태반 조직 또는 태반-유래 기질에 하나 이상의 생리활성 보충제(들)를 첨가하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 하나 이상의 생리활성 보충제(들)는 FGF 패밀리, TGF-패밀리, IGF-1, PDGF, EGF, VEGF, HGF, PTHrP, Ihh, 덱사메타손, 인슐린, 트랜스페린, 셀레늄, ITS, 및 아스코르베이트의 성장 또는 분화 인자로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.
제조 방법은 탈세포화되거나 탈활력화된 태반 조직 및/또는 태반-유래 기질에 생리활성 보충제 결합 부위(들)를 갖는 하나 이상의 제제(들)를 첨가하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 생리활성 보충제 결합 부위(들)는 상기 태반-유래 기질에 대한 성장 인자, 분화 인자, 사이토킨, 항-미생물제 또는 항-염증제의 친화성을 증가시킬 수 있다.
제조 방법은 태반 조직을 세척하고 소독하는 것을 추가로 포함할 수 있다.
제조 방법은 태반 조직 및/또는 탈세포화되거나 탈활력화된 태반 조직을 멸균시키는 것을 추가로 포함할 수 있다.
제조 방법은 적어도 태반 조직 조각을 탈세포화시켜 탈세포화된 태반 조직을 생성하는 것을 추가로 포함할 수 있다.
제조 방법은 하나 이상의 골 단편 물질(들)을 태반-유래 기질에 첨가하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 골 단편 물질(들)이 비-탈광물화된 골, 부분적으로 탈광물화된 골, 탈광물화된 골, 세라믹, 하이드록시아파타이트, 칼슘 포스페이트, 칼슘 설페이트, 및 칼슘 카보네이트로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상을 포함할 수 있다.
본 발명의 각각의 제조 방법에 있어서, 상기 방법에 의해 제조된 태반-유래 기질이 제공된다.
세포 배양 방법이 제공된다. 방법은 본 발명의 제조 방법에 의해 제조된 태반-유래 기질 상에 또는 내에서 세포를 배양하는 것을 포함한다. 세포는 줄기 세포, 지방 유래 줄기 세포, 후근신경절 세포, 췌장 섬 세포, 심근세포, 간세포, iPSC, 암세포 및 제정맥 내피 세포로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 방법은 태반-유래 기질 상에 또는 내에 세포를 저장하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 태반-유래 기질 상의 또는 내의 세포는 냉동보존에 의해 저장될 수 있다.
동결 또는 동결건조로 인한 단백질의 생물학적 활성 손실을 억제하고/거나 감소시키는 방법이 제공된다. 방법은 동결 또는 동결건조로 인한 단백질의 생물학적 활성의 손실을 억제 또는 감소시키기에 충분한 유효량의 본 발명의 방법에 의해 제조된 태반-유래 기질에 단백질을 노출시키는 것을 포함한다.
세포 전달 방법이 제공된다. 방법은 본 발명의 방법에 의해 제조된 태반-유래 기질에서 세포를 혼합하여 세포와 태반-유래 기질의 혼합물을 생성하고, 관심 부위에 혼합물을 주입하는 것을 포함한다.
세포 전달 방법이 제공된다. 방법은 본 발명의 방법에 의해 제조된 태반-유래 기질 상에 또는 내에서 세포를 배양하여 세포와 태반-유래 기질의 배양물을 생성하고, 관심 부위에 배양물을 주입하는 것을 포함한다. 관심 부위는 세포 전달이 필요한 대상체에 있을 수 있다.
만능 줄기 세포 또는 조직-특이적 전구 세포의 분화를 촉진하는 방법이 제공된다. 방법은 본 발명의 방법에 의해 제조된 태반-유래 기질 상에 또는 내에서 만능 줄기 세포 또는 조직-특이적 전구 세포를 배양하는 것을 포함한다. 만능 줄기 세포는 만능 줄기 세포의 분화를 유도하기 위해 성장 인자 또는 또 다른 2차 인자를 첨가하지 않고 태반-유래 기질 상에 또는 내에서 배양될 수 있으며, 만능 줄기 세포의 분화가 증가된다. 만능 줄기 세포 또는 조직-특이적 전구 세포는 하나 이상의 성장 인자 또는 기타 2차 인자가 첨가되어 배양될 수 있어 세포의 유지 또는 분화를 유도할 수 있다. 만능 줄기 세포 또는 조직-특이적 전구 세포는 골모세포, 연골세포, 심근세포, 췌장 세포, 신경 세포, 인대 또는 힘줄로 분화될 수 있다. 만능 줄기 세포는 성체 줄기 세포일 수 있다. 만능 줄기 세포 또는 조직-특이적 전구 세포는 배아, 태반, 골수, 지방 조직, 혈관, 양수, 활액, 활막, 심장 막, 골막, 경질, 말초 혈액, 제대혈, 태반막, 월경혈, 치아, 수핵(nucleus pulposus), 뇌, 신생아 포피, 피부, 모낭, 장내 담낭, 신경 조직, 간, 췌장, 또는 근육으로부터 유래될 수 있다. 만능 줄기 세포는 만능 줄기 세포 또는 iPSC일 수 있다. 만능 줄기 세포는 지방 유래 줄기 세포 및 치수 줄기 세포로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.
만능 줄기 세포 또는 조직-특이적 전구 세포의 혈관, 근원성 또는 신경성 분화를 촉진하는 방법이 제공된다. 방법은 본 발명의 방법에 의해 제조된 태반-유래 기질 상에 또는 내에서 만능 줄기 세포 또는 조직-특이적 전구 세포를 배양하는 것을 포함한다. 만능 줄기 세포는 성체 줄기 세포일 수 있다. 만능 줄기 세포 또는 조직-특이적 전구 세포는 배아, 태반, 골수, 지방 조직, 혈관, 양수, 활액, 활막, 심장 막, 골막, 경질, 말초 혈액, 제대혈, 태반막, 월경혈, 치아, 수핵, 뇌, 신생아 포피, 피부, 모낭, 장내 담낭, 신경 조직, 또는 근육으로부터 유래될 수 있다. 만능 줄기 세포 또는 조직-특이적 전구 세포는 만능 줄기 세포 또는 iPSC일 수 있다.
조직-특이적 전구 세포의 자가-재생 능력 유지를 증가시키는 방법이 제공된다. 방법은 본 발명의 방법에 의해 제조된 태반-유래 기질 상에 또는 내에서 조직-특이적 전구 세포를 배양하는 것을 포함한다. 한 구체예에서, 조직-특이적 전구 세포의 유지를 유도하기 위한 성장 인자 또는 또 다른 2차 인자가 첨가되지 않는다.
조직 결함을 감소시키거나 수복하는 방법이 제공된다. 방법은 본 발명의 방법에 의해 제조된 태반-유래 기질을 결함 부위에 이식하는 것을 포함한다. 이식은 태반-유래 기질을 결함 부위로 페인팅, 에어브러싱, 적하 또는 주입함으로써 수행될 수 있다. 조직은 심장, 간, 췌장, 골, 연골 또는 연조직일 수 있다. 방법은 상기 태반-유래 기질 상에 또는 내에 바이탈 세포를 시딩하여 상기 태반-유래 기질이 활력을 띠게 하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 방법은 상기 태반-유래 기질 상에 또는 내에 바이탈 세포를 시딩하여 상기 태반-유래 기질이 활력을 띠게하고; 상기 세포-시딩된 태반-유래 기질을 이식 적에 배양하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 방법은 상기 태반-유래 기질이 원위치에서 혈액, 유체, 및/또는 자가 세포를 흡수할 수 있도록 이식 전에 태반-유래 기질의 수화를 배제시킬 수 있다. 방법은 태반-유래 기질을 수화 용액으로 수화시키고; 선택적으로 상기 태반-유래 기질 상에 또는 내에 바이탈 세포를 시딩하여 상기 태반-유래 기질이 활력을 띠게하고; 선택적으로 이식 전에 상기 세포-시딩된 태반-유래 기질을 배양하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 수화 용액은 혈액 또는 골수 흡인액, 혈소판 풍부 혈장, 활액, 효소, 생리활성 보충제, 자연 폴리머, 합성 폴리머, 광활성제, 항산화제, 가교제, 항미생물제, 바이탈 세포, 및 생리활성 보충제 결합 부위(들)를 갖는 하나 이상의 제제로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함할 수 있다. 바이탈 세포는 자가이식 또는 동종이식 골수 흡인물; 골수로부터의 간질 세포; 지방, 윤활막, 골막, 연골막, 근육, 진피, 제대혈, 및 바르톤 젤리(Wharton's jelly); 및 혈관주위세포로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함할 수 있다.
관심 조직 부분을 표지하는 방법이 제공된다. 방법은 본 발명의 방법에 의해 제조된 태반-유래 기질을 관심 조직 부분 아래에 이식하는 것을 포함한다.
조직을 절제하는 방법이 제공된다. 방법은 본 발명의 방법에 의해 제조된 태반-유래 기질을 관심 조직 부분 아래에 이식하고, 태반-유래 기질 위의 조직 부분을 절제하는 것을 포함한다. 이식은 태반-유래 기질을 결함 부위로 페인팅, 에어브러싱, 적하 또는 주입함으로써 수행될 수 있다. 조직은 GI 관의 고착 또는 편평 신생물일 수 있다. 방법은 태반-유래 기질을 이식한 후 점막을 절단하고, 조직을 절제하고, 나머지 GI 관으로부터 조직을 제거하는 것을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 제2 양태에 따르면, 태반-유래 기질이 탈세포화되거나 탈활력화된 태반 조직을 포함하며, 태반-유래 기질이 예를 들어, 8.0 또는 그 초과의 염기성 pH를 갖는다. 태반-유래 기질이 실질적으로 콜라게나제를 함유하지 않을 수 있다 (예를 들어, 약 10, 0.1, 0.01 또는 0.001 wt% 미만). 태반 유래 기질은 탈세포화되거나 탈활력화된 태반 조직을 필수적으로 포함하여 구성될 수 있다.
태반-유래 기질은 하이드로겔 예를 들어, 열가역성 하이드로겔일 수 있다. 한 구체예에서, 태반-유래 기질은 열가역성 하이드로겔이며; 열가역성 하이드로겔의 용액-내지-겔 전이 온도는 4℃ 내지 40℃의 온도이다. 또 다른 구체예에서, 태반-유래 기질은 열가역성 하이드로겔이며; 열가역성 하이드로겔은 약 37℃ 온도에서 겔화된다.
태반-유래 기질은 스폰지 구조를 포함할 수 있다. 태반-유래 기질은 나노섬유를 포함할 수 있다. 태반-유래 기질 중 태반 조직의 중량 백분율은 건조 상태에서 50% 내지 100%일 수 있다. 탈세포화되거나 탈활력화된 태반 조직은 포유동물 예를 들어, 인간, 소, 돼지, 쥣과 동물, 양, 말, 개 및 고양이, 바람직하게는, 인간으로부터 유래될 수 있다. 태반-유래 기질은 태반-유래 기질의 건조 중량 mg 당 10μg, 1μg, 500ng, 200ng 또는 100ng 이하의 DNA를 포함할 수 있다. 태반-유래 기질은 타입 I 콜라겐, 타입 IV 콜라겐, 라미닌 감마-1, 피브로넥틴, 융모 소마토마모트로핀, FGF-12, FGF-13, IGF-2, EGFL-7 및 bFGF를 포함할 수 있으며, 태반-유래 기질 중 타입 I 콜라겐의 농도는 35% 초과이다.
세포 배양 방법이 제공된다. 방법은 본 발명의 태반-유래 기질 상에 또는 내에 세포를 배양하는 것을 포함한다.
동결 또는 동결건조로 인한 단백질의 생물학적 활성 손실을 억제하고/거나 감소시키는 방법이 제공된다. 방법은 동결 또는 동결건조로 인한 단백질의 생물학적 활성의 손실을 억제 또는 감소시키기에 충분한 유효량의 본 발명의 태반-유래 기질에 단백질을 노출시키는 것을 포함한다.
세포 전달 방법이 제공된다. 방법은 본 발명의 태반-유래 기질에서 세포를 혼합하여 세포와 태반-유래 기질의 혼합물을 제조하고, 관심 부위에 혼합물을 주입하는 것을 포함한다.
세포 전달 방법이 제공된다. 방법은 본 발명의 태반-유래 기질 상에 또는 내에서 세포를 배양하여 세포와 태반-유래 기질의 배양물을 생성하고, 관심 부위에 배양물을 주입하는 것을 포함한다.
만능 줄기 세포 또는 조직-특이적 전구 세포의 분화를 촉진하는 방법이 제공된다. 방법은 본 발명의 태반-유래 기질 상에 또는 내에서 만능 줄기 세포 또는 조직-특이적 전구 세포를 배양하는 것을 포함한다.
만능 줄기 세포 또는 조직-특이적 전구 세포의 혈관, 근원성 또는 신경성 분화를 촉진하는 방법이 제공된다. 방법은 본 발명의 태반-유래 기질 상에 또는 내에서 만능 줄기 세포 또는 조직-특이적 전구 세포를 배양하는 것을 포함한다.
조직-특이적 전구 세포의 자가-재생 능력 유지를 증가시키는 방법이 제공된다. 방법은 본 발명의 태반-유래 기질 상에 또는 내에서 조직-특이적 전구 세포를 배양하는 것을 포함한다.
조직 결함을 감소시키거나 수복하는 방법이 제공된다. 방법은 본 발명의 태반-유래 기질을 결함 부위에 이식하는 것을 포함한다.
관심 조직 부분을 표지하는 방법이 제공된다. 방법은 본 발명의 태반-유래 기질을 관심 조직 부분 아래에 이식하는 것을 포함한다.
조직을 절제하는 방법이 제공된다. 방법은 본 발명의 태반-유래 기질을 관심 조직 부분 아래에 이식하고, 상기 태반-유래 기질 위의 조직 부분을 절제하는 것을 포함한다.
본 발명의 제3 양태에 따르면, 기재 표면 상에 태반-유래 기질을 코팅하는 방법이 제공된다. 방법은 (a) 적어도 태반 조직 조각을 탈세포화하거나 탈활력화시켜 탈세포화되거나 탈활력화된 태반 조직을 생성하는 단계, (b) 분해 용액에서 탈세포화되거나 탈활력화된 태반 조직을 분해하여 태반-유래 기질을 생성하는 단계; 및 (d) 기재의 표면의 적어도 일부를 태반-유래 기질로 코팅하는 단계를 포함한다. 태반-유래 기질은 코팅 전에 염기성 pH를 가질 수 있다. 코팅 방법은 코팅 전에 태반-유래 기질의 pH를을 염기성 예를 들어, 8.0 또는 그 초과의 pH로 조절하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 태반-유래 기질이 실질적으로 콜라게나제를 함유하지 않을 수 있다 (예를 들어, 약 10, 0.1, 0.01 또는 0.001 wt% 미만). 태반 유래 기질은 탈세포화되거나 탈활력화된 태반 조직 및 분해 용액을 필수적으로 포함하여 구성될 수 있다. 태반 조직은 포유동물 예를 들어, 인간, 소, 돼지, 쥣과 동물, 양, 말, 개 및 고양이, 바람직하게는, 인간으로부터 비롯될 수 있다.
코팅 방법은 태반-유래 기질을 표면 상에 전기방사하는 것을 추가로 포함할 수 있다.
코팅 방법은 분해와 동시에 또는 그 전에 태반 조직을 균질화시키는 것을 추가로 포함할 수 있다. 분해는 분해 용액 중에 탈세포화되거나 탈활력화된 태반 조직을 균질화시키는 것을 포함할 수 있다. 균질화는 10초 내지 72시간 동안 수행될 수 있다. 균질화는 4℃에서 수행될 수 있다.
코팅 방법은 균질화 전에 태반 조직을 절단하고, 태반 조직의 일부분만을 균질화시키는 것을 추가로 포함할 수 있다.
태반-유래 기질이 하이드로겔인 경우, 코팅 방법은 표면 상에서 태반-유래 기질을 겔화시키는 것을 추가로 포함할 수 있다. 한 구체예에서, 태반-유래 기질은 열가역성 하이드로겔이며; 열가역성 하이드로겔의 용액-내지-겔 전이 온도는 4℃ 내지 40℃의 온도이다. 또 다른 구체예에서, 태반-유래 기질은 열가역성 하이드로겔이며; 열가역성 하이드로겔은 약 37℃ 온도에서 겔화된다.
한 구체예에서, 코팅 방법은 태반 조직으로부터의 자연 크로스링커 이외에 추가적인 크로스링커를 첨가하는 것을 포함하지 않는다. 또 다른 구체예에서, 코팅 방법은 태반 조직으로부터의 자연 담체 이외에 추가의 담체를 첨가하는 것을 포함하지 않는다. 또 다른 구체예에서, 코팅 방법은 광활성제를 첨가하는 것을 포함하지 않는다. 추가의 구체예에서, 코팅 방법은 비-자연 발생 결합에 의해 태반 조직 또는 탈세포화되거나 탈활력화된 태반 조직을 가교시키는 것을 포함하지 않는다.
코팅 방법에서, 분해 용액은 펩신, HCl 또는 이들의 조합물을 포함할 수 있다. 한 구체예에서, 분해 용액은 펩신 및 HCl을 포함하며; 펩신의 농도는 400 내지 700단위/ml이며; HCl의 농도는 0.01M 내지 1.0M이다.
코팅 방법에서, 분해 용액 중 탈세포화되거나 탈활력화된 태반 조직의 농도는 5 내지 50mg/mL일 수 있다. 탈세포화되거나 탈활력화된 태반 조직 중 태반 조직의 중량 백분율은 건조 상태에서 50% 내지 100%일 수 있다. 태반-유래 기질 중 태반 조직의 중량 백분율은 건조 상태에서 50% 내지 100%일 수 있다.
코팅 방법에서, 탈세포화되거나 탈활력화된 태반 조직 중의 DNA 양은 탈세포화 단계 전의 태반 조직의 DNA 양과 비교하여 적어도 90% 감소될 수 있다. 태반-유래 기질은 태반-유래 기질의 mg 당 10μg, 1μg, 500ng, 200ng 또는 100ng 이하의 DNA를 포함할 수 있다.
코팅 방법은 이식 전에 기재를 저장하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 기재는 건조 상태로 저장될 수 있다. 기재는 냉동보존에 의해 저장될 수 있다.
코팅 방법은 코팅 전 또는 후에 상기 태반-유래 기질을 하나 이상의 처리 용액으로 처리하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 상기 하나 이상의 처리 용액 중 적어도 하나는 이온성, 효소적, 또는 화학적 가교제, 광활성제, 또는 폴리머를 포함할 수 있다. 이온성 가교제는 칼슘, 바륨, 알루미늄, 스트론튬, 구리, 아연, 마그네슘, 망간, 코발트, 및 철로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상을 포함할 수 있다. 효소적 가교제는 트랜스글루타미나제, 에틸렌디아민, 리실 옥시다제 패밀리, 헥사메틸렌 디이소시아네이트(HMDIC), 디메틸 수베르이미데이트(DMS), 및 디메틸-3-3'-디티오비스프로피온이미데이트(DTBP)로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상을 포함할 수 있다. 화학적 가교제는 글루타르알데하이드, 글리세르알데하이드, 게니핀, 글루코스 또는 리보스, 폴리(에틸렌 글리콜) 디에폭사이드 크로스링커, 폴리(에틸렌 글리콜) 디글리시딜 에테르, EDC 및 NHS, 및 아크릴 아지드로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상을 포함할 수 있다. 폴리머는 자연 또는 변형된 콜라겐, 젤라틴, 아가로스, 변형된 히알루론산, 피브린, 키틴, 비오틴, 아비딘, 탈광물화된 골 기질, MATRIGEL®, 프로테오글리칸, 라미닌, 피브로넥틴, 엘라스틴, 헤파린, 글리세롤, 수크로스 옥타설페이트, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리메틸메타크릴레이트, 폴리우레탄, 아크릴로일모르폴린, N,N-디메틸 아크릴아미드, N-비닐 피롤리돈 및 테트라하이드로푸르푸릴 메타크릴레이트, 하이드록시아파타이트, 폴리우레탄, 및 폴리락트산으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함할 수 있다.
코팅 방법은 코팅 전 또는 후에 탈세포화되거나 탈활력화된 태반 조직 및/또는 태반-유래 기질에 하나 이상의 생리활성 보충제(들)를 첨가하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 하나 이상의 생리활성 보충제(들)는 FGF 패밀리, TGF-패밀리, IGF-1, PDGF, EGF, VEGF, HGF, PTHrP, Ihh, 덱사메타손, 인슐린, 트랜스페린, 셀레늄, ITS, 또는 아스코르베이트의 성장 또는 분화 인자로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.
코팅 방법은 탈세포화되거나 탈활력화된 태반 조직 및/또는 태반-유래 기질에 생리활성 보충제 결합 부위(들)를 갖는 하나 이상의 제제(들)를 첨가하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 생리활성 보충제 결합 부위(들)는 상기 태반-유래 기질에 대한 성장 인자, 분화 인자, 사이토킨, 항-미생물제 또는 항-염증제의 친화성을 증가시킬 수 있다.
코팅 방법은 태반 조직을 세척하고 소독하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 코팅 방법은 태반 조직 및/또는 탈세포화되거나 탈활력화된 태반 조직을 멸균시키는 것을 추가로 포함할 수 있다. 코팅 방법은 태반 조직을 탈세포화하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 코팅 방법은 다공성을 증가시키기 위해 음정수압 하에 태반-유래 기질을 처리하는 것을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 각각의 코팅 방법에 있어서, 방법에 의해 생성된 스캐폴드가 제공된다.
본 발명의 각각의 코팅 방법에 있어서, 방법에 의해 생성된 태반-유래 기질로 코팅된 표면이 제공된다.
본 발명의 각각의 코팅 방법에 있어서, 세포 배양 방법이 제공된다. 세포 배양 방법은 코팅 방법에 의해 생성된 태반-유래 기질로 코팅된 세포 배양 표면 상에서 세포를 배양하는 것을 포함한다.
도면의 간단한 설명
도 1은 Mass Spectrometry Relative Abundance Data를 묘사한다. MATRIGEL®에 비해 태반 유래 기질 샘플에서 발견된 주요 ECM 단백질의 양은 오비트랩 질량 분광법으로 결정된 상대적 풍부성과 함께 태반 유래 기질 샘플에서 지금까지 확인된 모든 콜라겐 아이소형 (쇄)의 목록과 함께 표시된다.
도 2는 태반-유래 기질 샘플 HuMATRIX 및 MATRIGEL®에 존재하는 잔여 DNA를 묘사한다. 태반 유래 기질 샘플에 존재하는 잔여 DNA의 양을 정량화하기 위해, 피코 그린 검정법을 수행하였다. 시작 태반 조직, HuMATRIX 및 MATRIGEL®은 각각 조직 또는 매트릭스 당 11,242.52, 119.69 및 126.59ng의 평균 DNA 농도(ng/mg 조직)를 가지며 시작 조직에 비해 DNA가 대략 95% 감소한 것으로 나타났다. 이는 H&E에 의해 염색된 바와 같이 태반-유래 기질의 조직학적 절편에 의해 확인되었다.
도 3은 검정 민감도의 평가를 나타낸다. 펩신 농도가 0.75mg/ml보다 작으면 시험 샘플의 측정된 절대 흡수와 선형 관계를 나타냈다. 0.75mg/ml보다 큰 농도에서 포화가 달성되었다. 개별 시험 샘플 간의 높은 수준의 재현성 및 낮은 오차 범위를 주목하라 (n = 4).
도 4a 및 4b는 pH7.4 또는 pH8.2로의 pH 스위프 후 잔여 펩신 활성에 대한 효과를 나타낸다. a: 제조되고 (0.75mg/ml, pH2.0), 각각 pH7.4 (중성) 또는 pH8.2로의 pH 스위프 후 펩신 활성 검정에 의해 측정된 시험 샘플 중 절대 펩신 활성. 중성 또는 pH8.2로의 pH 스위프는 비-조절된 샘플 대비 펩신의 현저한 불활성화를 초래하였으며 (*, n=4, P<0.01), pH8.2 스위프로의 시험 샘플 처리는 pH7.4 스위프로 노출된 시험 샘플과 비교하여 중성 pH 스위프 (#, n = 4, P <0.01)에 노출된 시험 샘플보다 현저하게 더 큰 수준의 펩신 불활성화를 나타냈다. b: 비-조절된 시험 샘플(pH 2.0)과 비교하여 pH 스위프로 처리된 시험 샘플 중 잔여 펩신 활성의 상대적 수준.
도 5는 시간에 따른 펩신의 활성 손실을 보여준다. 펩신 용액 및 ECM-함유 시험 샘플은 시간에 따른 단백질 분해 활성에서 점진적인 감소를 나타냈다. 조기 시점에서, ECM-함유 시험 샘플은 펩신 용액 단독보다 현저하게 더 높은 단백질분해 활성을 나타냈다.
도 6a 및 6b는 펩신 추출 후 태반 ECM 분해 생성물 및 태반 ECM의 존재하에 pH7.4 또는 pH8.2로의 pH 스위프 후 잔여 펩신 활성에 대한 효과를 보여준다. a: 제조되고 (0.75mg/ml, pH2.0), 각각 pH7.4 (중성) 또는 pH8.2로의 pH 스위프 후 펩신 활성 검정에 의해 측정된 5, 240 또는 1440분 동안 인큐베이션된 시험 샘플 중 절대 펩신 활성. 중성 또는 pH8.2로의 pH 스위프는 비-조절된 샘플(n=4, P<0.01) 대비 펩신의 현저한 불활성화를 초래하였으며, pH8.2 스위프로의 시험 샘플 처리는 pH7.4 스위프로 노출된 시험 샘플과 비교하여 중성 pH 스위프 (n = 4, P <0.01)에 노출된 시험 샘플보다 현저하게 더 큰 수준의 펩신 불활성화를 나타냈다. 시간에 따른 모든 시험 그룹에서 펩신 활성의 관찰된 감소 및 태반 ECM과 관련된 단백질 분해 활성의 증가된 수준을 주목하라. b: 비-조절된 시험 샘플과 비교하여 pH 스위프로 처리된 시험 샘플 중 잔여 펩신 활성의 상대적 수준 (pH 2.0)' 그룹당 n=4 P<0.01 내지 pH2.0 (*) 및 pH7.2 스위프 (#).
도 1은 Mass Spectrometry Relative Abundance Data를 묘사한다. MATRIGEL®에 비해 태반 유래 기질 샘플에서 발견된 주요 ECM 단백질의 양은 오비트랩 질량 분광법으로 결정된 상대적 풍부성과 함께 태반 유래 기질 샘플에서 지금까지 확인된 모든 콜라겐 아이소형 (쇄)의 목록과 함께 표시된다.
도 2는 태반-유래 기질 샘플 HuMATRIX 및 MATRIGEL®에 존재하는 잔여 DNA를 묘사한다. 태반 유래 기질 샘플에 존재하는 잔여 DNA의 양을 정량화하기 위해, 피코 그린 검정법을 수행하였다. 시작 태반 조직, HuMATRIX 및 MATRIGEL®은 각각 조직 또는 매트릭스 당 11,242.52, 119.69 및 126.59ng의 평균 DNA 농도(ng/mg 조직)를 가지며 시작 조직에 비해 DNA가 대략 95% 감소한 것으로 나타났다. 이는 H&E에 의해 염색된 바와 같이 태반-유래 기질의 조직학적 절편에 의해 확인되었다.
도 3은 검정 민감도의 평가를 나타낸다. 펩신 농도가 0.75mg/ml보다 작으면 시험 샘플의 측정된 절대 흡수와 선형 관계를 나타냈다. 0.75mg/ml보다 큰 농도에서 포화가 달성되었다. 개별 시험 샘플 간의 높은 수준의 재현성 및 낮은 오차 범위를 주목하라 (n = 4).
도 4a 및 4b는 pH7.4 또는 pH8.2로의 pH 스위프 후 잔여 펩신 활성에 대한 효과를 나타낸다. a: 제조되고 (0.75mg/ml, pH2.0), 각각 pH7.4 (중성) 또는 pH8.2로의 pH 스위프 후 펩신 활성 검정에 의해 측정된 시험 샘플 중 절대 펩신 활성. 중성 또는 pH8.2로의 pH 스위프는 비-조절된 샘플 대비 펩신의 현저한 불활성화를 초래하였으며 (*, n=4, P<0.01), pH8.2 스위프로의 시험 샘플 처리는 pH7.4 스위프로 노출된 시험 샘플과 비교하여 중성 pH 스위프 (#, n = 4, P <0.01)에 노출된 시험 샘플보다 현저하게 더 큰 수준의 펩신 불활성화를 나타냈다. b: 비-조절된 시험 샘플(pH 2.0)과 비교하여 pH 스위프로 처리된 시험 샘플 중 잔여 펩신 활성의 상대적 수준.
도 5는 시간에 따른 펩신의 활성 손실을 보여준다. 펩신 용액 및 ECM-함유 시험 샘플은 시간에 따른 단백질 분해 활성에서 점진적인 감소를 나타냈다. 조기 시점에서, ECM-함유 시험 샘플은 펩신 용액 단독보다 현저하게 더 높은 단백질분해 활성을 나타냈다.
도 6a 및 6b는 펩신 추출 후 태반 ECM 분해 생성물 및 태반 ECM의 존재하에 pH7.4 또는 pH8.2로의 pH 스위프 후 잔여 펩신 활성에 대한 효과를 보여준다. a: 제조되고 (0.75mg/ml, pH2.0), 각각 pH7.4 (중성) 또는 pH8.2로의 pH 스위프 후 펩신 활성 검정에 의해 측정된 5, 240 또는 1440분 동안 인큐베이션된 시험 샘플 중 절대 펩신 활성. 중성 또는 pH8.2로의 pH 스위프는 비-조절된 샘플(n=4, P<0.01) 대비 펩신의 현저한 불활성화를 초래하였으며, pH8.2 스위프로의 시험 샘플 처리는 pH7.4 스위프로 노출된 시험 샘플과 비교하여 중성 pH 스위프 (n = 4, P <0.01)에 노출된 시험 샘플보다 현저하게 더 큰 수준의 펩신 불활성화를 나타냈다. 시간에 따른 모든 시험 그룹에서 펩신 활성의 관찰된 감소 및 태반 ECM과 관련된 단백질 분해 활성의 증가된 수준을 주목하라. b: 비-조절된 시험 샘플과 비교하여 pH 스위프로 처리된 시험 샘플 중 잔여 펩신 활성의 상대적 수준 (pH 2.0)' 그룹당 n=4 P<0.01 내지 pH2.0 (*) 및 pH7.2 스위프 (#).
치료 목적으로 세포외 기질(ECM)의 임상 적용을 발전시키기 위해, 태반-유래 기질을 제조하고 이들의 ECM을 예를 들어, 새로운 생체내 전달 및 제노-프리, 혈청-비함유 체세포 및 줄기 세포 배양 지지에 대해 단백질체학적으로 평가하였다. 염기성 pH를 갖는 태반-유래 기질이 중성 pH를 갖는 것에 비해 개선점을 제공함이 밝혀졌다. 예를 들어, 염기성 pH는 분해 효소를 예컨대, 펩신을 비가역적으로 불활성화시키고 ECM을 제조하기 위해 조직 분해의 정확한 제어를 제공한다. 또한, 염기성 pH는 ECM에 더욱 우수한 겔화 특성 예를 들어, 더욱 균질한 ECM을 제공한다. 또한, 염기성 pH를 갖는 ECM은 더욱 우수한 세포 기능 예를 들어, 더욱 우수한 세포 부착성을 나타낸다. 또한, 태반 조직을 하나 이상의 비변성 세정제로 처리하는 것을 포함하는 탈세포화 또는 탈활력화 공정에 의해 제조된 추출된 용액, 하이드로겔 또는 기타 재구성된 스캐폴드 형태의 태반-유래 기질이 태반 조직의 생물학적 기능을 실질적으로 유지할 수 있음이 밝혀졌다.
본 발명은 태산-유래 기질, 제조 방법, 및 이의 사용 방법을 제공한다. 본 발명은 또한, 세포를 배양하고, 세포를 전달하고, 줄기 세포 또는 조직-특이적 전구 세포의 분화를 촉진하고, 태산-유래 기질을 사용하여 결함부의 흉터를 수복시키거나, 대체하거나, 재생시키거나, 충전시키거나, 감소시키거나 억제하는 방법을 제공한다. 본 발명은 표면 상을 태반-유래 기질로 코팅하거나 해당 부위로 태반-유래 기질을 주입하는 방법을 추가로 제공한다.
한 양태에서, 본 발명은 태반-유래 기질을 제조하는 방법에 관한 것이다. 본 방법은 태반 조직을 탈세포화시키거나 탈활력화시켜 탈세포화되거나 탈활력화된 태반 조직을 생성하고, 분해 용액에서 탈세포화되거나 탈활력화된 태반 조직을 분해하여 태반-유래 기질을 생성하는 것을 포함한다.
본원에 사용된 용어 "태반-유래 기질"은 태반 조직으로부터 제조된 세포외 기질을 나타낸다. 태반-유래 기질은 태반 조직에서 세포외 분자(예를 들어, 단백질, 다당류 및 프로테오글리칸)의 상당한 양(예를 들어, 적어도 약 70, 80, 90, 95, 99%, 99.9% 또는 99.999%)을 보유할 수 있다. 바람직하게는, 태반-유래 기질은 생존 가능한 세포를 포함하지 않는다. 태반-유래 기질이 태반 조직 중 하나 이상의 분자 (예를 들어, 콜라게나제 및 엔도톡시)을 실질적으로 함유하지 않을 수 있다 (예를 들어, 약 10, 0.1, 0.01 또는 0.001 wt% 미만).
태반-유래 기질은 염기성 pH를 가질 수 있다. 제조 방법은 탈세포화되거나 탈활력화된 태반 조직의 분해에 의해 생성된 태반-유래 기질의 pH를 염기성 예를 들어, 약 8.0 또는 그 초과, 바람직하게는, 약 8.2로 조절하는 것을 추가로 포함할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "염기성 pH"는 약 7.8을 초과하는 pH를 나타낸다. 염기성 pH는 약 8.0-11.0 바람직하게는, 약 8.0-9.0, 더욱 바람직하게는, 약 8.0-8.2의 범위일 수 있다. 예를 들어, 염기성 pH는 약 7.9, 8.0, 8.1, 8.2, 8.3, 8.4, 8.5, 8.6, 8.7, 8.8, 8.9 또는 9.0일 수 있다. 바람직하게는, 염기성 pH는 약 8.2이다.
본원에서 사용된 용어 "중성 pH"는 약 6.0-7.8, 바람직하게는 약 6.5-7.5, 더욱 바람직하게는, 약 6.8-7.2의 pH를 나타낸다. 예를 들어, 중성 pH는 약 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9, 7.0, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, 7.5, 7.6, 7.7 또는 7.8일 수 있다. 바람직하게는, 중성 pH는 약 7.4이다.
본원에 사용된 용어 "산성 pH"는 약 5.0 미만의 pH를 나타낸다. 산성 pH는 약 1.0-5.0, 바람직하게는, 약 1.0-4.0, 더욱 바람직하게는, 약 1.5-2.0의 범위일 수 있다. 예를 들어, 산성 pH는 약 1.0, 1.5, 2.0, 2.5, 3.0, 3.5 또는 4.0일 수 있다. 바람직하게는, 산성 pH는 약 2.0이다.
본원에서 사용된 용어 "탈세포화"는 조직 예를 들어, 태반 조직에서 원상태 세포의 예를 들어, 적어도 약 70, 80, 90, 95, 99, 99.9 또는 99.999% 만큼 상당한 양을 감소시키는 과정을 나타낸다.
본원에서 사용된 용어 "탈활력화"는 조직 예를 들어, 태반 조직에서 생존 가능한 세포의 예를 들어, 적어도 약 70, 80, 90, 95, 99, 99.9 또는 99.999% 만큼 상당한 양을 감소시키는 과정을 나타낸다. 바람직하게는, 태반-유래 기질은 생존 가능한 세포를 포함하지 않는다.
태반 조직은 포유동물로부터 비롯될 수 있다. 포유동물은 인간, 소, 돼지, 쥣과 동물, 양, 말, 개 또는 고양이일 수 있다. 바람직하게는, 태반 조직은 인간 태반 조직이다. 한 구체예에서, 태반-유래 기질이 예를 들어, 이식에 의해 인간에 도입되는 경우, 태반-유래 기질은 대상체에서 면역 반응을 유도하지 않는다.
본원에 기술된 탈세포화 또는 탈활력화 과정은 태반 조직 조각으로부터의 세포 성분을 제거한다. 본원에 기재된 탈세포화 또는 탈활력화 과정은 미국 특허 번호 6,734,018, 7,338,757, 8,574,826, 6,743,574, 및 8,563,232, 및 미국 특허 출원 공개 번호 2014/0065238A1 및 2014/0154663A1에 기술된 방법에 따라 수행될 수 있으며, 이들 각각은 그 전체가 본원에 참조로 통합된다. 탈세포화 또는 탈활력화 과정은 세정제, 엔도뉴클레아제, 또는 프로테아제를 사용하는 것을 포함하지 않을 수 있다. 탈활력화 또는 탈활력화 과정은 태반 조직의 기질 및/또는 조직 구조에 대한 손상 없이 수행될 수 있고, 세정제, 사르코시네이트, 엔도뉴클레아제, 및 소독제를 사용할 수 있다. 세정제는 조직, 바람직하게는, 태반 조직, 더욱 바람직하게는, 인간 태반 조직을 탈세포화 또는 탈활력화시키는데 적합한 임의의 세정제일 수 있다. 일부 구체예에서, 탈활력화 태반 조직은 세정제 바람직하게는, 비-변성 세정제를 사용하여 태반 조직을 탈활력화시킴으로써 생성된다. 비-변성 세정제는 N-라우로일사르코시네이트, 폴리옥시에틸렌 알코올, 폴리옥시에틸렌 이소알코올, 폴리옥시에틸렌 p-t-옥틸 페놀, 폴리옥시에틸렌 노니페놀, 지방산의 폴리옥시에틸렌 에스테르, 및 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 세정제는 바람직하게는, 음이온성 세정제 또는 변성 세정제 예를 들어, SDS가 아니다.
기질 구조는 기타 성분 중에서 콜라겐, 히알루로닌, 엘라스틴, 뮤코다당류 및 프로테오글리칸을 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 태반-유래 기질은 콜라겐, 콜라겐 타입 I, 및/또는 콜라겐 타입 IV 이외에 하나 초과 유형의 콜라겐 및/또는 하나 초과의 단백질을 포함할 수 있다. 탈세포화 또는 탈활력화 과정 전에 태반 조직 중 적어도 약 50, 60, 70, 80, 90, 95 또는 99 wt%의 ECM 단백질(예를 들어, 콜라겐 I, 콜라겐 IV, 피브로넥틴, 라미닌, 및 태반 락토겐)은 생성된 태반-유래 기질에 잔존할 수 있다.
일부 구체예에서, 탈세포화되거나 탈활력화된 태반 조직에서 DNA 양은 탈세포화 또는 탈활력화 공정 전의 태반 조직의 DNA 양 대비 60, 70, 80, 85, 90, 95, 99% 또는 그 초과; 60, 70, 80, 85, 90, 95, 99, 100% 또는 그 미만; 및/또는 50 내지 100%, 70 내지 100%, 90 내지 100%, 90 내지 95% 감소된다. 기타 구체예에서, 태반-유래 기질은 태반-유래 기질의 건조 중량 mg 당 10μg, 1μg, 500ng, 200ng 또는 100ng 이하의 DNA를 포함한다.
추가의 구체예에서, 본원에 기술된 태반 조직은 자가이식편, 동종이식편, 또는 이종이식편이다. 추가의 구체예에서, 본원의 태반 조직은 특히, 인간, 인간외 동물, 소, 말, 돼지, 양, 염소 또는 어류 기원을 가질 수 있다. 추가의 구체예에서, 본원에 기술된 태반 조직은 (i) 플레이트, 양막 및 융모막을 갖는 전체의 완전한 태반, 또는 (ii) 양막 및/또는 융모막을 제외한 태반 조직의 일부일 수 있다. 태반 조직은 또한, 생물공학적 방법의 생성물 예를 들어, 세포 배양 방법을 이용하여 생성된 조직 공학처리된 태반 조직일 수 있으며, 생물공학적 방법의 이러한 생성물은 본원에 기재된 태반 조직으로서 포함될 수 있다.
본 발명의 일부 구체예에 따라 태반-유래 기질을 제조하는 방법은 분해 용액에서 탈세포화되거나 탈활력화된 태반 조직을 분해하여 태반-유래 기질을 생성시키는 것을 포함한다. 본원에 기술된 분해 용액은 태반 조직에서 단백질의 적어도 일부를 분해하기 위해 효소를 포함할 수 있다. 예를 들어, 분해 용액은 산, 강 또는 약 산, 및 파파인, 펩신, 펩시노겐, 트립신, 콜라게나제, 및/또는 디스파제를 비제한적으로 포함하는 프로테아제를 포함할 수 있다. 산은 염산염(HCl), 질산(HNO3), 아세트산(HC2H3O2), 시트르산(H3C6H5O7), 황산(H2SO4) 및 트리플루오로아세트산(CF3CO2H)으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 바람직하게는, 산은 HCl이다. 본원에 사용된 용어 "및/또는"은 관련 열거 항목 중 하나 이상의 임의의 및 모든 조합을 포함한다.
일부 구체예에서, 분해 용액 중 펩신의 농도는 약 300, 400, 500, 600, 700, 800, 1000, 5000 또는 8000단위/ml 또는 그 미만; 약 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 1000, 5000 또는 6000단위/ml 또는 그 초과; 및/또는 약 100 내지 8000, 200 내지 1000, 400 내지 700, 100 내지 600, 400 내지 1000, 300 내지 600, 또는 500 내지 600단위/ml일 수 있다. 태반-유래 기질 중 펩신 활성은 적합한 산성 pH 예를 들어, 약 2.0에서 시험할 경우 분해 용액 중의 활성의 약 10, 5, 1 또는 0.1% 미만일 수 있다.
추가의 구체예에서, 분해 용액 중 산(예를 들어, HCl)의 농도는 약 0.005, 0.002, 0.005, 0.02, 0.2, 0.3, 0.4, 0.6, 0.8, 1.0M 또는 그 미만; 약 0.0001, 0.0005, 0.001, 0.005, 0.01, 0.15, 0.2, 0.3, 0.5, 0.7M 또는 그 초과; 및/또는 약 0.0005 내지 1.0M, 0.01 내지 0.2M, 0.001 내지 0.5M, 0.02 내지 0.2, 0.02 내지 0.1, 0.01 내지 0.1, 또는 0.0001 내지 0.5M일 수 있다. 추가의 구체예에서, 분해 용액 중 탈세포화되거나 탈활력화된 태반 조직의 농도는 약 0.01, 0.1, 0.5, 1, 5, 10, 20, 30, 40, 50mg/mL 또는 그 미만; 약 0.01, 0.1, 0.5, 1, 5, 10, 20, 30, 40, 50mg/mL 또는 그 초과; 및/또는 약 0.1 내지 40, 1 내지 50, 10 내지 40, 0.01 내지 100, 또는 10 내지 100mg/mL일 수 있다. 추가의 구체예에서, 태반 조직 및/또는 탈세포화되거나 탈활력화된 태반 조직은 약 5초, 10초, 15초, 20초, 25초, 30초, 40초, 50초, 60초, 2분, 3분, 4분, 5분, 10분, 15분, 30분, 60분, 2시간, 5시간, 10시간, 24시간, 48시간 또는 72시간 또는 그 초과 동안 분해된다. 추가의 구체예에서, 태반 조직 및/또는 탈세포화되거나 탈활력화된 태반 조직은 약 20초, 30초, 60초, 2분, 3분, 4분, 5분, 10분, 15분, 30분, 60분, 2시간, 5시간, 10시간, 24시간, 48시간 또는 72시간 또는 그 미만 동안 분해된다. 추가의 구체예에서, 태반 조직 및/또는 탈세포화되거나 탈활력화된 태반 조직은 약 20초 내지 72시간, 약 1분 내지 20분, 약 1분 내지 10분, 또는 약 1분 내지 6분 동안 분해된다.
본 발명의 일부 구체예에 따른 태반-유래 기질을 제조하는 방법은 분해 전 또는 후에 탈세포화되거나 탈활력화된 태반 조직을 동시에 균질화시켜 균질화된 태반 조직 또는 태반 조직 균질화물을 포함하는 태반-유래 기질을 생성하는 것을 추가로 포함한다. 일부 구체예에서, 분해는 분해 용액 중에서 탈세포화되거나 탈활력화된 태반 조직을 균질화시키는 것을 포함한다. 균질화된 태반 조직 또는 태반 조직 균질화물은 적어도 균질화 전의 조직 또는 조직 조각과 비교하여 더욱 작고/거나 균일하게 분포되는 입자로 감소된 탈세포화되거나 탈활력화된 태반 조직의 적어도 조각을 함유한다. 균질화된 태반 조직은 입자 외에, 물, 수용액, 또는 수혼화성 극성 유기 용매 중 적어도 하나를 임의로 포함할 수 있다. 본 발명의 방법에 이용된 균질화된 태반 조직은 약 100 미크론 미만의 평균 직경을 갖는 입자를 포함한다. 일부 구체예에서, 균질화된 태반 조직은 태반 조직, 및 임의로, 물, 수용액 및 수혼화성 극성 유기 용매 중 적어도 하나를 포함하는 조성물의 전단-유도 파쇄(shredding)에 의해 제조될 수 있다. 통상적인 블렌더는 특정 구체예에서, 균질화된 태반 조직을 제조하는데 이용될 수 있다. 일부 구체예에서, 태반 조직은 연조직을 썰고/거나, 스카이빙하고/하거나(skiving), 제분(냉동-제분 포함)하고/하거나, 분쇄하고/하거나, 슬라이싱하고/하거나, 두들김에 의해 기계적으로 균질하게 될 수 있다(예컨대, 블렌더, 비터, 및 믹서에 의해). 예를 들어, 본원에 기술된 태반 조직은 약 1, 3, 또는 5분 동안 블렌더에 의해 시중에서 입수가능한 블렌더의 최대 전단 속도 및 약 1,000, 5,000, 10,000, 또는 15,000rpm에서 기계적으로 변형될 수 있다. 추가의 구체예에서, 태반 조직 및/또는 탈세포화되거나 탈활력화된 태반 조직은 약 5초, 10초, 15초, 20초, 25초, 30초, 40초, 50초, 60초, 2분, 3분, 4분, 5분, 10분, 15분, 30분, 60분, 2시간, 5시간, 10시간, 24시간, 48시간 또는 72시간 또는 그 초과 동안 균질화된다. 추가의 구체예에서, 태반 조직 및/또는 탈세포화되거나 탈활력화된 태반 조직은 약 20초, 30초, 60초, 2분, 3분, 4분, 5분, 10분, 15분, 30분, 60분, 2시간, 5시간, 10시간, 24시간, 48시간 또는 72시간 또는 그 미만 동안 균질화된다. 추가의 구체예에서, 태반 조직 및/또는 탈세포화되거나 탈활력화된 태반 조직은 약 20초 내지 72시간, 약 1분 내지 20분, 약 1분 내지 10분, 또는 약 1분 내지 6분 동안 균질화된다.
일부 구체예에서, 분해 및/또는 균질화는 약 -200, -100, -80, -70, -60, -50, -40, -30, -20, -10, -5, 0, 5, 10, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36 또는 37℃; 약 -70, -60, -50, -40, -30, -20, -10, -5, 0, 5, 10, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 34, 35, 36, 37, 38 또는 39℃ 미만; 약 -80, -70, -60, -50, -40, -30, -20, -10, -5, 0, 5, 10, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 또는 37℃ 초과; 및/또는 약 -80 내지 약 37℃, -80 내지 약 25℃, -80 내지 약 38℃, -70 내지 약 38℃, 약 -50 내지 약 38℃, 약 -30 내지 약 38℃, 약 -10 내지 약 38℃, 약 0 내지 약 38℃, 약 5 내지 약 38℃, 약 10 내지 약 38℃, 약 15 내지 약 38℃, 약 -5 내지 약 10℃, 약 -5 내지 약 5℃, 또는 약 0 내지 약 10℃에서 수행될 수 있다. 추가의 구체예에서, 본원에 기술된 방법은 분해 및/또는 균질화 전에, 동안 및/또는 후에 태반 조직 또는 탈세포화되고/거나 탈활력화된 태반 조직을 약 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 35, 36, 37, 38, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 또는 200℃ 초과의 열로 처리하는 것을 배제할 수 있다. 일부 구체예에서, 방법은 분해 및/또는 균질화 전에, 동안 및/또는 후에 태반 조직 또는 탈세포화되고/거나 탈활력화된 태반 조직을 약 50, 70, 90, 110, 200, 또는 300℃ 미만의 열로 처리하는 것을 배제한다. 기타 구체예에서, 방법은 분해 및/또는 균질화 전에, 동안 및/또는 후에 태반 조직 또는 탈세포화되고/거나 탈활력화된 태반 조직을 약 26 내지 약 200℃, 약 30 내지 약 150℃, 약 39 내지 약 300℃, 약 40 내지 약 120℃, 약 50 내지 약 110℃, 및 약 50 내지 약 100℃, 약 50 내지 약 300℃의 열로 처리하는 것을 배제한다. 또 다른 양태에서, 상기 방법은 당해 분야에 공지된 다른 방법 중에서, 초음파분해, 마이크로파 조사, 또는 가열 구성요소로부터의 통상적인 열 전달을 배제할 수 있다.
또 다른 양태에서, 본원에 기재된 태반-유래 기질은 하이드로 겔의 형태로 존재할 수 있다. 본원에 사용된 용어 하이드로겔은 이의 기술의 이해되는 의미를 가지며, 물을 흡수하여 다양한 탄성의 겔을 형성할 수 있는 물-팽창성 폴리머 기질을 나타낸다. 용어 "기질"은 공유 및/또는 비-공유 가교에 의해 함께 고정된 거대분자의 3차원 네트워크를 지칭한다. 수성 환경에 배치시, 건조 하이드로겔이 가교도에 의해 허용되는 범위까지 팽창될 수 있다. 흡수된 물의 양은 사용된 거대분자 성분에 의해 조절될 수 있다. 일부 구체예에서, 본원에 기재된 태반-유래 기질은 열가역성 하이드로겔의 형태로 존재할 수 있다. 본원에 기술된 열가역성 하이드로겔은 온도에 따라 이의 상태를 변화시키는 온도-민감성 겔을 의미한다. 추가의 구체예에서, 열가역성 하이드로겔의 용액-내지-겔 전이 온도는 약 4℃ 내지 약 40℃, 약 10℃ 내지 약 40℃, 약 20℃ 내지 약 40℃, 약 30℃ 내지 약 40℃, 약 35℃ 내지 약 40℃, 약 36℃ 내지 약 38℃, 또는 약 20℃ 내지 약 38℃ 온도이다. 열가역성 하이드로겔의 용액-내지-겔 전이 온도는 약 5, 10, 20, 25, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 50, 60℃ 또는 그 미만일 수 있다. 열가역성 하이드로겔의 용액-내지-겔 전이 온도는 약 3, 5, 10, 20, 25, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 50, 60℃ 또는 그 초과일 수 있다. 추가의 구체예에서, 열가역성 하이드로겔의 겔-내지-용액 전이 온도는 약 -1℃ 내지 약 4℃, 약 0℃ 내지 약 10℃, 약 5℃ 내지 약 15℃, 약 4℃ 내지 약 40℃, 약 10℃ 내지 약 40℃, 약 20℃ 내지 약 40℃, 약 30℃ 내지 약 40℃, 또는 약 35℃ 내지 약 40℃의 온도이다. 열가역성 하이드로겔의 겔-내지-용액 전이 온도는 약 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45℃ 또는 그 미만의 온도일 수 있다. 열가역성 하이드로겔의 겔-내지-용액 전이 온도는 약 -1, 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 20, 25, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40℃ 또는 그 초과의 온도일 수 있다.
다른 양태에서, 본원에 기술된 방법은 (i) 태반 조직으로부터 자연 가교 이외에 추가적인 가교, (ii) 태반 조직으로부터의 자연 담체 이외의 추가적인 담체 및/또는 (iii) 광활성제를 탈세포화되거나 탈활력화된 태반 조직 및/또는 태반-유래 기질에 첨가하는 것을 포함하지 않는다. 또 다른 양태에서, 탈세포화되거나 탈활력화된 태반 조직 및/또는 태반-유래 기질은 하나 이상의 태반 조직(들)으로부터의 자연 담체(들) 및 자연 크로스링커(들) 이외에 추가적인 담체 또는 크로스링커를 포함할 수 있거나 없다. 그러나, 상기 방법은 태반 조직을 분해 및/또는 균질화시킨 후 하나 이상의 태반 조직(들)으로부터 자연 담체(들) 및 자연 크로스링커(들) 이외에 추가적인 크로스링커 또는 담체를 첨가할 수 있으며, 태반-유래 기질은 태반 조직(들)으로부터의 자연 담체(들) 및 자연 크로스링커(들) 이외에 하기 기술된 추가적인 담체 또는 크로스링커를 포함할 수 있다.
본원에 기술된 태반 조직은 태반 조직을 분해, 균질화, 수확, 분산, 동결 및/또는 동결-건조 전 또는 후에 태반 조직의 적어도 두 부분 사이에 물리적 및/또는 화학적 결합을 생성하도록 구성된 자연 발생적인 크로스링커를 포함할 수 있다. 화학 결합은 이온, 공유 및/또는 금속 결합을 포함할 수 있다. 예를 들어, 태반 조직의 자연 크로스링커는 태반 조직의 분해 및/또는 균질화 후에 화학적, 물리적 및/또는 온도 처리에 의해 물리적 및/또는 화학 결합을 형성하도록 가교될 수 있다. 일부 구체예에서, 본원에 기술된 방법은 비-자연 발생 크로스링커를 사용하여 비-자연 발생 결합에 의해 탈세포화되거나 탈활력화된 태반 조직 및/또는 태반-유래 기질을 가교시키는 것을 포함하지 않는다.
일부 구체예에서, 본원에 기술된 탈세포화되거나 탈활력화된 태반 조직 및/또는 태반-유래 기질은 본원에서 가교제로도 불리는, 비자연 발생 크로스링커를 배제할 수 있다. 추가의 구체예에서, 본원에 기술된 분해된 태반 조직은 비-자연 발생 크로스링커를 포함하지 않는다. 예를 들어, 본원에 기술된 탈세포화되거나 탈활력화된 태반 조직 및/또는 태반-유래 기질은 프로필렌 글리콜 알기네이트, 글리세롤, 수크로스 옥타설페이트, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리메틸메타크릴레이트, 폴리우레탄, 아크릴로일모르폴린, N,N-디메틸 아크릴아미드, N-비닐 피롤리돈 및 테트라하이드로푸르푸릴 메타크릴레이트, 하이드록시아파타이트, 폴리우레탄, 및 폴리락트산, 글루타르알데하이드, 글리세르알데하이드, 폴리(에틸렌 글리콜) 디에폭사이드 크로스링커, 폴리(에틸렌 글리콜) 디글리시딜 에테르, EDC 및 NHS, 트랜스글루타미나제, 에틸렌디아민, 리실 옥시다제 패밀리, 헥사메틸렌 디이소시아네이트(HMDIC), 디메틸 수베르이미데이트(DMS), 디메틸-3-3'-디티오비스프로피온이미데이트(DTBP), 및 아크릴 아지드, 및 이들의 조합물로 구성된 군으로부터 선택된 비-자연 발생 크로스링커를 배제할 수 있다. 추가 구체예에서, 본원에 기재된 태반-유래 기질은 크산텐 염료, 나프탈이미드 화합물, 리보플라빈-5-포스페이트, N-하이드록시피리딘-2-(1H)-티온, N-(20-에틸아미노에틸)-4-아미노-1,8-나프탈이미드, 비스-디아조피루바미드-N,N9-비스(3-디아조피루보일)-2,29-(에틸렌디옥시)비스-(에틸아민)(DPD), 디아조피루보일(DAP), 메틸렌 블루, 에리트로신, 플록심(phloxime), 티오닌, 메틸렌 그린, 로즈 벵갈, 아크리딘 오렌지, 크산틴 염료, 티오크산틴 염료, 에틸 에오신, 에오신 Y, 및 이들의 조합물로 구성된 군으로부터 선택된 광활성제를 배제할 수 있다.
또 다른 양태에서, 본원에 기재된 태반 조직은 또한 자연 담체를 포함할 수 있다. 본원에 기재된 담체는 상처, 결함, 및/또는 수술 부위에 주사되거나 이식되는 3차원 프레임워크를 형성하도록 구성된다. 일부 구체예에서, 상처는 개방 상처 또는 터널 상처일 수 있다. 자연 담체는 태반 조직에서 자연 발생하는 담체이고, 예를 들어, 콜라겐 및 히알루론산(hyuronic acid) 또는 엘라스틴과 같은 세포외 기질을 포함한다. 일부 구체예에서, 본원에 기재된 균질화되고/거나 분해된 태반 조직 및/또는 생물학적 기능성 스캐폴드는 젤라틴, 아가로스, 변형된 히알루론산, 프로필렌 글리콜 알기네이트, 폴리에틸렌 글리콜, 글리세롤, 폴리메틸메타크릴레이트, 폴리우레탄, 아크릴로일모르폴린, N,N-디메틸 아크릴아미드, N-비닐 피롤리돈 및 테트라하이드로푸르푸릴 메타크릴레이트, 하이드록시아파타이트, 가교된 또는 작용기화된 히알루로난-기반 콜라겐 및 알기네이트, 폴리우레탄, 및 폴리락트산, 및/또는 상기 폴리머 중 적어도 하나를 포함하는 조합물로 구성된 군으로부터 선택되는 비자연 발생 담체를 배제할 수 있다. 추가의 구체예에서, 본원에 기재된 분해된 태반 조직 및/또는 태반-유래 기질은 칼슘, 바륨, 알루미늄, 스트론튬, 구리, 아연, 마그네슘, 망간, 코발트, 또는 철의 염, 글루타르알데하이드, 글리세르알데하이드, 폴리(에틸렌 글리콜) 디에폭사이드 크로스링커, 폴리(에틸렌 글리콜) 디글리시딜 에테르, EDC 및 NHS, 트랜스글루타미나제, 에틸렌디아민, 리실 옥시다제 패밀리, 헥사메틸렌 디이소시아네이트(HMDIC); 디메틸 수베르이미데이트(DMS), 디메틸-3-3'-디티오비스프로피온이미데이트(DTBP), 아크릴 아지드, 및 이들의 조합물을 배제할 수 있다.
일부 구체예에서, 본원에 기술된 탈세포화되거나 탈활력화된 태반 조직 및/또는 태반-유래 기질은 태반 조직으로부터의 자연 담체(들) 이외에 추가적인 크로스링커를 포함하지 않는다. 추가의 구체예에서, 본원에 기술된 탈세포화되거나 탈활력화된 태반 조직 및/또는 태반-유래 기질은 태반 조직으로부터의 자연 담체(들) 이외에 추가적인 담체를 포함하지 않는다. 예를 들어, 본원에 기술된 탈세포화되거나 탈활력화된 태반 조직 및/또는 태반-유래 기질은 알기네이트, 프로필렌 글리콜 알기네이트, 자연 또는 가교된 키토산, 전분, 폴리에틸렌 글리콜, 셀룰로스 및 이의 유도체(예컨대, 셀룰로스 아세테이트, 카르복시메틸 셀룰로스, 및 메틸 셀룰로스), 크산탄 검, 덱스트란, 히알루론산, 콘드로이틴 설페이트, 로커스트 빈 검, 트래거칸트 검, 아라비아 검, 커들란, 풀루란, 스클레로글루칸, 저급 메톡실펙틴, 또는 카라기난을 포함하지 않을 수 있다.
탈세포화되거나 탈활력화된 태반 조직 및/또는 태반-유래 기질은 담체 용액을 포함할 수 있거나 없다. 담체 용액은 칼슘, 바륨, 알루미늄, 스트론튬, 구리, 아연, 마그네슘, 망간, 코발트, 또는 철의 염; 글루타르알데하이드, 글리세르알데하이드, 게니핀, 글루코스 또는 리보스, 폴리(에틸렌 글리콜) 디에폭사이드 크로스링커, 폴리(에틸렌 글리콜) 디글리시딜 에테르, EDC 및 NHS, 트랜스글루타미나제, 에틸렌디아민, 리실 옥시다제 패밀리, 헥사메틸렌 디이소시아네이트(HMDIC); 디메틸 수베르이미데이트(DMS), 디메틸-3-3'-디티오비스프로피온이미데이트(DTBP), 또는 아크릴 아지드를 포함할 수 있다. 담체 용액은 또한, 태반 조직으로부터의 자연 담체(들) 외에 자연 또는 변형된 콜라겐, 젤라틴, 아가로스, 변형된 히알루론산, 피브린, 키틴, 비오틴, 아비딘, MATRIGEL®, 프로테오글리칸, 라미닌, 피브로넥틴, 엘라스틴, 헤파린, 글리세롤, 폴리메틸메타크릴레이트, 폴리우레탄, 아크릴로일모르폴린, N,N-디메틸 아크릴아미드, N-비닐 피롤리돈 및 테트라하이드로푸르푸릴 메타크릴레이트, 하이드록시아파타이트, 히알루로난-기반 콜라겐 및 알기네이트의 가교결합 또는 작용기(cross-linkage or functionalization), 폴리우레탄, 폴리락트산, 또는 상기 폴리머 중 적어도 하나를 포함하는 조합물을 포함하는 군으로부터 선택된 자연 및/또는 합성 폴리머를 포함할 수 있다. 추가 구체예에서, 예를 들어, 본원에 기재된 탈세포화되거나 탈활력화된 태반 조직 및/또는 태반-유래 기질은 태반 조직으로부터의 자연 담체(들) 외에 임의의 담체를 포함하거나 포함하지 않을 수 있고, 담체는 자연 콜라겐, 히알루론산, 피브린, 키틴, 비오틴, 아비딘, MATRIGEL®, 프로테오글리칸, 라미닌, 피브로넥틴, 엘라스틴, 헤파린, 알기네이트, 게니핀, 키토산, 전분, 글루코스 또는 리보스, 셀룰로스 및 이의 유도체(예컨대, 셀룰로스 아세테이트, 카르복시메틸 셀룰로스, 및 메틸 셀룰로스), 크산탄 검, 덱스트란, 히알루론산, 콘드로이틴 설페이트, 로커스트 빈 검, 트래거칸트 검, 아라비아 검, 커들란, 풀루란, 스클레로글루칸, 저급 메톡실 펙틴, 카라기난, 및 이들의 조합물로 구성된 군으로부터 선택된다. 또한, 추가 구체예에서, 본원에 기재된 탈세포화되거나 탈활력화된 태반 조직 및/또는 태반-유래 기질은 태반 조직으로부터의 자연 크로스링커(들) 외에 크로스링커를 포함하거나 포함하지 않을 수 있고, 이때 크로스링커는 알기네이트, 전분, 셀룰로스 및 이의 유도체(예컨대, 셀룰로스 아세테이트, 카르복시메틸 셀룰로스, 및 메틸 셀룰로스), 크산탄 검, 덱스트란, 카라기난, 게니핀, 히알루론산, 콘드로이틴 설페이트, 로커스트 빈 검, 트래거칸트 검, 아라비아 검, 커들란, 풀루란, 스클레로글루칸, 및 저급 메톡실펙틴, 글루코스 또는 리보스, 자연 콜라겐, 히알루론산, 피브린, 키틴, 비오틴, 아비딘, MATRIGEL®, 프로테오글리칸, 라미닌, 피브로넥틴, 엘라스틴, 헤파린, 키토산, 및 이들의 조합물로 구성된 군으로부터 선택된다.
또 다른 양태에서, 본원에 기재된 태반-유래 기질은 탈세포화되거나 탈활력화된 태반 조직 및 분해 용액으로 필수적으로 포함하여 구성되고/거나 이로 구성된다. 용어 "~을 필수적으로 포함하여 구성되는"은 기질의 범위가 초기 요소들로 구성되는 기질의 겔화 및/또는 단백질 조성물에 실질적으로 영향을 미치지 않는 추가의 요소를 포함하는 것으로 정의된다. 예를 들어, 탈세포화되거나 탈활력화된 태반 조직 및 분해 용액을 필수적으로 포함하여 구성되는 태반-유래 기질은 탈세포화되거나 탈활력화된 태반 조직 및 분해 용액으로 구성되는 태반-유래 기질의 겔화 및/또는 단백질 조성물에 실질적으로 영향을 미치지 않는, 탈세포화되거나 탈활력화된 태반 조직 및 분해 용액 이외의 요소를 포함할 수 있다. 본원에서 단백질 조성물에 실질적으로 영향을 미치는 것은 단백질 조성을 적어도 약 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 7, 9, 10, 12, 15, 20, 25, 30, 또는 40% 만큼 변화시킨다는 것을 의미한다. 본원에서 기질의 겔화에 실질적으로 영향을 미치는 것은 기질의 점도를 적어도 약 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 7, 9, 10, 12, 15, 20, 25, 30, 또는 40% 만큼 변화시킨다는 것을 의미한다.
또 다른 양태에서, 본원에 기재된 방법은 상기 태반-유래 기질을 동결 또는 동결-건조시켜 동결된 또는 동결-건조된 태반-유래 기질을 생성하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 태반-유래 기질은 동결-건조된 단편이 약 10, 5, 4, 3, 2, 1, 0.5, 또는 0.1 wt% 미만의 평균 잔여 수분을 지니게 하는 지점까지 동결-건조될 수 있다.
또 다른 양태에서, 본원에 기술된 방법은 소정의 형상을 갖는 주형에서 태반-유래 기질을 위치시키는 것을 추가로 포함할 수 있으며, 이때 태반-유래 기질은 주형에서 동결 또는 동결-건조된다. 또 다른 양태에서, 본원에 기술된 방법은 이식 전 태반-유래 기질을 저장하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 태반-유래 기질은 건조 상태, 동결 상태, 냉동보존, 또는 습식 상태에 저장된다. 추가의 구체예에서, 본원에 기술된 방법은 예를 들어, 태반-유래 기질의 스폰지 구조 및 나노-대-마이크로 섬유를 포함하는 태반-유래 기질을 물-대체제로 처리하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 추가의 구체예에서, 태반-유래 기질은 습식 상태로 저장될 수 있다.
또 다른 양태에서, 본원에 기재된 바와 같이 상기 태반-유래 기질을 동결 또는 동결-건조시키는 것을 포함하는 방법은 스폰지 구조를 생성한다. 일부 구체예에서, 동결 및/또는 동결-건조된 태반-유래 기질은 평균 약 1, 5, 10, 100, 200, 300, 400, 500, 700, 1000, 1500, 2000, 3000, 또는 4000μm 또는 그 초과의 평균 직경을 지니는 기공을 포함한다. 추가의 구체예에서, 동결 및/또는 동결-건조된 태반-유래 기질은 평균 약 2, 6, 20, 100, 200, 300, 400, 500, 700, 900, 1000, 1300, 1500, 2000, 3000, 또는 4000μm 또는 그 미만의 평균 직경을 지니는 기공을 포함한다. 추가의 구체예에서, 동결 및/또는 동결-건조된 태반-유래 기질은 평균적으로 약 1μm 내지 4000μm, 100μm 내지 1000μm, 약 50μm 내지 2000μm, 약 100μm 내지 500μm의 평균 직경을 지니는 기공을 포함한다.
또 다른 양태에서, 본원에 기재된 방법은 각각 전체가 본원에 참조로 포함되는 미국 특허 제6,293,970호, 제6,569,200호, 제6,544,289호, 제7,063,726호, 또는 미국 특허 출원 공개 제2010/0030340호, 제2014/0180437호, 제2011/0015757호, 및 제2013/0218294호에 기재된 바와 같이, 예를 들어, 태반-유래 기질의 스폰지 구조 및 나노-내지-마이크로 섬유를 포함하는 태반-유래 기질을 가소화시킴을 추가로 포함할 수 있다. 추가적인 구체예에서, 방법은 동결 또는 동결-건조된 태반-유래 기질을 물 대체제로 처리하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 물 대체제로 처리된 동결 또는 동결-건조된 태반-유래 기질은 습윤 상태로 저장될 수 있다. 또 다른 추가의 구체예에서, 물 대체제는 글리세롤(글리세린 USP), 아도니톨, 소르비톨, 리비톨, 갈락티톨, D-갈락토스, 1,3-디하이드록시프로판올, 에틸렌 글리콜, 트리에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, 글루코스, 수크로스, 만니톨, 자일리톨, 메소-에리트리톨, 아디프산, 프롤린, 하이드록시프롤린, 폴리에틸렌 글리콜, 알코올, 및 지질로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함한다.
일부 구체예에서, 동결 및/또는 동결-건조된 태반-유래 기질의 평균 공극 부피는 약 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95, 96, 97, 98, 99% 또는 그 초과이다. 추가적인 구체예에서, 동결 및/또는 동결-건조된 태반-유래 기질의 평균 공극 부피는 약 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95, 96, 97, 98, 99% 또는 그 미만이다. 추가의 구체예에서, 동결 또는 동결-건조된 태반-유래 기질의 평균 공극 부피는 약 10% 내지 약 95%, 약 30% 내지 95%, 약 40% 내지 약 90%, 약 50% 내지 90%, 약 60% 내지 약 90%, 또는 약 20% 내지 60%이다.
또 다른 양태에서, 본원에 기술된 제조 방법은 상기 태반-유래 기질을 선택적으로 동결 또는 동결-건조시켜 스폰지 구조를 생성시키고; 본원에 기술된 태반-유래 기질 또는 스폰지 구조를 용매에 용해시켜 태반-유래 용액을 생성시키고; 태반-유래 용액을 전기방사하여 나노-내지-마이크로 섬유를 생성시키는 것을 포함할 수 있다. 예를 들어, 태반-유래 용액은 미국 특허 출원 공개 2010/0120115 및 2015/0010607호 및 WO/2014/160002에 기술된 바와 같은 나노섬유를 생성하도록 전기방사될 수 있으며, 상기 각각은 그 전체가 본원에 참조로 통합된다.
일부 구체예에서, 본원에 기술된 태반-유래 기질로부터 나노-내지-마이크로 섬유는 공중합체 또는 자가-어셈블리의 존재 또는 부재하에 예를 들어, 전기방사에 의해서뿐만 아니라 멜트블로운(meltblowing), 이성분 방사(bicomponent spinning), 포스방사(forcepinning), 섬광-방사(flash-spinning), 압출, 코어-시스 전기방사에 의해 제조될 수 있다.
태반-유래 기질 스캐폴드에서 나노-내지-마이크로 섬유의 정렬은 고속 푸리에 변환(fast Fourier transform: FFT) 분석에 의해 측정될 수 있다. 예를 들어, FFT 분석은 문헌 [Measuring fiber alignment in electrospun scaffolds: a user's guide to the 2D fast Fourier transform approach, Ayres CE, Jha BS, Meredith H, Bowman JR, Bowlin GL, Henderson SC, Simpson DG. J Biomater Sci Polym Ed. 2008; 19(5):603-21]에 기술된 방법에 의해 수행될 수 있으며, 이는 그 전체가 참조로 통합된다. 일부 구체예에서, 본원에 기술된 태반-유래 기질로부터 나노-내지-마이크로 섬유의 FFT 결과는 서로 약 180° 떨어진 인접한 주요 피크를 가질 수 있다.
일부 구체예에서, 본원에 기술된 나노섬유는 약 1000nm 또는 그 미만, 900nm 또는 그 미만, 800nm 또는 그 미만, 700nm 또는 그 미만, 600nm 또는 그 미만, 500nm 또는 그 미만, 400nm 또는 그 미만, 300nm 또는 그 미만, 200nm 또는 그 미만, 100nm 또는 그 미만, 50nm 또는 그 미만, 20nm 또는 그 미만, 또는 10nm 또는 그 미만의 평균 직경을 가질 수 있다. 추가의 구체예에서, 본원에 기술된 태반-유래 기질 스캐폴드 중의 총 나노섬유는 약 1000nm 또는 그 미만, 900nm 또는 그 미만, 800nm 또는 그 미만, 700nm 또는 그 미만, 600nm 또는 그 미만, 500nm 또는 그 미만, 400nm 또는 그 미만, 300nm 또는 그 미만, 200nm 또는 그 미만, 100nm 또는 그 미만, 50nm 또는 그 미만, 20nm 또는 그 미만, 또는 10nm 또는 그 미만의 평균 직경을 가질 수 있다. 일부 구체예에서, 본원에 기술된 마이크로섬유는 약 100미크론 또는 그 미만, 90미크론 또는 그 미만, 80미크론 또는 그 미만, 70미크론 또는 그 미만, 60미크론 또는 그 미만, 50미크론 또는 그 미만, 40미크론 또는 그 미만, 30미크론 또는 그 미만, 20미크론 또는 그 미만, 10미크론 또는 그 미만, 5미크론 또는 그 미만, 2미크론 또는 그 미만, 또는 1미크론 또는 그 미만의 평균 직경을 가질 수 있다. 추가의 구체예에서, 본원에 기술된 태반-유래 기질 스캐폴드 중의 총 마이크로섬유는 약 100미크론 또는 그 미만, 90미크론 또는 그 미만, 80미크론 또는 그 미만, 70미크론 또는 그 미만, 60미크론 또는 그 미만, 50미크론 또는 그 미만, 40미크론 또는 그 미만, 30미크론 또는 그 미만, 20미크론 또는 그 미만, 10미크론 또는 그 미만, 5미크론 또는 그 미만, 2미크론 또는 그 미만, 또는 1미크론 또는 그 미만의 평균 직경을 가질 수 있다. 추가의 구체예에서, 본원에 기술된 나노-내지-마이크로 섬유는 약 5nm, 10nm, 25nm, 50nm, 100nm, 250nm, 500nm, 1미크론, 5미크론, 20미크론, 50미크론, 75미크론 또는 그 미만의 평균 직경을 가질 수 있다.
한 양태에서, 본원에 기술된 태반-유래 기질 나노섬유는 약 0.1cm 내지 약 10cm, 약 1cm 내지 약 10cm, 약 0.1cm 내지 약 20cm, 약 1cm 내지 약 20cm, 약 10cm 내지 약 20cm, 약 0.1cm 내지 약 30cm, 약 1cm 내지 약 30cm, 약 10cm 내지 약 30cm, 약 20cm 내지 약 30cm, 약 0.1cm 내지 약 40cm, 약 1cm 내지 약 40cm, 약 10cm 내지 약 40cm, 약 20cm 내지 약 40cm, 약 30cm 내지 약 40cm, 약 0.1cm 내지 약 50cm, 약 1cm 내지 약 50cm, 약 10cm 내지 약 50cm, 약 20cm 내지 약 50cm, 약 30cm 내지 약 50cm, 약 40cm 내지 약 50cm, 0.1cm 내지 약 60cm, 약 1cm 내지 약 60cm, 약 10cm 내지 약 60cm, 약 20cm 내지 약 60cm, 약 30cm 내지 약 60cm, 또는 약 40cm 내지 약 60cm의 길이를 가질 수 있다. 또 다른 양태에서, 본원에 기술된 태반-유래 기질 스캐폴드 중 총 나노섬유는 약 0.1cm 내지 약 10cm, 약 1cm 내지 약 10cm, 약 0.1cm 내지 약 20cm, 약 1cm 내지 약 20cm, 약 10cm 내지 약 20cm, 약 0.1cm 내지 약 30cm, 약 1cm 내지 약 30cm, 약 10cm 내지 약 30cm, 약 20cm 내지 약 30cm, 약 0.1cm 내지 약 40cm, 약 1cm 내지 약 40cm, 약 10cm 내지 약 40cm, 약 20cm 내지 약 40cm, 약 30cm 내지 약 40cm, 약 0.1cm 내지 약 50cm, 약 1cm 내지 약 50cm, 약 10cm 내지 약 50cm, 약 20cm 내지 약 50cm, 약 30cm 내지 약 50cm, 약 40cm 내지 약 50cm, 0.1cm 내지 약 60cm, 약 1cm 내지 약 60cm, 약 10cm 내지 약 60cm, 약 20cm 내지 약 60cm, 약 30cm 내지 약 60cm, 또는 약 40cm 내지 약 60cm의 평균 길이를 가질 수 있다.
일부 구체예에서, 상기 탈세포화되거나 탈활력화된 태반 조직 중 상기 태반 조직의 중량 백분율은 건조 상태에서 약 2, 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 92, 94, 96, 98, 100% 또는 그 초과이다. 추가의 구체예에서, 상기 탈세포화되거나 탈활력화된 태반 조직 중의 상기 태반 조직의 중량 백분율은 건조 상태에서 약 3, 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 91, 93, 95, 97, 99, 100% 또는 그 미만이다. 추가의 구체예에서, 상기 탈세포화되거나 탈활력화된 태반 조직 중 상기 태반 조직의 중량 백분율은 건조 상태에서 약 2% 내지 약 100%, 약 50% 내지 약 90%, 약 50% 내지 약 80%, 60% 내지 100%, 80% 내지 약 100%, 또는 약 90% 내지 약 100%이다.
일부 구체예에서, 태반-유래 기질 중 상기 탈세포화되거나 탈활력화된 태반 조직의 중량 백분율은 건조 상태에서 약 50, 60, 70, 80, 90, 5, 98, 99% 또는 그 초과이다. 추가의 구체예에서, 태반-유래 기질 중 상기 탈세포화되거나 탈활력화된 태반 조직의 중량 백분율은 건조 상태에서 약 50, 60, 70, 80, 90, 100% 또는 그 미만이다. 추가의 구체예에서, 태반-유래 기질 중 상기 탈세포화되거나 탈활력화된 태반 조직의 중량 백분율은 건조 상태에서 약 50% 내지 약 100%, 약 70% 내지 약 100%, 약 80% 내지 약 100%, 또는 약 90% 내지 약 100%이다. 태반-유래 기질 중 상기 탈세포화되거나 탈활력화된 태반 조직의 양은 태반-유래 기질의 밀도, 농도, 다공성, 및/또는 점도 특징은 물론 다공성 구조의 재수화 특징을 조절하기 위해 변화될 수 있다.
또 다른 양태에서, 본원에 기재된 방법은 태반 조직, 탈세포화되고/거나 탈활력화된 태반 조직, 및/또는 태반-유래 기질을 하나 이상의 처리 용액으로 처리하는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 본원에 기재된 방법은 탈세포화되고/거나 탈활력화된 태반 조직, 및/또는 태반-유래 기질을 이식 전에 동결 및/또는 동결 건조 후 하나 이상의 처리 용액으로 처리하는 것을 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 처리 용액은 이온성, 효소적, 또는 화학적 가교제, 광활성제, 또는 폴리머를 포함한다. 이온성 가교제는 칼슘, 바륨, 알루미늄, 스트론튬, 구리, 아연, 마그네슘, 망간, 코발트, 및 철로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함할 수 있다. 효소적 가교제는 트랜스글루타미나제, 에틸렌디아민, 리실 옥시다아제 패밀리, 헥사메틸렌 디이소시아네이트(HMDIC), 디메틸 수베르이미데이트(DMS), 및 디메틸-3-3'-디티오비스프로피온이미데이트(DTBP)로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함할 수 있다. 화학적 가교제는 글루타르알데하이드, 글리세르알데하이드, 게니핀, 글루코스 또는 리보스, 폴리(에틸렌 글리콜) 디에폭사이드 크로스링커, 폴리(에틸렌 글리콜) 디글리시딜 에테르, EDC 및 NHS, 및 아크릴 아지드로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함한다. 폴리머는 자연 또는 변형된 콜라겐, 젤라틴, 아가로스, 변형된 히알루론산, 피브린, 키틴, 비오틴, 아비딘, 탈광물화된 골 기질, MATRIGEL®, 프로테오글리칸, 라미닌, 피브로넥틴, 엘라스틴, 헤파린, 글리세롤, 수크로스 옥타설페이트, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리메틸메타크릴레이트, 폴리우레탄, 아크릴로일모르폴린, N,N-디메틸 아크릴아미드, N-비닐 피롤리돈 및 테트라하이드로푸르푸릴 메타크릴레이트, 하이드록시아파타이트, 폴리우레탄, 및 폴리락트산으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함할 수 있다.
또 다른 양태에서, 본원에 기재된 방법은 또한 태반 조직, 탈세포화되고/거나 탈활력화된 태반 조직, 및/또는 태반-유래 기질에 하나 이상의 생리활성 보충제(들)를 첨가하는 것을 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 하나 이상의 생리활성 보충제(들)는 FGF 패밀리, TGF-패밀리, IGF-1, PDGF, EGF, VEGF, HGF, PTHrP, Ihh, 덱사메타손, 인슐린, 트랜스페린, 셀레늄, ITS, 또는 아스코르베이트의 성장 또는 분화 인자로 구성된 군으로부터 선택된다. 생리활성 보충제는 성장 인자, 분화 인자, 사이토킨, 항-미생물제, 또는 항염증제일 수 있다. 성장 또는 분화 인자는, 예를 들어, FGF-패밀리 또는 TGF-패밀리, IGF-1, PDGF, EGF, VEGF, HGF, PTHrP, Ihh(Indian Hedgehog Homolog), 덱사메타손, 인슐린, 트랜스페린, 셀레늄, ITS 보충물, 아스코르베이트의 성장 인자, 또는 이들의 조합물일 수 있다. 사이토킨은 GM-CSF, G-CSF, TNF-α, IL-1β, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, SLP1, MCP1, MIP-1α, MIP-2, IL-18, 안지오포이에틴, KGF, 엔도텔린, IFN-α, 또는 IFN-β를 포함할 수 있다. 항염증제의 예는 IL-1βR 항체, TNF-α 수용체 길항제, 사이클로옥시게나제-2 특이적 억제제, MAP 키나제 억제제, NO 신타아제 억제제, NF-κB 억제제, 또는 MMP의 억제제를 포함할 수 있다. 다양한 섬유모세포 성장 인자가 존재한다. 예로서, 인간 FGF-패밀리는 FGF-1 내지 FGF-23의 22개의 구성원을 포함한다(FGF-15는 인간 FGF-19의 마우스 오솔로그이기 때문에 인간 FGF-15는 없다). TGF-패밀리의 구성원의 예는 TGF-α 및 TGF-β 수퍼패밀리를 포함할 수 있다. TGF-β 수퍼패밀리는 TGF-β (예컨대, TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3), 액티빈, 인히빈, 골 형태발생 인자(bone morphogenic factor: BMP), 변형된 BMP, 항-뮬러리안 호르몬(AMH), 마이오스타틴 등을 포함한다. BMP의 20개 아이소타입이 존재한다. 이들은, 예를 들어, (1) BMP2 및 BMP4; (2) BMP3 및 BMP3B (성장/분화 인자 10 (GDF10)으로도 알려짐); (3) BMP 5, 6, 7 및 8; 및 (4) GDF 5, 6, 및 7의 4개의 서브패밀리로 분류될 수 있다. 추가적인 구체예에서, 본원에 기재된 방법은 또한 탈광물화된 골 기질, 기저막, 또는 점막하 기질을 포함하는 조직으로부터 추출된 하나 이상의 생리활성 보충제(들)를 첨가하는 것을 포함할 수 있다. 추가의 구체예에서, 본원에 기재된 방법은 또한 산소-라디칼-유발 손상 항산화제로부터 생리활성 성분을 보호하기 위해 예를 들어 소듐 니트로프루시드, 연골 기질 글리코단백질(CMGP), 비타민 C, 비타민 E, 셀레늄, N-아세틸시스테인(NAC) 에스트라디올, 글루타티온, 멜라토닌, 레스베라트롤, 플라보노이드, 카로텐, 아미노글루아니딘, 또는 리코펜을 포함하는 하나 이상의 항산화제를 첨가함을 포함할 수 있다.
또 다른 양태에서, 본원에 기재된 방법은 또한 태반 조직, 탈세포화되고/거나 탈활력화된 태반 조직, 및/또는 태반-유래 기질에 생리활성 보충제 결합 부위(들)를 지니는 하나 이상의 제제(들)를 첨가하는 것을 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 생리활성 보충제 결합 부위(들)를 지니는 제제는 히알루로난, 헤파린, 헤파린 설페이트, 케라틴 설페이트, 데르마탄 설페이트, 콘드로이틴 설페이트, 베타글리칸, 헤파란 설페이트 프로테오글리칸, 신데칸, 바이글리칸, 또는 데코린을 포함할 수 있다. 추가적인 구체예에서, 생리활성 보충제 결합 부위(들)를 지니는 제제(들)는 태반 조직, 탈세포화되고/거나 탈활력화된 태반 조직, 및/또는 태반-유래 기질에 대한 성장 인자, 분화 인자, 사이토킨, 항-미생물제, 또는 항염증제의 친화성을 증가시킨다.
또 다른 양태에서, 본원에 기재된 방법은 또한 분해 및/또는 균질화 전에 태반 조직, 및/또는 탈세포화되고/거나 탈활력화된 태반 조직을 평균적으로 약 0.5, 1, 5, 10, 20, 50, 100, 200, 500mm 또는 그 초과의 치수를 지니도록 절단하는 것을 포함할 수 있다. 추가의 구체예에서, 본원에 기재된 방법은 또한 태반 조직, 및/또는 탈세포화되고/거나 탈활력화된 태반 조직을 평균적으로 약 1, 5, 10, 20, 50, 100, 200, 550mm 또는 그 미만의 치수를 지니도록 절단하는 것을 포함할 수 있다. 추가의 구체예에서, 본원에 기재된 방법은 또한 태반 조직, 및/또는 탈세포화되고/거나 탈활력화된 태반 조직을 평균적으로 약 1mm 내지 약 60cm, 약 1mm 내지 약 50cm, 약 1cm 내지 약 60cm, 약 1cm 내지 약 50cm, 또는 약 1cm 내지 약 10cm의 치수를 지니도록 절단하는 것을 포함할 수 있다.
또 다른 양태에서, 본원에서 기술되는 방법은 태반 조직, 탈세포화되고/거나 탈활력화된 태반 조직을 세정하고 소독하는 것을 포함할 수 있다. 또 다른 양태에서, 본원에서 기술되는 방법은 또한 태반 조직, 탈세포화되고/거나 탈활력화된 태반 조직을 세정하고 소독하고, 태반 조직과 관련된 외래 조직을 제거하는 것을 포함할 수 있다. 태반 조직은 예를 들어, 작은 조각으로 절단되어 대충 단편화된 태반 조직을 생성하고, 임의로, 증류된/탈이온화된 내독소-비함유 물 및/또는 수용액, 예컨대, 특히 등장성 염수로 분쇄되고 세척될 수 있다. 처리시, 다수회의 "세척" 또는 "세정"은 일부 구체예에서, 처리되는 조직의 근사된 부피의 2, 5, 또는 10배인 수용액 부피를 사용하여 영향을 받을 수 있다. 이러한 세 처리 단계의 사용은 관련된 가용화 요소의 대략 1:100, 1:500 또는 1:1000 희석에 작용할 수 있어 조직에 그러한 가용화 요소가 실질적으로 존재하지 않게 한다 (예를 들어, 약 10, 0.1, 0.01 또는 0.001 wt% 미만). 탈세포화되거나 탈활력화된 태반 조직 조각은 특정 구체예에서 약 30, 20, 15, 10, 8, 5, 3, 2, 1, 0.5, 0.1, 0.05mm 또는 그 미만의 두께를 가질 수 있다. 탈세포화되거나 탈활력화된 태반 조직 조각은 또한, 약 30, 20, 10, 8, 5, 3, 2, 1, 0.5, 0.1, 0.05mm 또는 그 이상의 두께를 가질 수 있다. 또 다른 양태에서, 본원에서 기술되는 방법은 또한 태반 조직, 탈세포화되고/거나 탈활력화된 태반 조직 및/또는 태반 유래 기질을 멸균시키는 것을 포함할 수 있다. 멸균은 일부 구체예에서 이온화 방사선의 사용을 포함할 수 있다. 그 밖의 구체예에서, 이온화 방사선의 흡수 선량은 약 1.0KGy 내지 약 50KGy, 약 8.0KGy 내지 약 50KGy, 약 8.0KGy 내지 약 25KGy, 또는 약 8.0KGy 내지 약 18KGy 일 수 있다. 일부 구체예에서, 멸균 단계는 태반 유래 기질을 포함하는 패키징된 조직 수복 임플란트를 드라이 아이스 상에 배치하고, 패키징된 조성물을 조사하는 것을 포함할 수 있다. 특정 구체예에서, 멸균은 약 -20℃ 내지 -50℃의 온도에서 수행될 수 있다. 본 발명의 임플란트는 감마 조사, 초임계 이산화탄소, 에틸렌 옥사이드 또는 전자 빔을 사용하여 멸균될 수 있다.
또 다른 양태에서, 본원에서 기술된 방법은 하나 이상의 골 단편 물질(들)을 태반-유래 기질에 첨가하는 것을 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 골 단편 물질(들)은 골, 피질골, 해면골, 피질 해면골, 세라믹, 하이드록시아파타이트, 칼슘 포스페이트, 칼슘 설페이트, 및 칼슘 카보네이트로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함할 수 있다. 골은 탈광물화된 골(demineralized bone) 또는 비탈광물화된 골(non-demineralized bone)일 수 있다. 본원에서 사용되는 "탈광물화된 골 기질(demineralized bone matrix)(DBM)"은 약 8 wt% 미만의 잔류 칼슘을 갖는 골을 나타낸다. 탈광물화(demineralization)는 골 조직의 무기 미네랄 하이드록시아파타이트 물질을 제거하기 위해 골 조직을 처리하는 것을 포함한다. 골 조직의 탈광물화 수준은 탈광물화된 골에서 발견되는 잔류 칼슘의 양(wt%)에 의해 규정된다. 일부 구체예에서, 탈광물화된 골은 여전히 탈광물화 처리 후에도 초기 골로부터 잔류하는 생리학적 활성 수준의 성장 및 분화 인자(예를 들어, 골형성 성장 인자, 예컨대 골 형태형성 단백질(bone morphogenetic protein)(BMP))를 함유할 수 있다. 추가의 구체예에서, 탈광물화된 골은 콜라겐, 글리코사미노글리칸, 오스테오칼신(osteocalcin), 오스테오넥틴(osteonectin), 골 시알로 단백질(bone sialo protein), 오스테오폰틴(osteopontin) 및 이들의 혼합물을 함유할 수 있다. 본 출원에서 사용되는 "비탈광물화된 골"은 존재하는 미네랄, 예컨대, 이를 테면 하이드록시아파타이트를 제거하기 위해 처리되지 않은 골을 나타낸다. 본 발명의 특정 생물학적 기능성 스캐폴드 및/또는 임플란트는 탈광물화된 골 입자 또는 섬유를 포함할 수 있다. 탈광물화된 골 기질은 동결 건조되거나 동결 건조되지 않고, 골 입자 또는 섬유로 분쇄/파쇄/밀링된 세정되고 소독된 골로부터 제조될 수 있다. 골 입자는 예를 들어, 요망하는 크기 범위 내의 입자를 얻기 위해 상업적으로 입수가능한 체질 디바이스(sieving device)(즉, 메쉬 체(mesh sieves))를 사용함으로써 선택될 수 있다. 이러한 탈광물화된 골 입자는 약 125미크론 내지 약 4mm; 약 710미크론 내지 약 2mm; 약 125미크론 내지 약 500미크론; 약 125미크론 내지 약 850미크론; 약 125미크론 내지 약 710미크론; 약 250 내지 1000미크론; 또는 약 250미크론 내지 약 710미크론의 평균 직경을 가질 수 있다. 본 발명의 특정 구체예는 상업적으로 입수가능한 탈광물화된 골 입자를 포함할 수 있다. 예를 들어, 광범위하고 신뢰성있게 이용가능한 적합한 탈광물화된 골 입자는 LifeNet Health(Virginia Beach, Virginia)에 의해 생산된다. 본 발명의 일부 생물학적 기능성 스캐폴드 및/또는 임플란트는 탈광물화된 골 섬유를 포함할 수 있다. 특정 구체예에서, 탈광물화된 골 섬유는 약 0.1mm 내지 약 0.3mm의 평균 두께 및 약 0.3mm 내지 약 1.0mm의 평균 폭을 가질 수 있다. 섬유의 길이는 다양할 수 있다. 일부 구체예에서, 탈광물화 과정은 약 1mm 내지 약 2mm의 평균 직경 크기 범위를 갖는 골 입자 또는 0.1mm 내지 0.3mm 두께의 평균 치수 및 약 0.3mm 내지 약 1mm의 평균 폭을 갖는 골 섬유를 생성함으로써 시작된다. 단편은 세정 용액으로 처리될 수 있다. 단편으로 처리되어야 하는 골이 미리 세정되고/거나 소독되지 않는 경우, 이들은 골수 및 세포 요소와 같은 관련 조직의 제거에 영향을 미치는, 세정제, 과산화수소, 항생제, 산 및/또는 알코올을 사용함으로써 세정되고/거나 소독될 수 있다. 세정 및 소독 후, 이들 단편(즉, 입자 및 섬유)은, 골 단편(즉, 입자 및 섬유)의 미네랄 성분의 제거/감소에 영향을 미치는 묽은 염산에 노출시킴으로써 탈광물화될 수 있다. 이러한 추가 처리는 일부 경우에, 잠재적 바이러스 오염(즉, 특히, HIV 및 간염 바이러스)을 불활성화시킬 수 있다.
또 다른 양태에서, 본원에서 기술되는 방법은 다공성을 증가시키기 위해 동결, 또는 동결-건조되기 전에 음정수압 하에서 태반-유래 기질 및/또는 태반-유래 기질을 포함하는 스캐폴드를 처리하는 것을 포함하거나 포함하지 않을 수 있다. 본 발명에서 3차원(3-D) 거대-다공성 구조는 세포들이 기능하는 조직으로 조직화될 때까지 세포에 대한 지지체를 제공하도록 설계된다. 이식 후, 거대-다공성 구조의 구성은 혈관형성 및 조직 내부성장에 대한 정도를 조절할 수 있다. 기공 크기 및 부피는 태반-유래 기질의 동결-건조 전 또는 후 포로젠(porogen) 첨가, 불활성 가스 적용, 또는 음정수압 적용에 의해 조절될 수 있다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 탈세포화되거나 탈활력화된 태반 조직을 포함하는 태반-유래 기질에 관한 것이다. 태반-유래 기질의 pH는 약 8.0 또는 그 초과, 예를 들어, 8.0-9.0, 바람직하게는, 8.0-8.5, 더욱 바람직하게는, 8.0-8.2의 범위일 수 있다. 예를 들어, 기질의 pH는 적어도 약 8.0, 8.1, 8.2, 8.3, 8.4, 8.5, 8.6, 8.7, 8.8, 8.9 또는 9.0, 바람직하게는, 적어도 약 8.0이다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 또한 본원에 기술된 방법에 의해 제조된 태반-유래 기질에 관한 것이다. 또 다른 양태에서, 본 발명은 본원에 기술된 태반-유래 기질을 포함하는 스캐폴드에 관한 것이다. 스캐폴드는 임플란트를 포함할 수 있으며, 이는 생체내에서 이식되도록 구성된 스캐폴드이다. 본원에 기술된 스캐폴드는 다공성 스폰지형 구조를 포함할 수 있는 다공성 구조를 가질 수 있다. 용어 "다공성 스폰지형 구조"는 다공성, 응집성, 탄성, 가요성, 섬유성 및 탄력성이 있는 3차원 구조를 나타낸다. 건조 상태에서, 본 발명의 다공성 스폰지형 스캐폴드는 신속하게 유체를 흡수할 수 있다. 습윤 상태에서, 본 발명의 다공성 스폰지형 스캐폴드는 다공성, 응집성, 및/또는 온전성을 유지할 수 있다. 습윤 다공성 스폰지형 구조는 특정 인장 응력에 저항하고, 압축 해제 후 다시 튀어나와 유체를 재흡수할 수 있다. 다공성 스폰지형 스캐폴드 및/또는 생물학적 기능성 스캐폴드는 결함부, 피부 병변, 국소 상처, 궤양, 종괴절제 또는 유방절제 후 유방, 깊은 또는 터널링 상처(예를 들어, 누공) 상에 또는 내에 꼬이고/거나 접히고/거나 압연되고/거나 성형되고/거나 배치되고/거나 삽입되거나, 골, 연골 또는 연조직 결함부 주위를 감쌀 수 있다.
또 다른 양태에서, 본원에 기술된 태반-유래 기질은 타입 I 콜라겐, 타입 IV 콜라겐, 라미닌 감마-1, 피브로넥틴, 융모 소마토마모트로핀, FGF-12, FGF-13, IGF-2, EGFL-7 및 bFGF를 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 태반-유래 기질 중 타입 I 콜라겐의 농도는 약 20, 25, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 45% 또는 그 초과; 약 20, 25, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 45% 또는 그 미만; 및/또는 약 20 내지 50%, 25 내지 45%, 30 내지 40%, 또는 33 내지 38%이다.
본원에 기술된 태반-유래 기질은 몸체 전반에 걸쳐 발견된 ECM 단백질 및 당단백질에 풍부할 수 있으며, 이는 주요 세포 사건 예컨대, 세포 이동, 부착, 분화, 증식 및 생존을 유발하는데 필수적인 역할을 담당한다. 태반-유래 기질에 존재하는 단백질 예컨대, 콜라겐 IV, 인간 기저막에서 발견된 콜라겐의 가장 일반적인 유형, 라미닌, 피브로넥틴, 및 프로테오글리칸(예를 들어, 헤파란 설페이트)은 기저막에 세포를 지지하고, 세포를 하부의 콜라겐성 기질에 결합시키고, 중간엽/하부 결합 조직으로부터 상피를 분리할 수 있는 인장 강도를 제공할 수 있다.
또 다른 양태에서, 본원에 기술된 균질화된 태반 조직은 "대충 단편화된 태반 조직"을 포함할 수 있거나 없으며, 이는 단편으로 슬라이싱되거나, 분쇄되거나, 조각되거나, 부서지거나, 잘게 잘리거나, 다져지거나, 절단되거나, 해부되거나, 찢어지거나, 떼어지거나, 절개되거나, 자르거나, 깍둑썰기되거나, 면도되거나, 세분되거나 트리밍된 연결 조직을 나타낸다. 이러한 단편화된 태반 조직은 약 50미크론 초과 내지 약 0.5cm 미만의 평균 직경을 가질 수 있으며, 예를 들어, 대략 0.5 x 0.5cm의 절단 치수 및 대충 단편화된 조직에 적합한 두께를 갖는다. 일부 구체예에서, 대강의 단편은 균일한 크기가 아닐 수 있다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 2차원 또는 3차원 스캐폴드로서 본원에 기술된 방법에 의해 제조된 태반-유래 기질 상에 또는 내에서 세포를 배양하는 것을 포함하는 세포 배양 방법에 관한 것이다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 세포 배양은 일반적으로 시험관내 환경으로 지칭되는 인공 환경에서 세포 유지를 나타낸다. 용어 세포 배양은 일반적인 용어이며, 개별 세포뿐만 아니라 조직, 기관, 기관계 또는 전체 유기체의 배양을 포함하도록 사용될 수 있다. 본원에 기술된 배양 방법에 사용되는 세포는 임의의 원핵 세포 또는 진핵 세포일 수 있다. 본원에서 기술되는 배양 방법에 사용되는 세포 유형은 세포 지지체 조성물이 유래하는 동일한 종으로부터 유래될 필요는 없다. 또한, 세포는 확립된 세포주로부터 유래 될 수 있거나, 일차 세포 또는 유전자 조작된 세포일 수 있다. 예를 들어, 세포는 줄기 세포, 지방 유래 줄기 세포, 후근신경절 세포, 췌장 베타 섬 세포, 심근세포, 간세포, iPSC, 암세포, 및 제대 정맥 내피 세포로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.
예를 들어, 본 발명은 본원에 기술된 태반-유래 기질 상의 또는 내의 세포 성장 및/또는 배양을 제공한다. "본원에 기술된 태반-유래 기질 상의 또는 내의 세포 성장 및/또는 배양"은 자연 또는 합성 생체적합성 기질 또는 조직과 같은 임의 환경에서 본원에 기술된 태반-유래 기질의 표면 상에 배치하는 것뿐만 아니라 통상적인 세포 배양 방법을 포함한다. 세포는 포유동물, 예컨대 사람, 소, 돼지, 쥐, 양, 말, 개, 고양이 및 기타일 수 있으나, 이로 제한되는 것은 아니다. 일부 구체예에서, 본원에 기술된 태반-유래 기질 상에 또는 내에 배양되는 세포는 줄기 세포이다. 본원에서 사용되는 줄기 세포는 당업계에서 사용되는 바와 같이 사용되고, 분열하여 적어도 부분적으로 분화될 수 있는 하나의 딸 세포 및 모세포의 발달 가능성을 보유한 또 다른 딸 세포를 발생시킬 수 있는 능력을 갖는 세포를 의미한다. 본원에서 사용되는 줄기 세포는 지방 유래 줄기 세포, 치과용 줄기 세포, 성체 줄기 세포(ASC), 배아 줄기 세포(ESC), 조직-특이적 전구 세포 및/또는 유도 만능 줄기 세포(iPSC)일 수 있다. ASC는 비제한적으로, 조혈간 세포, 유방 줄기 세포, 장 줄기 세포, 중간엽 줄기 세포, 내피 줄기 세포, 신경 줄기 세포, 후각 성체 줄기 세포, 신경관 줄기 세포 및 고환 세포를 포함 할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 추가의 구체예에서, 본원에 기술된 태반-유래 기질은 본원에 기술된 태반-유래 기질 상에 또는 내에 배양된 줄기 세포에서 골형성, 연골형성 또는 인대/힘줄 기원과 같은 분화 유지 또는 촉진을 증가시키기 위한, 뿐만 아니라 세포 성장 및 증식을 지지하기 위한 시험관내 방법에 사용될 수 있다.
일부 구체예에서, 본원에 기술된 태반-유래 기질 상에 또는 내에 배양된 세포는 심근세포, 인간 제대 정맥 내피 세포(HUVEC), 유도 만능 줄기 세포, 간세포, 조골세포, 연골세포, 후근 신경절(DRG) 세포, 중간엽 줄기 세포, 지방-유래 줄기 세포, 배아 줄기 세포, 전구 세포, 분화된 세포, 비분화 세포 및/또는 -만능 줄기 세포일 수 있다. 적합한 세포는 또한 외배엽 계통의 세포, 중배엽 계통의 세포 및 내배엽 계통의 세포를 포함할 수 있지만, 이로 제한되는 것은 아니다. 외배엽 계통의 세포의 예는 각질형성세포, 뉴런을 포함하나 이로 제한되는 것은 아니다. 중배엽 계통의 세포의 예는 근육 아세포, 지방 세포, 섬유모세포, 내피 세포, 골모세포, 연골 세포 또는 간질 세포를 포함하나 이로 제한되는 것은 아니다. 내배엽 계통의 세포의 예는 청각관, 호흡기, 예컨대 기관(trachea), 기관지, 및 폐의 폐포, 위장관, 요로 방광의 상피 세포 및 모든 땀샘 내막의 상피 세포를 포함하나, 이로 제한되는 것은 아니다. 또한, 세포는 조직 또는 기관으로부터 유래된 일차 세포일 수 있다. 본 발명에 사용되는 적합한 세포주는 간질 세포주, 전골모세포 세포주, 조골 세포주 및 연골 세포주를 포함하지만 이로 제한되는 것은 아니다.
일부 구체예에서, 세포는 자가 또는 동종 기원으로부터 유래될 수 있다. 세포는 연골 세포, 골모세포, 파골 세포, 내피 세포, 상피 세포, 섬유모세포 및 골막 세포를 포함하는 분화된 세포일 수 있다. 추가로, 세포는 전능, 만능, 다능, 전구 세포, 조직-특이적 전구 세포, 또는 성체 체세포 줄기 세포일 수 있다. 줄기 세포는 배아, 태반, 골수, 지방 조직, 혈관, 양수, 활액, 활막, 심장 막, 골막, 경질, 말초 혈액, 제대혈, 태반막, 월경혈, 치아, 수핵, 뇌, 신생아 포피, 피부, 모낭, 장내 담낭, 신경 조직, 간, 췌장, 또는 근육으로부터 유래될 수 있다. 세포는 골격근, 평활근, 및 심근으로부터 유래될 수 있다. 줄기 세포는 유도된 만능 줄기 세포 (iPSC)와 같은 성숙한 세포의 유전자 재프로그래밍(genetic reprogramming)으로부터 유도될 수 있다. 모든 세포는 추가로 살아 있거나 최근에 사망한 공여체로부터 추가로 유래될 수 있다.
본원에서 기술된 임의의 세포는 특정 구체예에서 약 15분 내지 약 1년, 약 15분 내지 약 6개월, 약 15분 내지 약 3개월, 약 15분 내지 약 4주, 약 2시간 내지 약 2주, 약 2시간 내지 약 1주, 약 2시간 내지 약 72시간, 약 24시간 내지 약 72시간, 또는 약 24시간 내지 약 96시간 동안, 약 20℃ 내지 약 40℃ 또는 약 30℃ 내지 약 37℃에서, 약 1% CO2 내지 약 10% CO2 또는 약 4% CO2 내지 약 6% CO2를 함유하는 분위기 하에 본원에서 기술된 태반-유래 기질 상에 또는 내에서 배양될 수 있다. 본 발명의 일부 구체예에서, 세포는 본원에서 기술된 하나 이상의 성장 인자 및 (1) 조직 또는 기관, (2) 기질, 또는 (3) 이들의 조합의 존재 하에 또는 부재 하에 배양될 수 있다. 세포 배양 배지에서 본원에서 기술된 하나 이상의 성장 인자의 존재 하에 또는 부재 하에 배양된 세포는 이후 특정 구체예에서, 기질, 조직, 기관 또는 이들의 조합에 적용될 수 있다.
세포 배양 방법은 태반-유래 기질 상에 또는 내에 세포를 저장하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 태반-유래 기질 상에 또는 내의 세포는 실온 (즉, 약 24℃), 약 4℃, 약 -20℃에서 또는 냉동보존으로 저장된다. 기타 구체예에서, 태반-유래 기질 상의 또는 내의 세포는 약 -200, -180, -100, -50, -45, -40, -35, -30, -25, -20, -10, -5, 0, 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 36, 37, 38, 또는 39℃ 내지 약 -150, -140, -130, -90, -40, -35, -30, -25, -20, -15, -10, 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 25, 30, 35, 36, 37, 38, 또는 40℃의 온도에서 저장된다. 기타 구체예에서, 태반-유래 기질 상의 또는 내의 세포는 약 -200 내지 50℃, 약 -160 내지 36℃, 약 -160 내지 25℃, 약 -160 내지 5℃, 약 -5 내지 23℃, 약 0 내지 30℃, 또는 약 15 내지 40℃의 온도에서 저장된다.
또 다른 양태에서, 본원에 기재된 태반-유래 기질은 동결보호제로서 사용될 수 있다. 본원에 기재된 냉동보존은 -150℃ (즉, 123K) 미만의 온도에서의 보존을 지칭한다. 그러나, 본원에 기재된 동결보호제는 냉동보존 후 뿐만 아니라 동결 또는 동결건조 후 단백질의 생물학적 활성을 보존하는 보호제를 지칭한다. 일부 구체예에서, 본 발명은 동결 또는 동결건조로 인한 단백질의 생물학적 활성 손실을 억제하고/거나 감소시키는 방법에 관한 것이며, 이러한 방법은 동결 또는 동결건조로 인한 단백질의 생물학적 활성 손실을 억제하거나 감소시키기에 충분한 유효량의 태반-유래 기질에 단백질을 노출시키는 것을 포함한다. 추가의 구체예에서, 단백질은 본원에 기술된 것과 같은 임의의 세포 중의 임의의 단백질일 수 있다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 본원에 기술된 태반-유래 기질에서 세포를 혼합하여 세포와 태반-유래 기질의 혼합물을 생성하고, 관심 부위 상에 또는 내에 혼합물을 페인팅하거나, 에어브러싱하거나, 적하시키거나 주입시키는 것을 포함하는 세포 전달 방법에 관한 것이다. 또 다른 양태에서, 본 발명은 또한, 본원에 기술된 태반-유래 기질에서 세포를 배양하여 세포와 태반-유래 기질의 배양물을 생성하고, 관심 부위 상에 또는 내에 배양물을 페인팅하거나, 에어브러싱하거나, 적하시키거나 주입시키는 것을 포함하는 세포 전달 방법에 관한 것이다. 일부 구체예에서, 관심 부위는 비제한적으로, 인간, 인간외 동물, 소 및 돼지를 포함하는 대상체에 존재한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 본원에 기술된 줄기 세포 또는 조직-특이적 전구 세포의 분화를 촉진하는 방법에 관한 것이며, 상기 방법은 본원에 기술된 방법에 의해 제조된 태반-유래 기질 상에 또는 내에 줄기 세포 또는 조직-특이적 전구 세포를 배양하는 것을 포함한다. 예를 들어, 줄기 세포 또는 조직-특이적 전구 세포는 골모세포, 연골세포, 심근세포, 췌장 세포, 신경 세포, 인대 또는 힘줄로 분화될 수 있다. 일부 구체예에서, 조직-특이적 전구 세포는 성장 인자를 첨가하지 않으면서 관심 조직으로 분화된다. 또 다른 양태에서, 본 발명은 또한, 줄기 세포 또는 조직-특이적 전구 세포의 혈관, 근육성 또는 신경성 분화를 촉진하는 방법에 관한 것이며, 본 방법은 본원에 기술된 태반-유래 기질 상에 또는 내에서 줄기 세포 또는 조직-특이적 전구 세포를 배양하는 것을 포함한다.
일부 구체예에서, 본원에 기술된 태반-유래 기질은 조직-특이적 전구 세포에서 줄기능의 유지 (즉, 확장된 배양을 통해 특이적 조직으로 증식 및/또는 분화하는 능력) 및/또는 조직-특이적 전구 세포의 자가-재생 능력을 확장시키기 위한 시험관내 방법에 사용될 수 있으며, 방법은 선택적으로, 세포의 유지를 유도하기 위해 성장 인자 또는 또 다른 2차 인자를 첨가하지 않으면서, 태반-유래 기질 상에 또는 내에 조직-특이적 전구 세포를 배양하는 것을 포함한다. 추가의 구체예에서, 본원에 기술된 태반-유래 기질은 또한 세포의 분화를 유도하기 위해 추가의 성장 인자 또는 또 다른 2차 인자를 첨가하지 않으면서 만능 줄기 세포의 분화를 촉진하기 위한 시험관내 또는 생체내 방법에 사용될 수 있다. 기타 구체예에서, 본원에 기술된 태반-유래 기질은 또한 세포의 유지 또는 분화를 유도하기 위해 하나 이상의 성장 인자 또는 기타 2차 인자의 추가와 만능 줄기 세포 및/또는 조직-특이적 전구 세포의 분화를 촉진하기 위한 시험관내 또는 생체내 방법에 사용될 수 있다. 추가의 구체예에서, 본원에 기술된 태반-유래 기질은 또한 만능 줄기 세포 및/또는 조직-특이적 전구 세포의 분화 촉진에서 세포의 유지 또는 분화를 유도하기 위해 하나 이상의 성장 인자 또는 기타 2차 인자의 효과를 향상시키기 위한 시험관내 또는 생체내 방법에 사용될 수 있다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 또한 본원에 기술된 태반-유래 기질을 흉터 또는 결함 부위에 이식하는 것을 포함하여, 조직에서 결함부(들)의 흉터를 감소하거나 억제하거나, 결함(들)을 수복시키거나, 대체시키거나, 충전시키거나, 재생시키는 방법에 관한 것이다. 일부 구체예에서, 이식은 태반-유래 기질을 결함 부위로 페인팅시키거나, 에어브러싱시키거나, 적하시키거나 주입하거나, 조직 또는 기관 사이에, 예를 들어, 세포 또는 세포 구조 예컨대, 근육 또는 신경 다발 주위의 틈새 공간에 태반-유래 기질을 삽입하거나, 결함부 상단에 태반-유래 기질을 위치시킴으로써 수행된다. 결함이 있는 조직은 심장, 간, 췌장, 골 조직, 연골, 또는 연조직일 수 있다. 결함이 있는 연조직의 예는 힘줄, 인대, 진피, 피부, 성대, 신경, 방광, 질, 요도, 심장, 피하 조직, 근막, 유방, 근육, 태반막, 태반, 및 회전근개를 포함할 수 있다. 또 다른 양태에서, 결함이 있는 조직은 근골격계, 소화계, 심혈관계, 호흡계, 비뇨기계, 생식계, 신경계, 및/또는 면역계에 있을 수 있다. 일부 구체예에서, 상기 방법은 이식 전에 태반-유래 기질의 재수화를 배제하여 상기 태반-유래 기질이 원위치에서 혈액, 체액 및/또는 자가 세포를 흡수하도록 한다. 대안적으로, 태반-유래 기질을 포함하는 조직 수복 임플란트의 인간 또는 동물로의 이식은 조직 수복 임플란트를 재수화 용액으로 재수화시키고; 임의로 바이탈 세포를 태반-유래 기질 및/또는 조직 수복 임플란트 상에 또는 내에 시딩하여 조직 수복 임플란트에 생기를 부여하고; 임의로 이식 전에 세포-시딩된 조직 수복 임플란트를 배양하고; 조직 수복 임플란트를 결함부에 이식함으로써 수행될 수 있다. 또 다른 양태에서, 상기 방법은 태반-유래 기질을 포함하는 조직 수복 임플란트를 재수화 용액으로 재수화시키고; 임의로 상기 태반-유래 기질 및/또는 조직 수복 임플란트 상에 또는 내에 바이탈 세포를 시딩하여 상기 조직 수복 임플란트에 생기를 부여하고; 임의로 이식 전에 상기 세포-시딩된 조직 수복 임플란트를 배양하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 재수화 용액은 혈액 또는 골수 흡인액, 혈소판 풍부 혈장, 뇌척수액, 활액, 효소, 생리활성 보충제, 자연 폴리머, 합성 폴리머, 광활성제, 항산화제, 가교제, 항미생물제, 바이탈 세포, 및 생리활성 보충제 결합 부위(들)를 갖는 하나 이상의 제제로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함한다. 추가의 구체예에서, 바이탈 세포는 자가이식 또는 동종이식 골수 흡인물; 골수로부터의 간질 세포; 지방, 지방흡입물, 윤활막, 골막, 연골막, 근육, 진피, 제대혈, 태반, 태반막, 및 바르톤 젤리로부터의 간질 세포; 및 혈관주위세포로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 개방 상처 또는 터널 상처를 위한 상처 치료 기질 또는 조직 벌크 제제로서 본원에 기술된 태반-유래 기질을 사용하는 방법에 관한 것이다. 또 다른 양태에서, 본 발명은 또한, 관심 조직 부분에 인접한 본원에 기술된 태반-유래 기질을 이식하는 것을 포함하여, 관심 조직 부분을 표지하는 방법에 관한 것이다. 또 다른 양태에서, 본 발명은 또한, 관심 조직 부분 아래에 본원에 기술된 태반-유래 기질을 이식하고, 태반-유래 기질 위의 조직 부분을 절제하는 것을 포함하는 조직 절제 방법에 관한 것이다. 이러한 구체예에서, 태반-유래 기질의 이식은 임의의 추가의 표지 없이 절제될 관심 조직 부분을 표지할 수 있다. 일부 구체예에서, 조직을 절제하는 방법은 조직 또는 기관의 나머지 부분과 이격된 관심 조직 부분을 절제하지 않으면서 예를 들어, 관심 조직 부분의 가장자리(들)를 절단하거나 스크래칭시킴으로써 태반-유래 기질을 이식하기 전에 관심 조직 부분을 추가로 표지하는 것을 추가로 포함한다. 추가의 구체예에서, 이식은 조직 부분에 인접하게 태반-유래 기질을 주입하는 것을 포함할 수 있다. 추가의 구체예에서, 조직은 GI 관의 표피 층 (점막 및 점막하)에 국한된 고착 또는 편평 신생물일 수 있으며, 조직을 절제하는 방법은 내시경 점막 절제 및 내시경 점막하 절제에 사용될 수 있다. 예를 들어, 태반-유래 기질은 그 전체가 본원에 참조로 통합된 문헌 [Kantesevoy et al., vol. 68, No. 1, Gastrointestinal Endoscopy (2008)]에 기술된 점막하 주입을 위한 용액 예컨대, 글리세롤 및 히알루론산을 대체하거나 보완할 수 있다. 조직을 절제하는 방법은 또한, 태반-유래 기질 이식 후 점막을 절단하고, 조직을 절제하고, 나머지 GI 관으로부터 조직을 잘라내는 것을 포함할 수 있다. 예시적인 도식은 wjgnet.com/1948-5190/full/v4/i10/WJGE-4-438-g001.jpg에 예시되어 있다.
예를 들어, 본 발명은 또한 골유도성(osteoinductivity)을 촉진시키는 방법으로서, 본원에 기술된 태반-유래 기질 상에 또는 내에 세포를 배양하는 것을 포함하는 방법에 관한 것이다. 본원에서 사용되는 "골유도성"은 세포가 표현형에서 더욱 골모세포와 유사한 세포로 분화되도록 하는 것을 나타내거나, 이 용어는 골모세포의 증식을 증대시키는 것을 나타내거나, 둘 모두를 나타낼 수 있다. 태반-유래 기질 상에 또는 내에 배양하기 전에 세포는, 비분화되거나 부분적으로 분화된 세포일 수 있다. 세포는 배양물에 또는 조직, 기관 또는 이의 일부에, 또는 유기체에 존재할 수 있다. 태반-유래 기질의 골유도 활성은 변경되거나 변경되지 않을 수 있으며, 이러한 변경은 대조군 표면에 비해 향상된 활성을 포함하나, 이로 제한되지 않는다.
본 발명은 또한 연골유도성(chondroinductivity)을 촉진하는 방법으로서, 본원에서 기술된 태반-유래 기질 상에 또는 내에 세포를 배양하는 것을 포함하는 방법에 관한 것이다. 본원에서 사용되는 "연골유도성"은 세포가 표현형에서 더욱 연골 세포와 유사한 세포로 분화되도록 하는 것을 나타내거나, 이 용어는 연골 세포의 증식을 증대시키는 것을 나타내거나, 둘 모두를 나타낼 수 있다. 태반-유래 기질 상에 또는 내에 배양하기 전에 세포는, 비분화되거나 부분적으로 분화된 세포일 수 있다. 세포는 배양물에 또는 조직, 기관 또는 이의 일부에, 또는 유기체에 존재할 수 있다. 태반-유래 기질의 연골유도 활성은 변경되거나 변경되지 않을 수 있으며, 이러한 변경은 대조군 표면에 비해 향상된 활성을 포함하나, 이로 제한되지 않는다.
본 발명은 또한 인대/힘줄 분화를 촉진시키는 방법으로서, 본원에서 기술된 태반-유래 기질 상에 또는 내에 세포를 배양하는 것을 포함하는 방법에 관한 것이다. 본원에서 사용되는 "인대/힘줄 분화"는 세포가 표현형에서 더욱 인대 및/또는 힘줄과 유사한 세포로 분화되도록 하는 것을 나타내거나, 이 용어는 인대 및/또는 힘줄의 증식을 증대시키는 것을 나타내거나, 둘 모두를 나타낼 수 있다. 태반-유래 기질 상에 또는 내에 배양하기 전에 세포는, 비분화되거나 부분적으로 분화된 세포일 수 있다. 세포는 배양물에 또는 조직, 기관 또는 이의 일부에, 또는 유기체에 존재할 수 있다. 태반-유래 기질의 인대/힘줄 분화 활성은 변경되거나 변경되지 않을 수 있으며, 이러한 변경은 대조군 표면에 비해 증가된 활성을 포함하나, 이로 제한되지 않는다.
골유도성, 연골유도성, 또는 인대/힘줄 분화를 각각 평가하기 위해 측정될 수 있는 다양한 골모세포, 연골세포, 인대/힘줄 분화 마커가 존재한다. 예를 들어, 세포는 골모세포 계통 쪽으로의 분화의 초기 단계 동안 알칼리 포스파타제를 발현시킨다. 이에 따라, 시험관내 알칼리 포스파타제 검정은 본원에 기술된 태반-유래 기질 상에 또는 내에 배양된 세포에서의 골유도성를 평가하는데 사용될 수 있다. 그 밖의 비-골 형성 세포, 예를 들어, 근아세포(C2C12 세포)에서 알칼리 포스파타제 발현을 자극시키거나 유도하는 태반-유래 기질의 능력은 태반-유래 기질이 골유도 활성을 가짐을 나타낼 것이다. 이러한 검정에서, 태반-유래 기질 상에 또는 내에 그리고 대조군 표면 상에 배양된 세포는 비-골 형성 세포 상의 기준선 알칼리 포스파타제 발현을 보여주기 위한 음성 대조군으로서 사용된다. 음성 대조군에서 골모세포성 마커의 기준선은 0(zero)일 필요는 없는데, 이는 음성 대조군에서의 세포가 적어도 어느 수준의 표현형 마커(들)를 가질 수 있음을 의미한다. 따라서, 태반-유래 기질의 "골유도성" 표면은 간단하게, 실험 세포에서 골모세포 마커의 증가를 야기시킬 것이다. 유사하게, 몇 가지만 예를 들면, 타입 X 콜라겐, 타입 II 콜라겐, Sox 9, 아그레칸(Aggrecan), 마트릴린(Matrilin)-1 및 CEP-68을 포함하지만, 이로 제한되지 않는 연골세포 마커는 연골유도 가능성을 평가하는데 사용될 수 있다. 또한, 스클레락시스(scleraxis)를 포함하지만 이로 제한되지 않는 인대/힘줄 마커는 인대/힘줄 분화 가능성을 평가하는데 사용될 수 있다.
또한, 골유도성, 연골유도성, 및 인대/힘줄 분화는 일차 세포, 세포주, 또는 외식편과 같은 배양된 세포에서, 골모세포 표현형, 연골세포 표현형, 인대/힘줄 세포 표현형을 분화시키거나 유발시키는 태반-유래 기질의 능력을 조사함으로써 조직 배양물에서 결정될 수 있다. 예를 들어, 세포는 알칼리 포스파타제, 등과 같은, 골모세포에 대해 특징적인 마커의 증가된 생성을 나타낼 수 있다. 예를 들어, 태반-유래 기질의 골유도, 연골유도, 인대/힘줄 분화 가능성은 대조군보다 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10배 넘게 더 클 수 있다. 또 다른 예에서, 본원에 기술된 태반-유래 기질의 골유도, 연골유도, 인대/힘줄 분화 가능성은 대조군 스캐폴드의 가능성보다 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 500 또는 심지어 1000배 넘게 더 클 수 있다.
근육과 같은 위치에서 태반-유래 기질에 의해 유도된 골, 연골, 인대 또는 힘줄 형성 가능성을 평가하기 위한, 골유도성, 연골유도성, 인대/힘줄 분화는 또한, 적합한 동물 모델을 이용하여 평가될 수 있다. 예를 들어, 설치류에 근육내 이식은 태반-유래 기질의 골유도 활성을 평가하기 위한 모델로서 사용되었다.
본 발명은 또한, 본원에 기술된 태반-유래 기질 상에 또는 내에 세포를 배양시키는 것을 포함하는, 세포 혈관형성, 지혈, 생체적합성, 감염 내성, 부착, 증식을 촉진하거나, 분화된 상태를 유지시키거나 본원에 기술된 골모세포, 연골세포, 인대 세포, 힘줄 세포, 섬유모세포, 지방세포, 및/또는 임의 세포 타입의 탈-분화를 방지하는 방법에 관한 것이다. 태반-유래 기질의 증식 활성은 변경되거나 변경되지 않을 수 있으며, 이러한 변경은 대조군 표면에 비해 향상된 활성을 포함하지만 이로 제한되지 않는다. 본 발명은 추가로 지방세포, 섬유모세포, 상피세포 및/또는 혈관 내피세포의 지방 조직 형성을 촉진하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한, 혈관형성, 지혈 기능, 생체적합성, 항-흉터 작용, 항-염증 및/또는 감염 내성을 증가시키거나 촉진하는 방법에 관한 것이다.
미토겐성(mitogenicity)은 MTT [3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸륨 브로마이드 검정, alamarBlue® 검정, 등과 같은 대사 활성을 측정하는 다양한 시험관내 검정을 이용하여 태반-유래 기질에 의해 유도된 세포 증식을 조사함으로써 평가될 수 있다. alamarBlue® 검정은 세포 대사 활성을 측정하기 위한 비-세포독성 환원-산화 지시제를 사용하며, 이는 본원에 기술된 태반-유래 기질의 미토겐 활성을 평가하기 위한 비파괴적 검정을 만든다. 증식은 또한, DNA 정량화를 측정함으로써, 예를 들어, PicoGreen™ DNA 검정, DNA 합성의 방사성 라벨링, 예를 들어, [3H]티미딘 라벨링 또는 BrdU 도입을 이용함으로써 평가될 수 있다. 증식은 또한, 수동 세포 계수를 통해, 예컨대, 트리판 블루로 세포를 염색하고, 혈구계로 계수함으로써 평가될 수 있다.
본 발명은 또한, 세포에서 골 형성, 연골 형성, 또는 인대/힘줄 형성을 증가시키거나 촉진시키는 방법에 관한 것이다. 본 방법은 본원에 기술된 태반-유래 기질 상에 또는 내에 세포를 배양하는 것을 포함할 수 있다. 본원에서 사용되는 "골 형성"은 막내 골 형성 및 연골내 골 형성을 포함하지만, 이로 제한되지 않는, 새로운 골 물질의 침적 또는 새로운 골의 형성이다. 본원에서 사용되는 "연골 형성"은 새로운 연골 물질의 침적 또는 새로운 연골의 형성이다. 본원에서 사용되는 "인대/힘줄 형성"은 새로운 인대 및/또는 힘줄 물질의 침적 또는 새로운 인대 및/또는 힘줄의 형성이다. 태반-유래 기질의 골형성, 연골형성, 지방형성, 인대, 또는 힘줄 유도 활성은 변경되거나 변경되지 않을 수 있으며, 이러한 변경은 대조군 표면에 비해 향상된 활성을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다. 세포는 골, 연골, 인대, 또는 힘줄 형성이 요망되는 임의 조직, 예를 들어, 비제한적으로, 골, 연골, 인대, 근육, 힘줄, 등에서의 세포를 포함할 수 있다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 기재 표면을 태반-유래 기질로 코팅하는 방법에 관한 것이다. 태반-유래 기질은 예를 들어, 약 8.0 또는 그 초과의 염기성 pH를 가질 수 있다. 염기성 pH는 8.0-9.0, 바람직하게는, 8.0-8.5, 더욱 바람직하게는, 8.0-8.2의 범위일 수 있다. 예를 들어, 기질의 염기성 pH는 적어도 약 8.0, 8.1, 8.2, 8.3, 8.4, 8.5, 8.6, 8.7, 8.8, 8.9 또는 9.0, 바람직하게는, 적어도 약 8.0이다.
일부 구체예에서, 방법은 적어도 태반 조직의 조각을 탈세포화시키거나 탈활력화시켜 탈세포화되거나 탈활력화된 태반 조직을 생성하고; 탈세포화되거나 탈활력화된 태반 조직을 분해하여 태반-유래 기질을 생성하고; 기질 표면의 적어도 일부를 태반-유래 기질로 코팅하는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 방법은 분해와 동시에 또는 그 전에 태반 조직을 균질화시키는 것을 추가로 포함할 수 있다. 추가의 구체예에서, 태반-유래 기질은 표면 상에 태반-유래 기질을 예를 들어, 나노섬유 형태로 전기방사시킴으로써 표면으로 코팅될 수 있다. 본 발명은 또한 본원에 기술된 방법에 따라 태반-유래 기질로 코팅된 스캐폴드에 관한 것이다. 본 발명은 또한, 본원에 기술된 방법에 의해 생성된 태반-유래 기질로 코팅된 합성 표면에 관한 것이다. 본 발명은 추가적으로, 본원에 기술된 방법에 의해 생성된 태반-유래 기질로 코팅된 세포 배양 표면 상에서 세포를 배양하는 것을 포함하는 세포 배양 방법에 관한 것이다.
추가의 구체예에서, 본 발명은 또한, 담체로서 태반-유래 기질을 사용하는 약물 전달에 관한 것이다. 예를 들어, 태반-유래 기질은 본원에 기술된 생리활성 보충제를 캡슐화하고, 관심 부위에 이러한 생리활성 보충제를 전달할 수 있다.
본 발명의 임의 방법은 실제 임의 셋팅, 예를 들어, 생체내, 생체외, 원위 또는 시험관내 환경으로 수행될 수 있다. 예를 들어, 세포에서 골 형성, 연골 형성, 또는 힘줄/인대 유도 활성을 증진시키는 방법은 세포 배양에서 수행될 수 있거나, 태반-유래 기질 상에서의 시딩된 세포에서 수행될 수 있거나, 온전한 유기체에서 수행될 수 있다. 또한, 본원에 기술된 임의 구체예들 중 임의 둘 이상의 임의 조합이 고려된다.
본 발명이 다양한 특정 물질, 절차 및 실시예를 참조로 하여 본원에서 기술되고 예시되어 있지만, 본 발명이 그러한 목적을 위해 선택된 물질 및 절차의 특정 조합으로 제한되지 않는 것으로 이해된다. 이러한 세부사항들의 여러 변형들은 당업자에 의해 인식되는 것으로서 시사될 수 있다. 본 명세서 및 실시예가 단지 예시적인 것으로서 고려되는 것으로 의도되며, 본 발명의 진정한 범위 및 사상은 하기 청구범위에 의해 지시된다. 본 출원에서 언급되는 모든 참고문헌, 특허 및 특허출원은 이들의 전문이 본원에 참고로 포함된다.
하기 실시예는 예시적인 것으로서, 본원에 기술된 본 발명의 범위를 제한하도록 의도되지 않는다.
실시예
실시예 1: 태반-유래 기질(HuMATRIX) 제조
-80℃에서 보관한 전체 동결 인간 태반 (또는 심장 또는 간)을 즉시 처리되게 하거나 4℃에서 밤새 해동되게 하였다. 소독된 델리 슬라이서(Chefs Choice International Professional Electric Food Slicer Vari Tilt M645) 또는 고기 분쇄기 또는 밴드 톱을 사용하여, 태반 조직을 50g 조직 (습식 중량)의 더 작은 조각 (폭 및 직경에서 ~0.5cm)으로 절단하였다. 과량의 혈액을 씻어 내고 제거하기 위해, 태반 조직을 1리터의 4℃ 냉수 MiliQ 물로 세척하고, 이어서 오르비탈 쉐이커 상에서 1200 RPM으로 30분 동안 1% ABAM이 보충된 1리터의 4℃ 냉수 MiliQ 물이 든 컨테이너에서 강하게 세척하였다. 이러한 과정을 과량의 혈액이 현저하게 감소될 때까지 반복하였다. 태반을 탈세포화시키기 위해, 세척된 조직을 2.5g NEM, 프로테아제 억제제, 20g NLS, 및 1% ABAM이 보충된 1리터의 탈활력화 완충액에서 밤새 실온에서 200 RPM으로 진탕시켰다.
그 후, 10.2g의 습식 조직(= ~ 2g 동결건조된 조직)을 1mg/ml 펩신/0.1M HCl 용액에 첨가하였다. 3가지 농도의 태반-유래 기질(10mg/ml, 20mg/ml, 및 40mg/ml)을 생성시켰다. 약 40mg/ml에서, 생성물은 유동성이 없는 고점도를 가졌다. 슬러리가 균질해질 때까지 폴리트론 균질화기로 조직을 5회 10초 펄스로 블렌딩하였다. 생성된 용액을 약 24-60시간 동안 실온에서 교반하였다. 약 60시간 후, 펩신 HCl을 수산화나트륨 및 염산을 사용하여 간단하게 pH 8.0에 도달시킨 다음 pH 7.0-7.2이 되게 하였다. HuMATRIX 최종 생성물은 점성이며 외형이 거의 반투명한 것으로 보였다. 겔화 특성을 검사하기 위해, HuMATRIX 샘플을 37℃에서 15분 동안 가열하였다. HuMATRIX 샘플을 장기 저장을 위해 -80℃에서 보관하거나 2주 이내에 사용하려면 4℃에서 보관하였다. HuMATRIX의 최종 생성물을 약 37℃에서 하이드로겔로 전환시키거나 동결 건조하여 스폰지를 형성시켰다. 동결건조 후, HuMATRIX 스폰지를 유기 용매 (예컨대, 헥사플루오로이소프로판올)에 용해시키고 나노섬유 시트내로 전기방사시켰다. 또한, HuMATRIX의 동결건조된 스폰지는 놀랍게도 0.5M 아세트산에 재용해되고 중화될 수 있으며, 다시 37℃에서 하이드로겔로 주조될 수 있다.
또 다른 예시적인 방법에서, 태반 조직을 물 대신에 염수로 세척하였다. 다른 예시적인 방법에서, 염수 세척에 부가하여, 태반 조직의 탈세포화에 세정제를 사용하거나 짧은 기간을 이용하였다. 상기 공정 후 기질 중 불순물의 양과 함께 총 단백질 수율을 측정하였다. 프로테옴 결과는, 물 세척이 염수 세척 대비 더 적은 세포 잔류 파편을 발생시켰으나, 염수 세척은 최종 기질에서 더 높은 농도 및 성장 인자의 더 많은 다양성을 유도하였음을 보여주었다.
실시예 2: 태반-유래 기질의 단백질 프로파일
HuMATRIX의 단백질 프로파일을 측정하기 위해, SDS-PAGE 검정을 수행하였다. 10μl의 디티오트레이톨(DTT)을 각 샘플에 첨가하고 100℃에서 5분 동안 가열하여 기존의 모든 디설파이드 결합을 끊었다. 5분 동안 샘플을 가열한 후, 40μl의 추출물을 10μl의 Novex 샤프 마커와 함께 1.5mm 4-12% Tris-Glycin 겔에 로딩하였다. 겔을 1hr 동안 (200V 상수, 125mA 출발, 80mAmps 말단) 진행시키고, 밤새 코사미에 블루로 염색된 MilliQ 물로 세척하고 이어서 시각화하였다. 많은 밴드가 존재하였다. 4개의 다른 공여체로부터 유래된 4개의 태반-유래 기질 샘플은 SDS PAGE 겔에서 배치-대-배치 일관성을 보였다. MATRIGEL®의 주요 단백질 밴드는 대조군으로 사용하였다. 뚜렷하게 다른 밴드 패턴 및 주요 단백질 조성을 우레아로의 태반 추출 또는 탈세포화에 이은 우레아 추출과 비교하였다. 콜라겐 사슬을 나타내는 160kDa에서 진한 밴드가 관찰되었다. 단백질 조성은 전통적인 MATRIGEL/Urea 추출 화학반응에 비해 HuMATRIX 화학반응을 사용할 경우 그룹 간에 일관성을 보였으며, NLS 탈세포화되고 이어서 우레아 추출된 태반 기질과 구별되는 것으로 나타났다.
실시예 3: 태반-유래 기질로의 표면 코팅
세포 배양 플라스틱으로의 태반-유래 기질의 코팅 또는 결합 효율을 측정하기 위해, 0.6-1.3mg/cm2의 다양한 농도에서 HuMATRIX를 24개 웰 플레이트에 도포하고 코마시에 블루로 염색하여 완전한 총 염색을 평가하고, 따라서, 웰 상의 ECM 커버리지를 평가하였으며, 이러한 농도 범위에서 하전된 조직 배양 플라스틱 상의 가능한 세포외 기질 단백질의 균일한 코팅을 갖는다.
실시예 4: 단백질, 성장 인자, 및 DNA의 식별 및 정량화
키트에 제공된 제조업체 설명서에 따라, 총 단백질, 콜라겐 타입 I, 콜라겐 타입 IV, 피브로넥틴, 라미닌, 및 인간 태반 락토겐의 양을 정량화하기 위한 ELISA를 HuMATRIX, 약간의 화학적 변형을 갖는 HuMATRIX, 및 대조군 기질에서 수행하여 기질 차이를 비교하고 대조시켰다.
인간 태반 하이드로겔 중의 콜라겐 I, IV, 피브로넥틴, 라미닌 및 태반 락토겐 함량을 R&D 시스템 (Minneapolis, MN), Chondrex (Redmond, WA) 및 Genwaybio (San Diego, CA)로부터의 시중에서 입수 가능한 정량적 샌드위치 효소-연결된 면역흡착 검정 키트를 사용하여 각 8개의 독특한 공여체로부터 측정하였다. 모든 검정은 제조업체 사양에 따라 각 공여체 조직으로부터의 3중 샘플에서 수행하였다.
ECM 단백질을 총 단백질 정량화를 위한 Lowry 방법에 의해 측정되는 바와 같은 총 단백질 함량을 비교하여 중량%로서 표준화하였다. 전체적으로, 콜라겐 타입 I은 조성물의 평균 41%이며, 타입 IV 콜라겐은 총 기질의 약 3%를 차지하며, 라미닌 감마 1 및 피브로넥틴은 조성물의 평균 <1%였다. 인간 융모 소마토마모트로핀 (aka 태반 락토겐)은 HuMATRIX에서 평균 약 175ng/mL로 발견되었다. 태반 락토겐은 고도로 생활성인 것으로 문헌에서 보고되었으며, 이는 췌장 섬 세포로부터의 인슐린 생산을 자극하여, MCF7 종양 세포 증식의 4.4배 증가를 초래하고, 혈관신생을 유도하고, 적어도 HuMATRIX에 존재하는 평균 농도의 수준 또는 그 미만의 수준에서 태아 간세포 DNA 합성, 및 다른 기능을 자극하였다.
인간 태반 하이드로겔 샘플을 칭량하고 내 충격성 튜브에 넣었다. 상청액의 단백질 농도는 DTT 호환 BCA 검정법(Thermo Fisher Scientific, San Jose, CA)을 사용하여 측정하고, 추출된 단백질 샘플 100μg을 약 10분 동안 200V에서 NuPAGE MOPS SDS 1X 완충제 진행과 함께 NuPAGE 환원 겔 (4-12% Bis-Tris Gel)(Life Technologies, Carlsbad, CA)에서 진행시켰다. 단백질 밴드를 3-5mm 이동시킨 후, 겔을 Page Blue(Bio-Rad, Hercules, CA)로 염색하고 전체 단백질 밴드를 잘라 내었다. 겔을 탈색시키고 50mM NH4HCO3; 50% 아세토니트릴 및 80% 아세토니트릴 중에서 3회 세척하였다. 겔-결합된 단백질을 25분 동안 56℃에서 1ml의 40mM DTT로 환원시켰다. 겔을 1ml의 50mM NH4HCO3 완충제로 린싱하고 환원된 단백질을 30분 동안 25℃하에 어둠에서 계속 혼합하면서 1ml의 50mM 아이오도아세트아미드로 알킬화시켰다. 아이오도아세트아미드를 따라 내고, 겔 결합 단백질을 12h 동안 계속 혼합하면서 37℃에서 50mM NH4HCO3 완충제 중의 0.5ml의 트립신(20ng/μl; Promega, Madison, WI)으로 분해하였다. 분해 후, 50mM NH4HCO3로 겔을 세척함으로써 트립신 분획물을 수집하였다. 트립신 펩티드를 함유하는 용리액을 Speed-Vac 장치(Thermo Fisher Scientific)를 사용하여 건조시키고 질량 분광 분석 전에 4℃에서 보관하였다.
건조된 샘플을 0.1% 포름산/물 20μl로 용해시킨 후, 동적 배제(DE=1) 설정으로의 데이터 종속 획득을 이용하여, Easy NanoLC-1000 시스템을 갖춘 Q-Exactive (Thermo Fisher Scientific) 질량 분광계로 LC/ESI-MS/MS에 의해 2μl의 각 샘플을 분석하였다. 사용된 데이터 종속 획득 설정은 Q-Exactive MS에 대한 상위 12 고에너지 충돌 유도 분리였다. Q-Exactive에 대한 분해능은 m/z 200에서 전체 MS 스캔에 있어서 70,000으로 설정하고, MS/MS 스캔의 경우 17,500으로 설정하였다. LC/ESI-MS/MS 분석은 C18 컬럼(75μm x 150mm)을 사용하여 수행하였다. 역상 크로마토그래피에 대한 이동상은 (A) 0.1% 포름산/물 및 (B) 아세토니트릴 중의 0.1% 포름산이다. 4단계 선형 구배를 LC 분리에 사용하였다 (10분 동안 2% B; 처음 47분에서 2% 내지 30% B, 이어서, 다음 1분은 80% B 및 12분 동안 80% B에서 유지로 칼럼 사전-평형).
라벨-비함유 전구체 이온 검출 방법 (Proteome Discoverer, 버젼 1.3, Thermo Fisher Scientific)을 5ppm 질량 정확도 내에서 전구체/단편에 대한 특정 보유 시간으로 이용하였다. 분류(taxonomy) "Human"을 사용하여 Swissprot (버전 57)에서 추출한 조합된 Human 단백질 데이터베이스(총 28,000개 서열)를 검색하여 최종 MS/MS 스펙트럼에서 펩티드를 확인하는데 Sequest 알고리즘을 이용하였다. 모체 및 단편 이온 허용오차에 대한 검색 파라미터는 Q-Exactive MS에 대해 15ppm 및 60mmu로 설정하였다. 사용된 다른 파라미터는 카르바미도메틸화-Cys의 고정된 변형, 포스포릴화(S,T,Y) 및 산화(Met)의 가변적 변형이다. 트립신은 최대 2회 누락된 절단을 갖는 프로테아제로서 설정하였다. 확인된 >2 펩티드 (또는 단일 펩티드에 포함된 단백질의 >50%)를 갖는 단백질만 비교 정량 분석 단계에 포함시켜, P<0.05의 정확한 단백질 식별 확율을 발생시켰다. 단백질에 아직 명확하게 연결되지 않은 펩티드는 향후 분석에서 제외시켰다.
HuMATRIX에서 확인된 총 단백질의 질량 분광 데이터로부터 생성된 Venn Diagram은, 대안적인 태반 ECM 추출 전략(T1 및 D1으로서 라벨링된 우레아 추출을 이용한 MATRIGEL® 화학반응 vs. 변형된 MatrACELL 화학반응을 이용한 HuMATRIX 그룹에 있어서 P1) 및 MATRIGEL® 대비 HuMATRIX 제조물 사이에 높은 상동성을 나타냈다. 또한, HuMATRIX의 기능성 단백질 그룹은 세포 기능에 따라 분류되었다. 일부 예에서, 구조적 분자 활성의 분자 기능과 관련된 674개 단백질을 라미닌 및 피브로넥틴을 포함하는 3개의 추출 단계로부터 확인하였다. 이들 예에서, 모든 3개의 추출 전략으로부터 확인된 90개 글리칸 함유 단백질은 프로테오글리칸, 바이글리칸, 글리코단백질, 및 포스포글리세레이트 키나제를 포함하였다.
물로 린싱한 예시적 태반-유래 기질 샘플은 하기 GenBank 수탁 번호를 갖는 하나 이상의 단백질을 포함할 수 있다: A1YZL0, Q9UHS6, C9JKW4, Q6LEU9, E5RFD4, Q9UHT9, Q59F88, A0N4V7, Q6PB30, Q9BXY1, E9PSI6, C9JLE0, B4E2W7, D8MJ84, C9J430, Q01629, A6PVK6, B5M0Y2, Q96A10, O19525, Q969R7, B0UZ35, Q92494, Q5TBE3, Q6UWP5, Q9UF73, Q6LEN6, Q71RG2, E1Y3Y3, B3KS68, Q9H3C1, B3KSJ1, C9JB87, E7EU94, Q9P169, Q8WU39, Q6ZP25, A2RUQ5, B7Z515, Q8IZY5, P13645, D6RFZ9, Q71JB4, Q8N8E1, E9PAS6, C6GLW5, A2NZ55, Q8NBC3, E9PJF3, D6RBF7, Q4ZEJ2, Q5NV84, P01761, E9PS84, A1YZH4, Q5TBT3, B4DKX8, C9JF15, Q6YL41, D6RCN1, Q6ZNV4, B4DQC9, Q53GF3, C9J7P8, B7Z3P2, B8A4K4, B7Z5H5, Q5JYG5, Q9UL90, Q7L2U6, B7Z7E1, E5RII8, B4DEE8, B7Z8E6, E7EPH1, B1AMW7, E7ES61, Q8TDA6, Q5T7W9, Q99604, Q6ZP66, A8MQU8, P04264, B4DT64, E0CX09, E5RFW1, B4DZ50, B7Z2Y8, Q5T450, B4E0U2, E5RH38, Q6ZMC9, Q6XYB5, Q6ZNV2, B7WP14, P05413, E5RK96, E5RJS6, B7Z1F8, E9PEP2, Q8N1V5, D6RJG1, E9PRB0, D3DPE6, Q8IYA7, Q8N5M1, Q8NF12, Q96GA9, B4DGM4, B7Z1F7, B3KWM9, Q9H841, A0AVI4, B4E0C8, Q4W5L8, Q6PCB0, Q9H3W0, Q92567, Q5JU04, C3VNC3, E9PNQ0, B2BD34, Q93015, Q8NAT4, Q8IXR4, E7ENW1, B4DET2, B3KUU3, Q6IAN5, Q9BSD0, B8ZZY8, Q5JQQ4, Q8NAP1, Q9H6K5, A8MQ11, Q6ZNW4, O60721, Q6IRZ0, B4DI09, B4E0D3, E9PDA1, Q9UJC5, P30042, B7ZM74, Q96RY6, O15302, Q4VXJ3, B4DWN5, B3KST6, C9J586, Q9NPB6, Q9H6Q4, Q9UF83, B4E2Z1, D3DTX7, Q05CU2, Q8N589, D3YTD6, Q9Y3D8, Q8IZE8, E7ENV3, B7Z4R8, B2R888, Q5SQI7, C5H6K5, Q6ZV01, B3UYF0, Q06945, P08123, B4DLY8, Q9BPU6, B3KP95, Q6ZNC4, Q9H7V2, Q3B7T3, B4DV90, B4DUJ3, B3KSZ4, Q9BWN1, Q9BTQ8, Q9BYE7, Q86Y37, C9JZ88, B4DWU6, Q9Y5T4, Q68CJ6, P11766, Q5JPU0, Q10713, B3KSG5, Q8N254, B3KQS8, Q9NSI3, Q9BTU6, C9J6F7, A8MX39, B3KNL1, C9JF34, Q2UY09, B4DFR7, Q52LB7, Q86U33, A8MY71, Q6FHW5, Q8TBX0, B2RTS9, B4DVD7, B7ZMB3, B2R8U0, Q59H22, Q5SY01, B7Z8D8, B7ZLN9, B3KSU4, B3KWL2, B2RCK1, B4DVR4, Q5T0T5, Q68DS7, B1ATL7, Q59EZ0, B4DU33, P12724, Q8IYK8, B5A948, B2RAP6, A0PJX8, Q5TCZ1, B7Z8K4, Q53TX7, B4DHY8, Q53G16, Q92556, B4DMW0, B3KM38, Q6Y881, Q8NGI8, Q9H748, Q8WVL7, E5RHS6, Q6ZRS5, Q9NWR1, B7ZBI4, Q7L3S4, Q6ZMH4, B3KP66, B0V3L4, A6NNH2, Q9NZV8, E9PKC0, B4DZ79, P34982, B7Z609, A8K979, E9PEI6, Q08999, Q9BZ68, Q8N808, Q502V2, Q4ZHG4, Q9P206, B, 7ZKY6, Q5H9Q3, Q9NSM0, Q53G79, D6RCM8, Q8NGI4, E5RG31, Q96LT6, E7EPE7, A8K9P0, B4DR21, Q6ZS11, E9PCP1, Q6P5X8, P02452, Q9H7E9, P78517, B9ZVA0, C9JBF1, B4DUE5, Q9H7S4, Q99419, Q6ZUF6, B5MCV7, Q8IYI6, B4DYB3, Q5TBN9, D9ZGG0, A6NJB7, A8K0M8, B3KSA0, Q6ZWL3, Q96Q06, E5RJA7, Q96ER9, A8K557, C9JGX5, Q9UJX1, B5MCB9, Q9H210, B4E338, Q6ZRP5, Q13596, Q59EW1, E9PBL0, A8MTL3, E7EU41, B3KXM9, Q9H6C4, B4DHA3, Q5FC05, O95484, B2R7K1, O15457, B4E186, Q5TCY1, Q0VAA2, A8MW61, E7EVQ7, E9LT28, Q9N2K0, E5RG82, Q6NTF9, Q4JNY3, E9PAV3, E9PCD7, B4DSN3, Q9UJT0, Q9Y661, Q8N506, B3KSP5, B7Z6J4, Q9NS40, C9JE72, P02461, B4DJN5, Q70Z44, A8MRT1, Q9UNY4, B4DSH1, E7EV41, Q9P2V4, P50553, A8K079, Q9HBH5, A6NCS9, C9JRP7, Q69YU3, Q9Y467, A6NEM2, Q86TV2, B1APR7, C9JT30, Q68E02, P01570, B2RDK3, Q9UHD2, B5A940, Q8IW90, B4DRF4, A8KA64, E9PDC8, Q8NFW5, Q8IYX3, 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염수로 린싱한 예시적 태반-유래 기질 샘플은 하기 GenBank 수탁 번호를 갖는 하나 이상의 단백질을 포함할 수 있다: B4DUX0, B2RDK3, B4E1U3, Q69YL0, A8MTC3, Q9UL32, Q9UIW0, E5RK96, Q9UNY4, B3KS99, E7EPZ1, Q5T205, B2RCH0, E9PJL5, Q86W28, E7EPC3, E7EVS9, Q9UPX8, Q7Z7G8, O75417, Q7Z5P9, A1L3A3, B7Z387, C9J066, O14910, Q96EN8, Q29988, Q6YHU3, A0N4V7, Q9H2A3, Q02952, A6NHM9, B7ZLM6, B4E015, P58107, Q9HCL0, C9JTI1, C9JZ00, P55198, Q9UBC2, C9JI52, B4DVR2, Q9Y6X7, Q96NG3, Q8NET4, C9JVT2, B4DL55, Q5T9S2, O75962, E7EPD1, Q07343, Q9UP91, E0X084, Q8NFU7, Q96KC8, C9JMM2, Q9NVE4, Q6AW83, B4E0D3, A8K6A6, E9PJT0, Q8NF21, P49792, E9PBT7, Q96P03, Q9UEY4, A7E228, Q308M6, P08123, Q8NB14, Q6ZN14, Q9H4M7, Q9UF83, Q8WXH0, Q8N3S3, Q4LE43, Q8WYP5, E7EUV3, Q8IYB3, O15034, Q0VF99, Q59GG3, P22676, O95396, A6NL46, B4DP13, Q9UQ35, D6RA67, Q5TB93, B4DZ58, O60382, Q12955, Q9ULI3, Q9UHR5, O95393, Q32MM9, Q68DE3, Q6ZQY3, D6RCD0, A8K1T0, Q14DE1, Q5VVP1, Q30KQ9, Q9Y5G7, Q7Z4Y3, Q12845, P05997, Q14839, B1AQK6, Q6P387, Q0VAB1, A8MRT1, B4E2G5, D3DS91, P02461, A8K670, 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O95226, Q53GX1, O75295, Q2VPA4, A8MTP9, B0QY77, Q9H347, Q86UK0, P78362, Q9UF71, Q14DR2, O76081, Q9UKK3, B7Z217, Q96T83, Q9H816, E7EPB6, Q5SXM2, O75366, Q8IW70, A4ZI32, Q53HL0, Q8TDT8, P20061, E5RJQ4, E1P541, B4DKZ7, Q9P2F8, Q96F44, O15047, B4DFU5, E9PFC2, P17032, B2RAN0, Q8NFU0, O15230, Q6ZSR9, Q53SW3, Q9BTG3, D6RTK6, A8K9Z8, B7ZMI0, C9JI12, D3DS86, B4DI49, A6NEM4 , P09172, B7WPH3, Q8IVE3, O96028, Q5VWN6, O94910, Q68DS0, A6NDR9, B2R708, Q2NLA0, Q8IYU4, Q96RL7, Q13017, E7EW28, O43520, Q8IVU1, Q8TD84, A6NIR3, P98198, Q6NX52, Q9UBC3, A6NCI8, Q8IZF3, D6RBT4, Q8N9H8, Q92576, , D6RDY7 , Q59GI4, Q6ZMR1, O94806, P82987, Q16825, B3KS49, Q9NQA5, Q8NFM4, B4DFD6, E7EPU5, Q8IVF6, Q86Y38, Q5TGY3, Q02224, E5RIM3, O14830, Q13634, B3KUX7, Q5HY54, E1P5G4, A6NP11, O15015, E7ENU4, O14981, B7ZLZ2, A8K1Z4, D3DUU2, Q6ZU69, Q7LBC6, Q8TDZ4, Q7Z6G8, Q96JK9, Q9BUD9, P35523, Q8NBH6, B7Z3H9, Q6PKG0, Q6ZMT1, Q2M2A3, D3DSF5, Q5TCS8, Q9H7F0, O60374, E7ENM8, Q7Z6E9, Q9UK61, Q9UPV0, B4DZF0, Q96JQ0, P11047, E9PG22, Q9NZJ4, E7EWM0, Q14CL3, B7Z7X4, B3KW69, Q6ZRR9, B2RNT9, Q8IUA7, Q96PE2, B2RTS2, Q9Y232, Q76NI1, Q6ZUA9, A4PB67, Q15283, Q5C9Z4, Q9NZR2, A8K330, P11215, O43151, O60449, Q8N556, Q8TCN5, P46531, B7Z904, E0CX08, B4DF22, C9JY66, Q7Z401, B3KPN9, B7ZLJ8, B3KWW9, Q6IEH8, Q9NRD8, Q5TBA9, B3KMB8, B4E3N7, A0AVI2, Q7RTY7, 및 E7EUN6.
MATRIGEL®과 비교하여 물로 린싱한 HuMATRIX에서 발견된 주요 ECM 단백질의 상대적 풍부를 정량하는데 Orbitrap 질량 분광법을 추가로 이용하였다(도 1).
세포내 섬유모세포 성장 인자 iFGF-12(발달되는 심방 챔버(heart atrial chamger)의 심근 및 발달하는 사지 골격의 연결 연조직 및 갈비뼈의 척추골 연결과 관련됨) 및 iFGF-13(발달하는 심방과 심실 챔버의 심근에서 그리고, 전압-작동 나트륨 및 칼슘 채널의 세포내 조절인자로서 발달되는 중추 신경계와 말초신경계 전반에 발견됨), 인슐리 유사 성장 인자-2(IGF-2, 태아 췌장 베타 세포 발달 및 줄기 세포 분화를 또한 촉진하는 주요 태아 성장 인자), EGFL-7(허혈-재관류 손상 수복, 생체내 혈관 형성 조절, ECM으로의 내피 세포 부착과 촉진 및 혈관신생 촉진, HUVEC 및 신경 줄기 세포에서 Notch 시그널링 억제에서 역할을 담당하는 것으로 밝혀짐, 면역계 탈출을 촉진할 수 있음), 및 bFGF(FGF-2, 기저막에서 발견되고 새로운 혈관 형성과 연관됨, 비분화된 상태의 세포를 유지하기 위해 배아 줄기 세포 배양을 위한 중요 성분으로서 추가로 주지됨)를 포함하는 기타 성장 인자가 또한 질량 분광법에 의해 확인되었다.
샘플 중에 존재하는 잔여 DNA 양의 정량적 측정을 위해, 피코그린 검정을 수행하였다. 대조군으로서, 탈세포화된 조직 조각 및 사전-탈세포화된 조직 조각을 또한 분해시켰다. 25mg의 생성된 동결건조된 물질을 1.03ml의 프로테이나제/1X TE 완충액에 용해시키고, 3시간 동안 1200rpm에서 55℃에서 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 샘플을 표준 첨가 방법에 의해 적용하였다. 200μl의 각 분해물을 다양한 부피의 1X TE 및 gDNA 스파이크로 첨가하였다. 그 후, 100μl의 샘플을 96 웰 미세적정 플레이트에 적용한 다음 100μl의 PicoGreen 염료를 96 웰 플레이트에 첨가하고 형광 플레이트 판독기 (소광(extinction) 485nm 및 발광 538nm 설정)에서 판독하였다. 도 2에 도시된 바와 같이, 태반 EMC 샘플 각각에서 DNA는 약 95% 감소하였다. 탈핵은 H&E에 의해 염색된 바와 같이 탈세포화된 태반 조직의 조직학적 절개에 의해 확인되었다(도 2).
실시예 5: 태반-유래 기질 상에 또는 내에서 세포 배양
HuMATRIX에 직접 부착되는 부착 세포 유형의 능력을 평가하기 위해, 표준 혈청-비함유 세포 부착 검정을 수행하였다. 인간 지방-유래 중간엽 줄기 세포(ASC)를 소태아 혈청(FBS) 및 항생제성 항진균제(ABAM)가 보충된 DMEM 배지에서 37℃ 인큐베이터에서 약 70-80% 컨플루언스를 갖도록 성장시켰다. 검정 전날 세포에 영양분을 공급하였다. 48개 웰 플레이트를 대략 200μl의 CELLSTART®(피브로넥틴과 인간 혈청 알부민), MATRIGEL® 또는 HuMATRIX로 각 시점에서(15분, 30분, 60분, 및 120분) 3중으로 코팅하고 밤새 건조되게 하였다. 대조군으로서, 웰의 그룹은 코팅되지 않은채 남겨두었다. 다음날, 200μl의 2% BSA를 코팅된 웰에 첨가하고 실온에서 30분 동안 인큐베이션되게 하였다. 30분 후, 웰을 Hanks Balanced Salt Solution(실온으로 사전 가온됨)으로 세척하고 건조되지 않게 하였다. DPBS 및 0.05% 트립신을 실온으로 사전 가온시키기 시작하였다. 플레이트로부터 배지를 제거하고 세포를 PBS로 2회 세척하였다. ASC는 트립신으로 분해되고, 트립신으로의 분해는 대두 트립신 억제제로 억제되었다. 세포를 DMEM(혈청 비함유)에 재현탁시키고 계수하여 1.5x103개 세포/웰을 전달하였다. 세포를 각각의 기질 상에서 15분, 30분, 60분 및 120분 동안 인큐베이션하고, 임의의 부착되지 않은 세포를 PBS로 세척하여 제거하였다. 플레이트를 4% 파라포름알데히드로 10분 동안 고정시킨 후 크리스탈 바이올렛으로 5분 동안 염색하였다. 각 웰을 dH2O로 4회 세척하여 잔류하는 임의의 크리스탈 바이올렛을 제거하였다. 각 웰에 있는 세포의 수는 ImageJ64 소프트웨어를 사용하여 현미경으로 이미지 캡처에 의해 수동으로 계수하였다.
혈청 비함유 배양 배지에서 지방 유래 줄기 세포(ASC) 부착은 ASC를 사용하여 세포 부착 검정으로 검사하였다. ASC를 CELLSTART® (피브로넥틴과 인간 혈청 알부민), MATRIGEL® 또는 혈청 비함유 배지에서 태반 유래 기질(HuMATRIX) 코팅된 배양 플레이트 또는 배양 플라스틱에 넣었다. 부착 반응과정은 15, 30, 60 및 120분에 측정하였다. 태반 유래 기질(HuMATRIX) 그룹 중 2개 로트 각각은 CELLSTART® (피브로넥틴), MATRIGEL®, 또는 배양 플라스틱 단독과 비교하여 모든 시점에서 더 높은 부착을 보였다. ASC의 전형적인 형태가 1, 3 및 7일에 혈청 비함유 배지에서 성장한 것으로 관찰되었다.
지방 줄기 세포를 또한, 혈청 비함유/제노 프리 조건에서 배양하고, 생존력을 평가하기 위해 Alomar 블루를 사용하여, HuMATRIX와 함께 6 French 심장 카테터에 카테터 주입 후 대사 활성에 대해 평가하였다. 100,000, 200,000 또는 400,000개 ASC를 사전 혼합되고 6 French 삼장 카테터를 통과한 1ml의 HuMATRIX와 카테터로, 배지와 카테터로, 또는 피펫으로 배양 플레이트 상으로 전달하였다. 전달된 세포의 생존력을 3일에 걸쳐 형태학적으로 그리고, Alamar 블루에 의해 평가하였다. Alamar 블루 (웰의 배지의 1/10 부피)를 샘플에 첨가하고 4시간 동안 인큐베이션되게 하였다. 4시간 후, 각 샘플 100μl를 96 웰 플레이트에 로딩하고 형광을 570nm (여기) 585nm (발광)에서 판독하였다. CELLSTART 대 HuMATRIX에서 성장한 지방 줄기 세포의 세포 생존력에는 현저한 차이가 없었다.
실시예 6: 후근 신경절(DRG) 배양
HuMATRIX 상의 외배엽 세포 부착 및 성장 능력은 또한 후근신경절(DRG)을 사용하여 평가하였다. DRG의 거의 100% 부착이 우레아 추출과 함께 탈세포화된 태반, HuMATRIX, 및 Laminin에서 관찰되었으나, DRG는 배양 플라스틱에 단독에는 거의 부착되지 않았으며, 세포는 세포 형태를 평가하기 위해 DAPI 및 베타-III-튜불린에 대해 염색하였다. HuMATRIX에서 성장한 세포만이 더욱 발달된 표현형을 나타냈으며, 또한, 광학 현미경으로 관찰된 바와 같이 HuMATRIX의 8개 배치를 포함하는 다양한 기재 상에서 DRG의 Alamar 블루 대사 활성으로 관찰된 신경절(ganglionation)은 ECM 코팅에 있어서 최소의 차이를 보이며, 여전히 배양 플라스틱 단독 상의 DRG는 거의 0 활성을 갖는다.
조직 공학처리된 HuMATRIX 상의 DRG 배양을 추가로 평가하기 위해, YFP 발현 DRG를 7일된 강아지 및 성체 마우스로부터 분리하고, HuMATRIX, 코팅 및 전기방사된 섬유 상에 플레이팅하고, MATRIGEL® 및 PDL 코팅된 유리 커버슬립 상의 DRG와 비교하였다. 신경모세포 배지, B27, L-Glut, 항생제성 항진균제(ABAM)으로 구성된 DRG 배지를 각 웰에 첨가하고, 플레이트를 37℃에서 인큐베이션하였다. 배지를 3일마다 웰에서 교체하고, 새로운 배지를 7일마다 만들었다. 48개의 웰 플레이트를 200μl의 아미노산 폴리머 Poly-D-리신(PDL)으로 균일하게 코팅하고 밤새 실온에서 인큐베이션하였다(밀봉된 플레이트). 다음 날, 나머지 Poly-D-리신을 웰로부터 흡입하였다. 웰을 린싱하고 증발되게 하였다. 웰의 증발 후, 웰을 HuMATRIX 및 MATRIGEL®의 겔로 균일하게 코팅하였다. PD만을 함유하는 웰은 대조군으로서 사용하였다. 대략 500μl의 DRG 배지를 각 웰에 첨가하였다. 플레이트를 37℃ 인큐베이터에 밤새 위치시켰다. 모든 나머지 (비-부착) 세포를 다음날 세척 제거하였다. 14일 동안, 형광 현미경으로 각 웰에서 DRG 증식을 조사하였다. 신경 돌기의 길이를 ImageJ64를 사용하여 측정하였다. HuMATRIX로 코팅된 웰에서 현저한 신경 돌기 확장이 관찰되었다. HuMATRIX 및 MATRIGEL®에서 성장한 후근신경절은 대조군 플레이트(PDL)보다 현저하게 더 많은 양의 신경 섬유 확장을 경험한다. 평균 DRG 신경돌기 확장 길이는 MATRIGEL®의 길이와 유사하였다.
실시예 7: iPSC로부터 유래된 심근세포 및 인간 1차 심근세포 배양
심근세포를 또한, 기질-의존적 부착성을 갖는 제2 중배엽 세포 유형으로서 HuMATRIX 상에서 배양하였다. 인간 1차 심근세포를 혈청 비함유/제노 프리 상태에서 Celprogen 세포외 기질 코팅된 플레이트 상에서 웰 당 20,000개 세포로 시딩하였다. 1주 동안 세포를 배양시킨 후, 이들을 3개의 상이한 로트로부터의 HuMATRIX, 0.1% 젤라틴, 조직 배양 플라스틱, 및 MATRIGEL®를 포함하는 다양한 기재로 옮겼다. 1, 3, 5 및 7일에 세포 생존력을 알라마르 블루(alamar blue)를 사용하여 측정하였다. HuMATRIX와 비교하여 다양한 이종발생성 세포외 기질 코팅된 플레이트에서 성장된 심근세포의 생존력에는 현저한 차이가 존재하지 않았다.
또한, 유도된 만능 줄기 세포(iPSC)로부터 유래된 (분화된) 심근세포를 4개 로트의 HuMATRIX에서 성장시키고, 젤라틴, 피브로넥틴, MATRIGEL® 및 배양 플라스틱과 비교하였다. iPSC-심근세포는 HuMATRIX에 신속하게 부착되었으며, 초기에 다른 기질에 부착되는 세포는 거의 없으며, HuMATRIX 상의 세포만이 부착 후 1일 (다른 기질의 경우 2-3일)에 수축되었다. iPSC-심근세포는 또한, 피브리노겐을 포함하는 기타 기재 상에서의 배양에 비해 HuMATRIX에서 구별되는 형태를 가졌다. 이들 심근세포를 세포가 안에서 생존가능하며 수축되는 대형 3D 하이드로겔 디스크 (약 200미크론 두께 8mm 직경)에 캡슐화시켰다. 또한, iPSC-심근세포는 다른 기재에 비해 HuMATRIX에서 1-2일 더 일찍 동시발생하였으며, 전기생리학에 의한 칼슘 과도현상(transient)을 모니터링함으로써 전기적으로 결합하는 것으로 나타났다.
심근세포의 전기적 커플링은 배양 1일 동안 HuMATRIX 상에서 iPSC-유래 심근세포 배양의 변형된 패치 클램프 전기생리학적 평가에 의해 확인하였다. 칼슘 과도현상은 개별 세포 번호에 따라 색상 변화로 표현되고 강도 변조 디스플레이의 기록된 영상으로 시간에 따라 추적되며, 이는 340nm에서 여기되고 380nm에서 발광되는 것으로 나타난 Fura-2 비율계 염료 리포터를 기록하였다. 모든 세포는 칼슘 과도현상 및/또는 수축을 동시에 발생시키는 것으로 보이며, 따라서 합포체는 이러한 배양 시스템에서 생성됨을 나타낸다.
실시예 8: 태반-유래 기질 상의 간세포 배양
간세포는 HuMATRIX 상에서의 성장을 위해 내배엽 세포로서 검사하였다. 인간 간세포는 콜라겐 샌드위치 배양에 비해 MATRIGEL®과 유사한 HuMATRIX 상에서 고전적인 형태를 나타내며, HuMATRIX에 비해 MATRIGEL® 그룹에 대해 낮은 부착성을 강조하기 위해, 6일째 액틴 염색에 의해 강조되는 바와 같이 1, 3 및 6일에 HuMATRIX 하이드로겔의 상단 또는 내부에 성장시킨 세포를 갖는 MATRIGEL 단독으로의 더욱 탁월한 부착성을 나타내는 것으로 보인다. 게다가, 다양한 기재 상에 성장시킨 간세포에 있어서 배지 중 우레아 농도는 HuMATRIX에서 가장 낮은 수준을 나타냈으며, 이는 더욱 빠른 동화작용-이화작용 대사 이동을 통해 더욱 신속한 간세포 배양 적응을 시사한다.
실시예 9: 태반-유래 기질로의 중층
간세포를 수확하고 디쉬 또는 웰에서 배양하였다. 다양한 농도 (0.5, 1.5 및 3 mg의 단백질/mL)의 태반-유래 기질 용액을 제조하고 배양 배지와 혼합하여 중층 배지를 제조하였다. 제조된 중층 배지를 얼음 상에 유지하였다. 중층 배지 각각을 그 위에 간세포가 부착되고 배양되는 디쉬 또는 웰에 첨가하였다. 디쉬 또는 웰을 반환하였다.
실시예 10: 태반-유래 기질 코팅된 플레이트 상에서 췌장 베타 섬 세포주 배양
래트 Rin5f 섬 세포(ATCC, CLR2058)의 바이알을 37℃ 수조에서 부드럽게 흔들어 해동시키고(대략 2분), 9.0 mL의 완전한 RPMI 1640 배지(ATCC 30-2001)를 함유하는 원심분리 튜브에 옮겼다. 세포 현탁액을 대략 300g에서 3분 동안 회전시키고, 세포 펠렛을 5ml의 완전 RPMI 1640 배지로 재현탁시켰다. 15μl의 세포 현탁액을 15μl의 0.4% 트리판 블루와 함께 라벨링된 에펜도르프 튜브에 첨가하였다. 약 20μL의 0.4% 트리판 블루 세포 현탁액을 슬라이드 상에 피펫팅시키고 세포 계수기를 사용하여 반복(replicate)/그룹당 총 세포 수를 측정하였다 (세포 수: 1.51x10^6개 세포). 10ml의 완전 RPMI 1640 배지를 세포 현탁액에 첨가하고, 5 ml의 세포 현탁액을 3개의 T25 배양 플라스크 상에 20000개 세포/cm2의 밀도로 시딩하였다. 세포를 37℃ 및 5% CO2에서 인큐베이션하고, 배지를 격일마다 교체하였다. Rin5f 세포를 70-80%의 컨플루언시(~ 7일)에 도달하도록 성장시키고, 배양 배지를 제거하여 T25 플라스크로부터 따라 버렸다. 세포 층을 DPBS (-/-)로 2회 린싱하여 모든 미량의 혈청을 제거하고, 4 mL의 Accutase를 T25 플라스크에 첨가하였다. 세포 층이 흩어질 때까지 도립현미경으로 세포를 관찰하였다. 3mL의 완전 베타 세포 배지를 세포/Accutase에 첨가하여 탈활성화시키고 부드럽게 피펫팅하여 세포를 흡입하고, 세포 현탁액을 50ml 원뿔 튜브에 옮기고 7ml의 추가의 완전 RPMI 1640 배지를 플라스크 당 첨가하였다. 세포 현탁액을 대략 300g에서 3분 동안 회전시키고, 세포 펠렛을 5ml의 완전 RPMI 1640 배지로 재현탁시켰다. 15μl의 세포 현탁액을 15μl의 트리판 블루와 함께 라벨링된 엔펜도르프 튜브에 첨가하고, 약 20μL의 트리판 블루 세포 현탁액을 슬라이드 상에 피펫팅시키고 세포 계수기를 사용하여 반복/그룹 당 총 세포 수를 측정하였다 (세포 수: 4.5x10^6개 생 세포). 48 웰 플레이트는 40μl의 HuMATRIX(2 Lot) 또는 Matrigel로 6중으로 코팅하였다. 플레이트를 37℃ 및 5% CO2에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 4.8×10^5개의 생 세포를 재스피닝시키고 25ml의 완전 RPMI 1640에 재현탁시켰다. 인큐베이터로부터 48 웰 플레이트를 제거하고 500μl의 세포 현탁액을 20,000개 세포/cm2의 밀도로 각 웰에 첨가하였다. ECM의 임의의 추가의 코팅 없이 조직 배양 플라스틱을 대조군으로서 사용하였다. 세포를 37℃ 및 5% CO2에서 인큐베이션하였다. 완전 RPMI 1640 배지는 2 일마다 교체하였다. 3 및 7일 후, 세포 형태를 현미경으로 관찰하였다.
상기 기술된 바와 같이 다양한 기질 상에 성장시킨 췌장 베타 섬 세포를 하기 프로토콜에 따라 글루코스로 자극하였다: surgery.wisc.edu/system/assets/354/Islet_Glucose_Stimulated_Insulin_Secretion_Assay.pdf?1264176115. 그 후, 세포에 의해 분비된 c-펩티드(인슐린)를 c-Peptide EIA Kit (Sigma-Aldrich; RAB0326) 및 이의 제조업체 프로토콜 (sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-aldrich/docs/Sigma/Bulletin/1/rab0326bul.pdf)을 사용하여 측정하였다.
실시예 11: 태반-유래 기질에서 췌장 베타 섬 세포 배양
3.6×105 Rin5f 섬 세포를 재스피닝시키고 1.5ml의 완전 RPMI 1640에 재현탁시켰다. 0.5ml의 세포 현탁액을 0.5ml의 HuMATRIX(3개의 독특한 Lot) 및 MATRIGEL에 재현탁시켰다. 7.2×105개의 생 세포를 재스피닝시키고 1.5ml의 완전 RPMI 1640에 재현탁시켰다. 0.5ml의 세포 현탁액을 0.5ml의 HuMATRIX(3 Lot) 및 MATRIGEL에 재현탁시켰다. HuMATRIX 또는 MATRIGEL를 갖는 세포 현탁액 120μl를 48 웰 플레이트의 웰에 6중으로 첨가하였다. 플레이트를 37℃ 및 5% CO2에서 2시간 동안 인큐베이션하고, 48 웰 플레이트를 인큐베이터 및 500ul로부터 제거하였다. 완전 RPMI 1640을 각 웰에 첨가하고, 세포를 37℃ 및 5% CO2에서 인큐베이션하고, 완전 RPMI 1640 배지를 2일마다 교체하였다. 3 및 7일 후, 세포 형태를 현미경으로 관찰하였으며 콜로니 형성을 관찰하였다. 또한, 태반 기질을 사용하여 이러한 췌장 섬 세포 및 따라서, 아마도 다른 세포 유형을 냉동보존하였다. 태반 ECM 단독, 태반 ECM + 10% DMSO, 태반 ECM + 10% DMSO + 10% HSA RPMI 단독, DMSO 단독, HSA 단독 및 이들의 조합물에 3x106 Rin5f 세포를 피겨 14D 당 동결시켰다. 세포를 액체 질소 저장 온도로 제어 속도 동결시키고 해동 및 후속 생/사 세포 계수 전 한달 동안 보관하였다. DMSO와 함께 인간 태반 기질에 냉동보존된 세포는 10% DMSO를 갖는 RPMI의 표준 동결 배지에서의 냉동보존 대비 생존 가능한 세포 수의 2x 증가를 보였으며, DMSO를 갖는 태반 ECM에 10% HSA가 추가로 보충되는 경우, 금 표준 냉동보존 방법과 비교하여 생존 가능한 세포의 4x 증가를 보였으며, 낮은 Rin5f 세포 생존력이 다른 단일 성분 냉동보존 시스템에서 관찰되었다.
실시예 12: iPSC 배양 및 분화
만능 유도된 만능 줄기 세포(iPSC)를 HuMATRIX에서 성장 및 분화에 대해 예비적으로 시험하였다. IPSC 세포를 mTeSR 1 또는 mTeSR 2에서 성장시키거나 Stemgent 제노-프리 및 혈청 비함유 배지를 MATRIGEL®에 계대시켜 세포를 피더(feeder) 비함유 배양에 적응시켜 오염된 피더 세포를 제거하였다. 세포는 HuMATRIX로 코팅된 웰 및 HuMATRIX의 나노섬유 상에 디스파제(dispase) 또는 TripLE로 계대시켰으며, 이때 세포는 Tra-1-60 염색에 의해 결정된 바와 같이 배양 7 일째에 세포가 부착되어 만능성을 유지하는 것으로 관찰되었다. 클러스터링된 세포의 집단은 HuMATRIX 나노섬유에 부착 및 임베딩되고, TRA-1-60 양성이고, HuMATRIX의 겔 상에 부착되어 성장하는 콜로니로서 성장하는 것으로 관찰되었다.
내배엽, 중배엽 및 외배엽의 3가지 배 계통으로 분화를 유도하는 능력 또한 시험하였다. iPSC를 배아 체내로 클러스팅하여 HuMATRIX(PlacBMsup), MATRIGEL®(MG) 또는 젤라틴(Gel) 중 어느 하나에 부착시키고, 만능 상태에서 iPSC(F13 섬유모세포) 및 iPSC(F13 plurip iPSC) 세포를 제조하는데 사용된 파운더 섬유모세포 주의 기저 발현 수준과 비교하였다. 임의의 추가 처리 없는 플라스틱 플레이트는 또한 대조군으로서 사용하였다. Trizol을 이용하여 RNA를 추출하고, 외배엽 분화의 상대적 유전자 발현을 측정하기 위해 sox1 및 nestin에 대한 프라이머를 사용하고, 중배엽 분화의 상대적 유전자 발현을 측정하기 위해 Actina2 및 brachyury를 사용하고, 내배엽 분화의 상대적 유전자 발현을 측정하기 위해 Sox17과 FoxA2를 사용하였다. 샘플의 발현 수준은 iPSC를 제조하는데 사용된 파운더 섬유모세포 주(F13 섬유모세포)의 기저 발현 수준 및 iPSC (F13 plurip iPSC)와 비교하였다. HuMATRIX는 플라스틱 또는 MATRIGEL® 상의 배양에 의해 유도된 수준 이상으로 각 발달 계통에서 유전자를 상향조절하는 것으로 관찰되었다.
실시예 13: 제정맥 내피 세포(HUVEC) 배양
HuMATRIX가 시험관 내에서 내피세포 튜브 형성에 필요한 구성요소를 함유하는지의 여부를 시험하기 위해, 인간 제정맥 내피 세포(HUVEC)를 T75 플라스크 상에 500,000개 세포로 시딩하고 LSGS가 보충된 Medium 200 배지 중의 조직 배양 플라스틱에서 6일 동안 배양하였다. 6일 후, 세포를 30분 동안 2μg/ml의 농도를 갖도록 DPBS로 희석된 칼세신 AM과 인큐베이션하였다. 30분 후, 세포를 트립신화시키고, 그 후 웰 당 100,000개 세포의 밀도로 다양한 기재(HuMATRIX, 알기네이트, 젤라틴, MATRIGEL®, 및 Geltrex®)로 사전-코팅된 24 웰 플레이트로 옮겼다. 500μl의 배지를 각 웰에 첨가하였다. 플레이팅 후 약 16시간째에 세포를 Zeiss 현미경으로 시험하여 GFP 하의 내피 튜브 형성에 대해 관찰하였다. 내피 튜브 형성은 MATRIGEL® 양성 대조군에서와 같이 4개의 독특한 로트의 HuMATRIX로 사전-코팅된 HUVEC 세포에 존재하였으나, 조직 배양 플라스틱 단독 상에서는 2차원 배양에 대한 혈관형성이 결여되었다.
실시예 14: 생체적합성
HuMATRIX의 생체내 생체적합성을 평가하기 위해, 마우스 피하 주입 검정법을 수행하여 18ga 니들을 통해 피하 주입된 HuMATRIX 하이드로겔과 스폰지 vs. MATRIGEL®을 비교하였다. 임플란트를 2주 동안 제자리에 두고 동물의 체중 및 일반적 건강 상태를 모니터링하였으며, 아무런 부작용이 나타나지 않았다. 설명에 따라 주입된 물질을 위치시키고, 그 후 H&E에 의한 조직학적 분석을 위해 가로 놓인 피부 및 아래에 놓인 근육을 따라 절제하였다. H&E는 2주째에 상대적으로 불활성이고 불량하게 세포화된 것으로서 MATRIGEL을 나타낸 반면, HuMATRIX 겔 및 스폰지는 이식된 이식편 전체에 걸쳐 세포를 함유하였다. 임플란트를 M1 및 M2 대식세포 마커에 대해 추가로 염색하여 염증유도(M1) 또는 리모델링(M2)으로서 CD68, CD206, 및 CD86 항체를 사용하여 확인하였다 (데이타는 2월에 검증을 기다리고 있음). 임플란트의 H&E 염색은, 이종발생성 인간 태반 유래 기질을 마우스에 이식하였지만, 뚜렷한 캡슐화가 없는 더 높은 세포 침투가 MATRIGEL®과 비교해서 태반 유래 기질 그룹에서 발견됨을 보여주었다.
실시예 15: 태반-유래 기질 전달
생체내에서 HuMATRIX를 전달하는 능력을 추가로 검사하기 위해, 하이드로겔을 염수 주입과 비교하여 유도된 허혈 (심근 경색) 후 래트 심근에 주입하였다. 5-0 봉합사를 사용하여 심장의 좌전 하행 동맥(LAD)을 결찰시킴으로써 래트에 심근경색을 부여하고, 심장의 블랜칭 및 후속 심장초음파를 이용하여 심근경색을 확인하였다. 주입된 심장을 8주에 절제하고 랑겐도르프(langendorff) 챔버를 사용하여 위험이 있는 허혈 부위에서 세포 전기생리학적 활성의 임의의 차이에 대해 광학 맵핑으로 분석하였다. 심장을 또한 TTC로 염색하고, H&E 및 Mason's Trichrome을 위해 임베딩하기 위한 포르말린에 고정시켜 그룹 간의 심근벽 두께 및 흉터를 분석하였다. 광학 맵핑에 의해, 평균적으로 염수 처리된 그룹은, 자극 전극이 결찰된 LAD 아래의 경색 영역에 위치할 때 위험 영역 밖으로 전기(부정맥)를 전도하는 능력을 손실하였으며, 여기에서 5개의 주어진 전기 자극 중 단지 1 또는 2개만이 먼 패치 클램프에서 기록될 수 있는 반면, 전형적으로 5개 모든 펄스는 HuMATRIX 주입된 그룹에서 기록되었다. 전반적으로, 염수 주입된 7마리 동물 중 5마리는 수술 후 2주 내에 죽은 반면, HuMATRIX 주입된 5마리 동물 중 5마리는 8주에 걸쳐 생존하였다. 수술전 배출 분획에서의 변화를 수술 후 8주와 비교하면, 56% 개선된 배출 분획이 이러한 예비 조사의 HuMATRIX 그룹에서 나타났다. 이러한 결과는 인간 HuMATRIX의 래트 심근으로의 주입 안정성을 보여주며, 이는 심장 질환 및 기타 질병의 추정 치료제로서 이러한 기질 내의 가능한 세포 전달을 위해 이러한 인간 ECM 하이드로겔 사용에 대한 실행 가능성을 지지한다.
HuMatrix는 Biotin 라벨링 키트 설명서에 따라 비오틴 컨쥬게이팅시켰다. 심근 허혈을 2마리 래트에서 상기 기술된 바와 같이 유도하였다. 비오틴 라벨링된 HuMatrix를 좌심실 심근의 허혈 영역의 치료 부위에 주입하였다. 바이오틸화된 HuMatrix 주입 후 30분 및 1시간째에, 래트를 안락사시키고 심장을 절제 및 조직학적 분석을 위해 채취하였다. 심장을 4% 파라포름알데하이드에서 고정시키고, 최적의 절단 온도 화합물에서 급속 동결시키고, 냉동절제하고 슬라이드 상에 탑재하였다. 인접한 연속 절편을 콜라겐에 있어서는 Sirus Red로 염색하거나 비오틴에 있어서는 FITC 컨쥬게이팅된 Streptavidin으로 염색하였다. HuMATRIX 겔화를 연속 절편에서 콜라겐 염색 및 비오틴 염색 둘 모두의 존재에 기초하여 평가하였다.
Sirius Red (Direct Red 80, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) 및 Fast Green (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)을 1.3% 피크르산에 1% wt/v로 용해시켰다. 절편을 Sirius Red와 20분 동안 인큐베이션하고, 인산염 완충된 염수(PBS)로 세척하고 10분 동안 Fast Green과 인큐베이션하고 영구적 탑재 전에 다시 세척하였다. 비오틴 염색을 위한 절편을 또한 심장 트로포닌 I에 대해 염색하고 DAPI로 대조염색하였다. 샘플을 0.25% Triton-X100으로 20 분간 침투시키고, 4% 소 혈청 알부민으로 실온에서 1시간 동안 차단시키고, 마우스 항-래트 심장 트로포닌 I 항체(Abcam, Cambridge, MA)와 4℃에서 밤새 인큐베이션하고, 0.25% Tween20을 갖는 PBS로 세척하고, 실온에서 1시간 동안 염소 항-마우스 Alexa Fluor® 546 항체 (Life Technologies, Grand Island, NY) 및 Steptavidin-FITC (eBiosciences, San Diego, CA)와 인큐베이션하였다. 커버 슬립을 Vectashield HardSet 탑재 배지 (Vector Laboratories, Burlingame, CA)로 탑재시키고, 슬라이드를 이미징까지 -20℃에서 동결 유지시켰다.
수술 후 8 주째에 2% 이소플루란으로 동물을 마취시키고 헤파린 5ml를 주입하고, 심장을 절제하기 위해 수술을 수행하였다. 그 후, 심장을 빙냉 타이로드(tyrode) (탈이온수 중 128.2mM NaCl, 1.3mM CaCl2 (2H2O), 4.7mM KCl, 1.05mM MgCl2 (6H2O), 1.19mM NaH2PO4, 20mM NaHCO3, 11.1mM D-Glucose, pH = 7.35±0.05) 용액으로 충전시킨 컨테이너로 외식하고 맞춤형 캐뉼러에 연결하였다. 냉 타이로드 용액은 생명 지원 시스템에 연결되어 악화를 방지할 때까지 심장 활동을 저지시키는 것을 돕는다. 캐뉼러 처리된 심장은 새로운 타이로드 용액으로 랑겐도르프 관류시키고, 이어서 실험 장비에 옮겼으며, 여기에서 이는 37+/-1℃에서 타이로드 용액으로 관류되고 초관류되었다. 타이로드 용액을 95% O2로 통기시키고, 그 후 심장에서 50 내지 60mmHg의 압력을 유지하는 속도로 펌핑하였다. 일단 수축이 안정화되면, 10ml 타이로드 용액 중에 용해시킨 약 10마이크로리터의 전압 민감성 염료, Di-4-ANBDQBS를 캐뉼라에 가깝게 주입하고 나머지 실험을 위해 재순환시켰다. 염료 관류 수분 후, 30μM 용액 2,3-부탄디온 모녹심 (BDM), 흥분-수축 디커플러를 타이로드 용액에 첨가하여 임의의 운동 인공물을 제거하였다.
사용된 광학 맵핑 시스템은 종래에 ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3469699에 상세히 설명되어 있다. 간단히 말하자면, 다이크로익 미러(dichroic mirror)에 의해 지시된 적색 레이저(650nm)가 심장을 조명하며, 이는 전압 민감성 염료를 여기시키고 형광을 방출시켰다. 형광 빔은 고속 CCD 카메라에 의해 최종적으로 기록된 파장 715nm의 롱 패스 방출 필터(715nm)에 의해 여과하였다. 카메라는 80x80 픽셀 해상도에서 1000Hz의 획득 속도를 갖는다.
탈세포화를 통해 처리된 조직은 H&E에 의해 세포 제거를 확인하기 위해 수집하였으며, 10% 중성 완충된 포르말린 고정된 절편을 임베딩, 절편화 및 염색을 위해 DePaul Medical Center (Norfolk, VA)에 보냈다. 광학 맵핑의 마지막에, 심장을 트리페닐테트라졸륨 클로라이드(TTC)로 염색하였다. PBS 1%W/V에 용해된 TTC로 타이로드 용액을 대체하였다. 심장은 15분 동안 TTC로 관류시키고 절제를 위한 포르말린에 보존하였다. 그 후, 심장을 정점으로부터 봉합사 위 2mm까지 2mm 간격으로 슬라이스하였다. 일련의 심장 절편을 파라핀에 포매시키고, 절편화시키고, 탑재하고, VCU Pathology Services (Richmond, VA)의 H&E 및 Mason Trichrome으로 염색하였다.
실시예 16: 대사 안정성 스크리닝
96-웰 플레이트를 상기 기술된 바와 같이 제조된 태반-유래 기질로 코팅하였다. 간세포는 웰 당 50μl의 35,000개 세포의 농도로 간세포 대사 배지(HMM) 중에서 96-웰 플레이트에 플레이팅시켰다. 평가될 시험 물질의 2배 농도의 존재 및 부재하에 50μl의 HMM 샘플을 각 웰에 첨가하였다. 플레이트를 37℃에서 다중 시점 동안 (어미 평가 물질의 50%가 사라지는 기간인 T1/2의 측정을 위해) 또는 스크리닝 목적을 위해 하나의 단일 시점(예를 들어, 30분) 동안 인큐베이션하였다. 아세토니트릴을 첨가하여 대사를 종결시켰다. 원심분리를 이용하여 나머지 시험 물질을 함유하는 상청액으로 간세포 및 세포 거대분자를 제거하였다. 인큐베이션 후 어미 평가 물질 농도의 LC/MS/MS 정량화는 하기 식에 의해 측정하였다:
잔존율% = [(인큐베이션 후 농도)/(인큐베이션 전 농도) x 100%
시험관내 간 내재적 청소는 문제의 신규한 화학 물질의 인간 생체내 간 청소율의 초기 추정치로서 T1/2 값으로부터 추가로 계산하였다. 시험관내 인간 간세포와 인간 생체내 결과 간의 상관관계는 대사 비율뿐만 아니라 단백질 결합 및 세포내 흡수를 고려함으로써 개선된다.
실시예 17: 억제 약물-약물 상호작용을 평가하기 위한 간세포 P450 억제 검정
24-웰 플레이트를 본원에 기술된 바와 같이 제조된 태반-유래 기질로 코팅하였다. 간세포는 웰 당 490μl의 250,000개 세포의 농도로 간세포 대사 배지(HMM)에서 24-웰 플레이트에 플레이팅시켰다. 평가될 시험 물질의 100배 농도의 존재 및 부재하에 5μl의 HMM 샘플을 각 웰에 첨가하였다. 플레이트를 37℃에서 15분 동안 사전-인큐베이션하여 시험 물질과 간세포의 상호 작용을 허용하였다. 평가될 시험 물질의 100배 농도의 존재 및 부재하에 동일한 5μl의 HMM 샘플을 동일한 웰에 첨가하고, 플레이트를 30분 동안 인큐베이션하였다. 아세토니트릴을 첨가하여 대사를 종결시키고, 원심분리를 사용하여 세포 거대분자를 제거하였다. 기재의 효소 대사를 약물-대사화시키기 위해 LC/MS 또는 HPLC 정량화를 수행하였다. 억제성 약물-약물 상호작용 검정을 위해 관례적으로 사용되는 P450 아이소형-특이적 기재 및 아이소형-특이적 억제제가 검정을 위한 양성 대조군으로 사용될 수 있다. 억제 검정 결과는 상대 활성으로 나타냈다:
상대 활성 (%) = [활성 (처리)/활성 (음성 대조군) × 100%
상대성을 기반으로 하여, EC50 값 및 Ki 값을 계산하였다.
실시예 18: 유도성 약물-약물 상호작용을 평가하기 위한 간세포 P450 유도 검정
24-웰 플레이트를 본원에 기술된 바와 같이 제조된 태반-유래 기질로 코팅하였다. 플레이팅가능한 냉동보존된 인간 간세포 또는 새로 분리된 인간 간세포를 웰당 500μl의 0.35-0.40 백만의 농도로 간세포 플레이팅 배지 (HPM) 중에서 24-웰 플레이트에 플레이팅시켰다. 생성된 단층 배양물은 거의 100% 컨플루언트하며, 간세포 플레이팅 일을 0일로 하였다. 4시간 배양 후, 배지를 0.25mg/mL 태반-유래 기질을 함유하는 것으로 대체하였다. 하룻밤 인큐베이션 후 (1일), 배지를 간세포 유도 배지(HIM)로 대체하였다. 2일에 효소 유도 가능성에 대해 평가할 약물의 원하는 농도를 함유하는 HIM으로 배지를 교환하였다. 3, 4 및 5일에, 총 72시간의 처리가 가능하도록 평가될 약물을 함유하는 HIM으로 배지를 매일 교체하였다. 6일째에 처리 배지를 제거하고, 특이적 약물-대사 효소 기질을 함유하는 0.5mL의 HMM으로 대체하고, 플레이트를 추가 30 분 동안 인큐베이션하였다. 아세토니트릴을 첨가하여 대사를 종결시키고, 원심분리를 사용하여 세포 거대분자를 제거하였다. 기재의 효소 대사를 약물-대사화시키기 위해 LC/MS 또는 HPLC 정량화를 수행하였다. 유도 결과는 음성 (용매) 대조군의 백분율로서 표시하였다:
유도율 (%) = [활성 (처리)/활성 (용매 대조군) × 100%
결과는 양성 대조군, 오메프라졸 (10μM; CYP1A2 유도) 및 리팜핀 (10μM; CYP3A4 유도)로부터의 결과와 비교하였다.
실시예 19: 간독성
96-웰 플레이트를 본원에 기술된 바와 같이 제조된 태반-유래 기질로 코팅하였다. 간세포는 웰 당 100μl의 35,000개 세포의 농도로 간세포 대사 배지(HMM) 중에서 96-웰 플레이트에 플레이팅시켰다. 플레이트는 24시간 동안 인큐베이션하여 단층 배양물의 부착 및 형성을 허용하였다. 배지는 간독성 가능성에 대해 평가될 요망되는 농도의 약물을 함유하는 간세포 인큐베이션 배지로 교환하였다. 플레이트를 24시간 동안 인큐베이션하고, 세포독성을 요망되는 세포독성 종료점을 사용하여 검정하였다 (즉, 세포 ATP 함량의 정량화를 위해, 50μl의 세포용해 완충제를 첨가하고, 이어서 50μl의 루시페린-루시퍼라제 시약을 첨가한 후, 다중웰 플레이트 판독기를 사용하여 발광을 정량화시켰다). 타목시펜을 양성 대조군으로서 사용하였다.
실시예 20. ECM-펩신 추출물의 기본 처리는 잔여 펩신을 효과적으로 불활성화시키는데 필요하다.
재료. 염산(BDH, Franklin Lakes NJ), 소 혈액으로부터의 헤모글로빈 (H2625) (Sigma Aldrich, St. Louis MO), 트리클로로아세트산(T0699) (Sigma Aldrich, St. Louis MO), 펩신(P7000) (Sigma Aldrich, St. Louis MO), 수산화나트륨 (VWR, Radnor PA), 및 태반-유래 ECM (LifeNet Health IRM, Virginia Beach VA).
헤모글로빈-기반 펩신 활성 검정. 시험 샘플 중 다양한 농도의 펩신을 이용한 적정 실험을 수행하여 이러한 검정의 민감성을 측정하고 본 연구에서의 이의 잠재적인 사용을 평가하였다. 간단히 말해서, 0.1-1.0mg/ml 범위의 10mM 염산 중 펩신의 연속 희석액을 2.0mg/ml 스톡액으로부터 제조하였다. 0.5ml의 각 시험 용액을 유리 바이알 중의 2.0% 헤모글로빈 기질 용액 2.5ml와 혼합하고 정확히 10분 동안 37℃에서 인큐베이션 한 후, 5.0ml의 5.0% 트리클로로아세트산(TCA) 용액을 첨가하여 반응을 중단시켰다. 샘플을 1000rpm에서 15초 동안 원심분리하고, 상청액을 280nm에서 이의 스펙트럼 흡수에 대해 평가하였다. 샘플 흡수는 TCA 용액 (내부 블랭크)의 첨가 후 첨가한 시험 용액으로 표준화시켰다.
펩신 용액의 잔여 단백질 분해 활성에 대한 pH 스위프 효과. 공지된 농도의 펩신 용액을 제어된 pH 스위프로 처리하여 펩신의 단백질 분해 활성의 불활성화에 대한 이들의 효과를 측정하였다. 간단히 말하면, 0.75mg/ml 펩신 용액을 1.0M NaOH를 사용하여 pH7.4 ("중성") 또는 pH8.2로 pH 스위프 처리하고, 이 pH에서 실온에서 15분간 유지한 후, 1.0M HCl을 사용하여 다시 pH2.0으로 되돌려 놓았다. 후자 그룹에서 pH 스위프를 달성하는데 필요한 NaOH 및 HCl 용액의 부피를 모니터링하고, 펩신 활성 검정 완료 전 1.0M NaCl을 사용하여 염도 수준을 2개의 다른 군에서 조절하였다.
펩신 가용화 후 ECM 및 ECM 단편의 존재하에 펩신 용액의 잔여 단백질 분해 활성에 대한 pH 스위프의 효과. 탈세포화된 인간 태반 ECM을 진탕하면서 실온에서 5분, 4 또는 24시간 동안 0.1M HCl 추출 용액 중 1.0 mg/ml 펩신에서 50 mg/ml 농도로 가용화시켰다. 임의의 잔여 ECM을 원심분리에 의해 제거하고, 생성된 시험 샘플을 상기 언급된 pH 스위프로 처리하고, 잔여 펩신 활성을 상기 기술된 바와 같이 측정하였다. ECM의 첨가 없이 상응하는 펩신 용액을 사용하여 시간에 따른 펩신 활성 변화를 모니터링하였다.
시험 샘플 중 다양한 공지의 농도의 펩신에 대한 적정을 수행하여 문헌 [Anson et al. (J Gen Physiol, 1938. 22(1): p. 79-89)]에 기술된 통상적인 검정 포맷에 의해 규정된 작동 파라미터에서 헤모글로빈-기반 펩신 활성 검정의 민감성을 평가하였다. 흡수 변화가 증가하는 펩신 농도에 비례하여 증가하는 흡수율을 갖는 선형의 반응 양식을 따르는 것으로 밝혀졌다(도 3). 이러한 선형의 반응 양식은 0.75mg/ml 이하 펩신의 시험 샘플 농도에서 관찰되었다. 더 높은 농도는 아마도 10분의 반응 기간으로 현재 포맷에서 이러한 반응에 대해 이용가능한 헤모글로빈 기재의 한계로 인해 이러한 패턴을 따르지 않았다. 그럼에도 불구하고, 동일한 시험 그룹 내의 다양한 반복 실험 간의 변동성 수준은 놀랍게도 1% 미만으로 낮았으며, 독립된 실행 간의 재현성이 높은 것으로 밝혀졌다 (미도시됨). 시험 용액 중 0.1M HCl 중의 0.75mg/ml 펩신의 작업 농도를 모든 후속 실험에 대해 선택하여 모든 검정이 이러한 선형 영역 내에 속하는 펩신 농도에서 수행되는 것을 보장하였다.
첫 번째 세트의 실험은 ECM의 부재하에 펩신 용액의 가역적 및 비가역적 활성에 대한 pH 스위프의 효과를 평가하였다. 규정된 펩신 용액을 다시 pH2.0으로 복귀시키기 전에 pH7.4의 중성 pH 또는 pH8.2의 증가된 염기성 pH 중 어느 하나로의 제어된 pH 스위프로 처리하였다 (도 4a 및 4b). 두 pH 스위프가 시험 샘플의 잔여 펩신 활성에서의 현저한 감소를 유도하였다. 그러나, 중성 pH 스위프로 처리된 시험 샘플은 이의 펩신 활성의 34.5±1.2%를 유지하였으며, 이는 pH 스위프는 비가역적 펩신 불활성화를 유도하지 않았음을 나타낸다. 반대로, pH8.2의 염기성 pH 스위프로 처리된 시험 샘플 중의 잔여 펩신 활성은 현저하게 더 낮았으며, 이는 샘플 원래 펩신 활성의 5.2±1.0%의 잔여 활성을 보여준다.
샘플의 잔여 펩신 활성에 대한 펩신 가용화 후 ECM 및 ECM 분해 생성물의 효과 및 두 pH 스위프 후 펩신 불활성화에 대한 이들의 효과를 평가하기 위해 두 번째 세트의 실험을 완료하였다. 인간 태반 ECM을 펩신 용액에 현탁시키고 24시간 이하 동안 인큐베이션하였다. 초기 시점 (5분 인큐베이션)은 제한된 ECM 가수분해를 갖는 상태를 나타내며, 여기에서 임의의 관찰된 효과는 고형물 ECM의 존재와 일반적으로 관련될 수 있는 것으로 추정되었다. 소량의 ECM 분해 생성물은 단지 작은 역할만을 담당하는 것으로 예상된다. 이에 반해, 후기 시점 (24시간의 인큐베이션)은 ECM 및 ECM 분해 생성물 둘 모두에 의해 초래된 효과를 평가할 것으로 예측되었다. ECM의 존재 없이 펩신 용액의 인큐베이션은 시간 경과에 따른 점진적인 활성 손실을 유도하였다(도 5). 이러한 활성 저하는 생물학적 및 생화학적 활성 화합물에서 일반적이며, 용액에서 시간 경과에 따른 활성 단백질의 점진적인 변성에 기인할 수 있다. 유사한 패턴이 ECM-함유 샘플에 대해 관찰되었다(도 6). 흥미롭게도, ECM-함유 시험 샘플은 ECM 부재의 시험 샘플보다 더 높은 수준의 단백질 분해 활성을 나타냈다. 이러한 차이는 존재하는 다른 단백질분해 활성 효소에 의해 초래될 수 있다. 그러나, 단백질분해 활성이 ECM-비함유 시험 샘플에서 관찰된 수준과 동일한 경우, 이들 두 그룹 간의 이러한 차이는 24시간 인큐베이션 후 관찰될 수 없었으며, 이는 이러한 프로테아제가 또한 효소 변성 사건에 민감할 수 있음을 시사한다.
ECM-함유 시험 샘플을 중성 pH(pH 7.2) 또는 염기성 pH(pH8.2) 중 어느 하나로의 두 pH 스위프로 처리하여 ECM 및 EMC 분해 생성물의 존재하에 펩신 불활성화에 대한 이들의 효과를 평가하였다. 모든 시점에서, 두 pH 스위프는 시험 샘플의 잔여 펩신 활성에서의 현저한 감소를 유도하였다. 그러나, 중성 pH 스위프(pH7.2)로 처리된 시험 샘플은 이의 단백질 분해 활성의 29.5±5.6% 내지 35.3±8.2%를 유지하는 반면, pH 8.2의 염기성 pH 스위프로 처리된 시험 샘플은 샘플 원래의 펩신 활성의 11.3±5.4% 내지 0.6±8.9%의 현저하게 더 낮은 수준의 잔여 단백질 분해 활성을 보였다. 각 pH 스위프 동안 펩신 억제 수준은 표 1에 약술된 바와 같이 ECM의 존재 (5분) 또는 잠재적으로 억제성인 ECM 분해 생성물의 증가하는 수준 (4 또는 24시간의 인큐베이션)에 의해 영향을 받지 않았다.
표 1. 태반 ECM 및 ECM 분해 생성물의 존재하에 펩신 활성의 상대적 변화
본 연구는 하기 발견을 강조하였다: 1) 중성 pH (pH7.4)에 걸친 pH 스위프는 단지 펩신의 부분적 불활성화 및 샘플 원래의 펩신 활성의 대략 35%의 보유를 유도함, 2) 염기성 pH(pH8.2)에 걸친 pH 스위프는 펩신의 거의 완전한 불활성화를 유도함, 3) ECM 및/또는 ECM-분해 생성물의 존재는 펩신 불활성화를 유도하지 않음.
실시예 21: 인간 태반-유래 기질의 생물학적 시험
온도 민감성 인간 태반-유래 기질을 실시예 1에 기술된 방법에 따라 제조하였으며, 다양한 유형의 세포 배양을 지지하기 위한 기재로서 평가하였다. 이러한 시험 기질은 온도-의존적 방식으로 겔로 변하였다.
조작.
희석. -80℃에서 보관된 시험 기질(대략 5mg/ml)의 스톡액을 액체 상태로 시험 기질을 유지하기 위해 얼음 위에서 서서히 해동시켰다. 그 후, 시험 기질 용액을 얼음 상에서 4℃에서 DPBS 또는 DMEM 중 어느 하나를 사용하여 1:2 (2.5mg/ml), 1:5 (1mg/ml), 1:10 (0.5mg/ml), 1:15 (0.33mg/ml), 1:30 (0.16mg/ml) 또는 1:50 (0.1 mg/ml)으로 희석하였다.
코팅. 다양한 농도의 시험 기질을 조직 배양 플라스틱 플레이트에 직접 적용하고, 24시간 동안 실온 또는 4℃에 위치시켜 (6 웰 플레이트에 있어서 1ml/웰; 12 웰 플레이트에 있어서 500ul/웰) 시험 기질에 의해 코팅된 플레이트를 수득하였다. pH8.0의 시험 기질 용액은 pH6.0의 시험 기질 용액보다 조직 배양 플라스틱 플레이트 상에 더욱 균질한 단백질 입자 코팅을 만들었다.
시험 기질 상의 세포 배양.
세포 시딩. 세포 배양 배지를 세포 시딩 전에 시험 기질로 코팅된 플레이트에 분배하였다.
인간 iPSC 배양. 인간 iPSC는 덩어리로 계대하고 단일 세포로 분해하지 않았다. 유사한 수의 iPSC 덩어리를 대조군 기질인 MATRIGEL (Corning Incorporated, Tweksbury, MA)에 의해 코팅된 플레이트와 비교하여 다양한 농도의 시험 기질로 코팅된 플레이트 상에 시딩하였다. 성공적으로 부착된 콜로니 수는 두 기질 상으로의 iPSC 시딩 후 일(1)일에 계수하였다.
시험 기질 상의 인간 iPSC의 분화 유도.
iPSC의 계통-특이적 분화. iPSC 분화 유도는 콜라게나제 IV 처리에 의한 배아체를 형성함으로써 개시되었다. 특이적 분화 유도 배지 조건하에 현탁 배양으로 분화하는 EB를 추가의 숙성을 위해 시험 기질로 코팅된 조직 배양 플레이트 상에 플레이팅하였다. 신경 분화 및 심근세포 분화를 연구하였다.
신경 분화. 신경 계통으로의 분화 안내된 EB를 N2/B27의 존재하에 7일 동안 현탁액에 배양시키고, 이어서 N2/B27 및 bFGF 처리로의 7-10일 동안의 추가적인 숙성을 위해 시험 기질로 코팅된 플레이트 상에 플레이팅하였다.
심근세포 분화. 초기 EB 현탁 배양을 7일 동안 BMP-4 및 Activin A로의 처리에 의해 수행하고, 이어서 추가의 10-14일 동안 BMP-4, Activin-A, bFGF 및 아스코르브산의 존재하에 시험 기질로 코팅된 플레이트 상에 플레이팅하였다.
마커 발현에 의한 분화된 세포의 특성 규명. iPSC-유래된 신경 세포 또는 심근세포를 신경(Nestin, A2B5, Tuj-1)- 또는 심근세포-특이적 마커로 염색함으로써 확인하고 이어서 이미징 또는 유동 세포계측에 의해 검출하였다.
시험 기질 상으로의 세포 부착 (pH 의존성).
인간 iPSC를 시험 기질로 코팅된 플레이트 상에 플레이팅하였다. 인간 iPSC 콜로니를 90% 초과로 pH8.0의 시험 기질에 성공적으로 부착시킨 반면, pH6.0의 시험 기질은 단지 약 40%의 iPSC 콜로니 부착만을 지지할 수 있었다.
Claims (29)
- 중화된 태반-유래 기질 생성물을 제조하는 방법으로서,
(a) 태반 조직을 탈활력화(devitalizing)시켜 탈활력화된 태반 조직을 생성하는 단계,
(b) 펩신 및 염산염(HCl)을 가지는 분해 용액에서 탈활력화된 태반 조직을 분해하여 태반-유래 기질을 생성하는 단계,
(c) 단계 (b)의 태반-유래 기질의 pH를 8.0으로 조절하여, 펩신을 비가역적으로 불활성화시키는 단계;
(d) 단계 (c)의 태반 유래 기질의 pH를 7.0-7.2로 조절하여 중화된 태반-유래 기질을 제조하는 단계; 및
(e) 중화된 태반-유래 기질을 동결건조하여 스폰지 구조를 생성하고, 이를 아세트산에서 용해시켜 태반-유래 용액을 생성하고, 중화하며, 다시 하이드로겔로 주조하여, 중화된 태반-유래 기질 생성물을 제조하는 단계로서, 여기서 상기 중화된 태반-유래 기질 생성물은 만능 줄기 세포 또는 조직-특이적 전구 세포의 성장 및/또는 분화를 촉진하기 위한 것인, 단계를 포함하는, 방법. - 제1항에 있어서, 단계 (a)가 태반 조직을 비-변성 세정제로 처리하는 것을 포함하는 방법.
- 제1항에 있어서, 탈활력화된 태반 조직을 균질화시키는 것을 추가로 포함하는 방법.
- 제3항에 있어서, 탈활력화된 태반 조직이 4℃에서 균질화되는 방법.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 분해 용액 중 펩신의 농도는 400 내지 700단위/ml이며, 분해 용액 중 HCl의 농도는 0.01 M 내지 1.0 M인 방법.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 중화된 태반-유래 기질 생성물 상에 또는 내에 세포를 배양하는 단계, 및 중화된 태반-유래 기질 생성물 상에 또는 내에 세포를 저장하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
- 제6항에 있어서, 중화된 태반-유래 기질 생성물 상에 또는 내의 세포가 냉동보존에 의해 저장되는 방법.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 중화된 태반-유래 기질 생성물에 단백질을 노출시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 중화된 태반-유래 기질 생성물 상에 또는 내에서 만능 줄기 세포 또는 조직-특이적 전구 세포를 배양하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 기재 표면의 적어도 일부를 중화된 태반-유래 기질 생성물로 코팅하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
- 제10항에 있어서, 탈활력화된 태반 조직 중의 DNA 양이 단계 (a) 전의 태반 조직 중의 DNA 양과 비교하여 적어도 90% 감소되는 방법.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 중화된 태반-유래 기질 생성물은 4℃ 내지 40℃ 범위의 용액에서 겔로의 전이 온도를 가지는 방법.
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