JPWO2019064807A1 - コラーゲンビトリゲル及びその精製物の製造方法並びに当該方法により得られたコラーゲンビトリゲル及びその精製物 - Google Patents
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- A61L27/3604—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix characterised by the human or animal origin of the biological material, e.g. hair, fascia, fish scales, silk, shellac, pericardium, pleura, renal tissue, amniotic membrane, parenchymal tissue, fetal tissue, muscle tissue, fat tissue, enamel
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Abstract
Description
ブタ皮膚由来アテロコラーゲン(日本ハム(株)#NMPコラーゲンPS)2gを滅菌水200mLに溶解し、1w/v%コラーゲン溶液を調製した。
リン酸緩衝生理食塩水(D‐PBS(−);和光純薬工業(株)#045‐29795)500mLに炭酸水素ナトリウム(和光純薬工業(株)#191‐01305)1.85gを加えて溶解しゲル化剤とした。
50mL容量のコニカルチューブ(コーニング#352070)に、ゲル化剤と1w/v%コラーゲン溶液をそれぞれ20mL採り、均一に混和し、これをコラーゲンゾルとした。コラーゲンゾルの調製は氷冷下で行った。次いで、ポリスチレン角型シャーレ(アズワン(株)#D210‐16)にアクリル円筒鋳型((株)コスモスビード、外径38.8mm×内径34.8mm×高さ30.0mm)を置き、この鋳型内にコラーゲンゾル10mLを充填した。37℃の恒温機内に2時間静置してコラーゲンを線維化させ、コラーゲンゲルを得た。
塩化ナトリウム(和光純薬工業(株)#191‐01665)3.21g、リン酸二水素カリウム(和光純薬工業(株)#169‐04245)3.40g、炭酸水素ナトリウム1.85gを採り、滅菌水500mLに溶解し、これをゲル化剤とした。
ゲル化剤を上記ゲル化剤に変更した以外は、実施例1と同様な方法でコラーゲンビトリゲル及び精製コラーゲンビトリゲル(乾燥体)を調製した。
塩化ナトリウム3.21g、炭酸水素ナトリウム1.85gを採り、滅菌水500mLに溶解し、これをゲル化剤とした。
ゲル化剤を上記ゲル化剤に変更した以外は、実施例1と同様な方法でコラーゲンビトリゲル及び精製コラーゲンビトリゲル(乾燥体)を調製した。
リン酸緩衝生理食塩水500mLに炭酸水素ナトリウム0.42gを加えて溶解しゲル化剤とした。
ゲル化剤を上記ゲル化剤に変更した以外は、実施例1と同様な方法でコラーゲンビトリゲル及び精製コラーゲンビトリゲル(乾燥体)を調製した。
リン酸緩衝生理食塩水500mLに炭酸水素ナトリウム0.84gを加えて溶解しゲル化剤とした。
ゲル化剤を上記ゲル化剤に変更した以外は、実施例1と同様な方法でコラーゲンビトリゲル及び精製コラーゲンビトリゲル(乾燥体)を調製した。
リン酸緩衝生理食塩水500mLに炭酸水素ナトリウム2.27gを加えて溶解しゲル化剤とした。
ゲル化剤を上記ゲル化剤に変更した以外は、実施例1と同様な方法でコラーゲンビトリゲル及び精製コラーゲンビトリゲル(乾燥体)を調製した。
リン酸緩衝生理食塩水500mLに炭酸水素ナトリウム0.42gと炭酸ナトリウム(和光純薬工業(株)#196‐01595)0.53gを加えて溶解しゲル化剤とした。
ゲル化剤を上記ゲル化剤に変更した以外は、実施例1と同様な方法でコラーゲンビトリゲル及び精製コラーゲンビトリゲル(乾燥体)を調製した。
リン酸緩衝生理食塩水500mLに炭酸水素ナトリウム1.85gと炭酸ナトリウム0.53gを加えて溶解しゲル化剤とした。
ゲル化剤を上記ゲル化剤に変更した以外は、実施例1と同様な方法でコラーゲンビトリゲル及び精製コラーゲンビトリゲル(乾燥体)を調製した。
リン酸緩衝生理食塩水500mLに炭酸水素ナトリウム2.94gを加えて溶解しゲル化剤とした。
ゲル化剤を上記ゲル化剤に変更した以外は、実施例1と同様な方法でコラーゲンビトリゲル及び精製コラーゲンビトリゲル(乾燥体)を調製した。
塩化ナトリウム3.21g、炭酸水素ナトリウム0.46gを採り、滅菌水500mLに溶解し、これをゲル化剤とした。
ゲル化剤を上記ゲル化剤に変更した以外は、実施例1と同様な方法でコラーゲンビトリゲル及び精製コラーゲンビトリゲル(乾燥体)を調製した。
塩化ナトリウム3.21g、炭酸水素ナトリウム0.84gを採り、滅菌水500mLに溶解し、これをゲル化剤とした。
ゲル化剤を上記ゲル化剤に変更した以外は、実施例1と同様な方法でコラーゲンビトリゲル及び精製コラーゲンビトリゲル(乾燥体)を調製した。
塩化ナトリウム3.21g、炭酸水素ナトリウム2.52gを採り、滅菌水500mLに溶解し、これをゲル化剤とした。
ゲル化剤を上記ゲル化剤に変更した以外は、実施例1と同様な方法でコラーゲンビトリゲル及び精製コラーゲンビトリゲル(乾燥体)を調製した。
塩化ナトリウム3.21g、炭酸水素ナトリウム2.94gを採り、滅菌水500mLに溶解し、これをゲル化剤とした。
ゲル化剤を上記ゲル化剤に変更した以外は、実施例1と同様な方法でコラーゲンビトリゲル及び精製コラーゲンビトリゲル(乾燥体)を調製した。
塩化ナトリウム3.21g、炭酸水素ナトリウム3.36gを採り、滅菌水500mLに溶解し、これをゲル化剤とした。
ゲル化剤を上記ゲル化剤に変更した以外は、実施例1と同様な方法でコラーゲンビトリゲル及び精製コラーゲンビトリゲル(乾燥体)を調製した。
塩化ナトリウム3.21g、塩化カリウム(和光純薬工業(株)#163‐03545)0.10g、塩化カルシウム(和光純薬工業(株)#039‐00475)0.10g、リン酸二水素ナトリウム一水和物(Millipore#10049-21-5)0.07g、炭酸水素ナトリウム0.42g、炭酸ナトリウム0.53gを採り、滅菌水500mLに溶解し、これをゲル化剤とした。
ゲル化剤を上記ゲル化剤に変更した以外は、実施例1と同様な方法でコラーゲンビトリゲル及び精製コラーゲンビトリゲル(乾燥体)を調製した。
塩化ナトリウム3.21g、塩化カリウム0.10g、塩化カルシウム0.10g、リン酸二水素ナトリウム一水和物0.07g、炭酸水素ナトリウム1.85g、炭酸ナトリウム1.59gを採り、滅菌水500mLに溶解し、これをゲル化剤とした。
ゲル化剤を上記ゲル化剤に変更した以外は、実施例1と同様な方法でコラーゲンビトリゲル及び精製コラーゲンビトリゲル(乾燥体)を調製した。
塩化ナトリウム1.17g、炭酸水素ナトリウム4.62gを採り、滅菌水500mLに溶解し、これをゲル化剤とした。
ゲル化剤を上記ゲル化剤に変更した以外は、実施例1と同様な方法でコラーゲンビトリゲル及び精製コラーゲンビトリゲル(乾燥体)を調製した。
塩化ナトリウム3.21g、塩化カリウム0.10g、塩化カルシウム0.10g、リン酸二水素ナトリウム一水和物0.07g、炭酸水素ナトリウム0.42gを採り、滅菌水500mLに溶解し、これをゲル化剤とした。
ゲル化剤を上記ゲル化剤に変更した以外は、実施例1と同様な方法でコラーゲンビトリゲル及び精製コラーゲンビトリゲル(乾燥体)を調製した。
塩化ナトリウム3.21g、塩化カリウム0.10g、塩化カルシウム0.10g、リン酸二水素ナトリウム一水和物0.07g、炭酸水素ナトリウム0.84gを採り、滅菌水500mLに溶解し、これをゲル化剤とした。
ゲル化剤を上記ゲル化剤に変更した以外は、実施例1と同様な方法でコラーゲンビトリゲル及び精製コラーゲンビトリゲル(乾燥体)を調製した。
塩化ナトリウム3.21g、塩化カリウム0.10g、塩化カルシウム0.10g、リン酸二水素ナトリウム一水和物0.07g、炭酸水素ナトリウム1.68gを採り、滅菌水500mLに溶解し、これをゲル化剤とした。
ゲル化剤を上記ゲル化剤に変更した以外は、実施例1と同様な方法でコラーゲンビトリゲル及び精製コラーゲンビトリゲル(乾燥体)を調製した。
塩化ナトリウム3.21g、塩化カリウム0.10g、塩化カルシウム0.10g、リン酸二水素ナトリウム一水和物0.07g、炭酸水素ナトリウム2.52gを採り、滅菌水500mLに溶解し、これをゲル化剤とした。
ゲル化剤を上記ゲル化剤に変更した以外は、実施例1と同様な方法でコラーゲンビトリゲル及び精製コラーゲンビトリゲル(乾燥体)を調製した。
塩化ナトリウム3.21g、塩化カリウム0.10g、塩化カルシウム0.10g、リン酸二水素ナトリウム一水和物0.07g、炭酸水素ナトリウム3.36gを採り、滅菌水500mLに溶解し、これをゲル化剤とした。
ゲル化剤を上記ゲル化剤に変更した以外は、実施例1と同様な方法でコラーゲンビトリゲル及び精製コラーゲンビトリゲル(乾燥体)を調製した。
塩化ナトリウム3.21g、塩化カリウム0.10g、塩化カルシウム0.10g、リン酸二水素ナトリウム一水和物0.07g、炭酸水素ナトリウム4.20gを採り、滅菌水500mLに溶解し、これをゲル化剤とした。
ゲル化剤を上記ゲル化剤に変更した以外は、実施例1と同様な方法でコラーゲンビトリゲル及び精製コラーゲンビトリゲル(乾燥体)を調製した。
塩化ナトリウム3.21g、塩化カリウム0.10g、塩化カルシウム0.10g、リン酸二水素ナトリウム一水和物0.07g、炭酸ナトリウム0.53gを採り、滅菌水500mLに溶解し、これをゲル化剤とした。
ゲル化剤を上記ゲル化剤に変更した以外は、実施例1と同様な方法でコラーゲンビトリゲル及び精製コラーゲンビトリゲル(乾燥体)を調製した。
塩化ナトリウム3.21g、塩化カリウム0.10g、塩化カルシウム0.10g、リン酸二水素ナトリウム一水和物0.07g、炭酸ナトリウム1.06gを採り、滅菌水500mLに溶解し、これをゲル化剤とした。
ゲル化剤を上記ゲル化剤に変更した以外は、実施例1と同様な方法でコラーゲンビトリゲル及び精製コラーゲンビトリゲル(乾燥体)を調製した。
塩化ナトリウム3.21g、塩化カリウム0.10g、塩化カルシウム0.10g、リン酸二水素ナトリウム一水和物0.07g、炭酸水素ナトリウム0.84g、炭酸ナトリウム0.27gを採り、滅菌水500mLに溶解し、これをゲル化剤とした。
ゲル化剤を上記ゲル化剤に変更した以外は、実施例1と同様な方法でコラーゲンビトリゲル及び精製コラーゲンビトリゲル(乾燥体)を調製した。
塩化ナトリウム3.21g、塩化カリウム0.10g、塩化カルシウム0.10g、リン酸二水素ナトリウム一水和物0.07g、炭酸水素ナトリウム0.84g、炭酸ナトリウム0.53gを採り、滅菌水500mLに溶解し、これをゲル化剤とした。
ゲル化剤を上記ゲル化剤に変更した以外は、実施例1と同様な方法でコラーゲンビトリゲル及び精製コラーゲンビトリゲル(乾燥体)を調製した。
塩化ナトリウム3.21g、塩化カリウム0.10g、塩化カルシウム0.10g、リン酸二水素ナトリウム一水和物0.07g、炭酸水素ナトリウム0.84g、炭酸ナトリウム1.06gを採り、滅菌水500mLに溶解し、これをゲル化剤とした。
ゲル化剤を上記ゲル化剤に変更した以外は、実施例1と同様な方法でコラーゲンビトリゲル及び精製コラーゲンビトリゲル(乾燥体)を調製した。
リン酸緩衝生理食塩水500mLに炭酸水素ナトリウム0.21gを加えて溶解しゲル化剤とした。
ゲル化剤を上記ゲル化剤に変更した以外は、実施例1と同様な方法でコラーゲンビトリゲル及び精製コラーゲンビトリゲル(乾燥体)を調製した。
ハンクス緩衝塩類溶液(HBSS(−);和光純薬工業(株)#085‐09355)500mLに炭酸ナトリウム0.85gを加えて溶解しゲル化剤とした。
ゲル化剤を上記ゲル化剤に変更した以外は、実施例1と同様な方法でコラーゲンビトリゲル及び精製コラーゲンビトリゲル(乾燥体)を調製した。
塩化ナトリウム3.21g、塩化カリウム0.10g、塩化カルシウム0.10g、リン酸二水素ナトリウム一水和物0.07g、炭酸ナトリウム0.27gを採り、滅菌水500mLに溶解し、これをゲル化剤とした。
ゲル化剤を上記ゲル化剤に変更した以外は、実施例1と同様な方法でコラーゲンビトリゲル及び精製コラーゲンビトリゲル(乾燥体)を調製した。
ダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)490mLに1mol/L HEPES(4−(2−ヒドロキシエチル)−1−ピペラジンエタンスルホン酸);Thermo Fisher Scientific#15630‐080)10mLを加え、均一に混和し、これをゲル化剤とした。
50mL容量のコニカルチューブに上記ゲル化剤と実施例1の1w/v%コラーゲン溶液をそれぞれ20mL採り、均一に混和し、これをコラーゲンゾルとした。コラーゲンゾルの調製は氷冷下で行った。次いでポリスチレン角型シャーレにアクリル円筒鋳型を置き、この鋳型内にコラーゲンゾル10mLを充填した。37℃の炭酸ガスインキュベーター(CO2 5%)内に2時間静置してコラーゲンを線維化させ、コラーゲンゲルを得た。
ゲル化剤をD‐PBS(−)に変更した以外は、実施例1の方法でコラーゲンビトリゲルの調製を試みた。しかし、一度はゲル化したコラーゲンゲルがその後の工程において溶解、ゾル化したためにコラーゲンゲル乾燥体として回収できず、コラーゲンビトリゲルを得られなかった。
塩化ナトリウム8.77gを採り、滅菌水500mLに溶解し、これをゲル化剤とした。
ゲル化剤を上記ゲル化剤に変更した以外は、実施例1の方法でコラーゲンビトリゲルの調製を試みた。しかし、一度はゲル化したコラーゲンゲルがその後の工程において溶解、ゾル化したためにコラーゲンゲル乾燥体として回収できず、コラーゲンビトリゲルを得られなかった。
塩化ナトリウム1.75g、リン酸二水素ナトリウム一水和物0.14g、リン酸水素二ナトリウム(和光純薬工業(株)#197‐02865)1.35gを採り、滅菌水500mLに溶解し、これをゲル化剤とした。
ゲル化剤を上記ゲル化剤に変更した以外は、実施例1の方法でコラーゲンビトリゲルの調製を試みた。しかし、一度はゲル化したコラーゲンゲルがその後の工程において溶解、ゾル化したためにコラーゲンゲル乾燥体として回収できず、コラーゲンビトリゲルを得られなかった。
ゲル化剤をHBSS(−)に変更した以外は、実施例1の方法でコラーゲンビトリゲルの調製を試みた。しかし、コラーゲンがゲル化しなかったためにコラーゲンゲルを得られず、コラーゲンビトリゲルを得られなかった。
HBSS(−)500mLに炭酸ナトリウム2.12gを加えて溶解しゲル化剤とした。
ゲル化剤を上記ゲル化剤に変更した以外は、実施例1の方法でコラーゲンビトリゲルの調製を試みた。しかし、コラーゲンがゲル化しなかったためにコラーゲンゲルを得られず、コラーゲンビトリゲルを得られなかった。
HBSS(−)500mLに炭酸ナトリウム4.24gを加えて溶解しゲル化剤とした。
ゲル化剤を上記ゲル化剤に変更した以外は、実施例1の方法でコラーゲンビトリゲルの調製を試みた。しかし、コラーゲンがゲル化しなかったためにコラーゲンゲルを得られず、コラーゲンビトリゲルを得られなかった。
塩化ナトリウム3.21g、塩化カリウム0.10g、塩化カルシウム0.10g、リン酸二水素ナトリウム一水和物0.07gを採り、滅菌水500mLに溶解し、これをゲル化剤とした。
ゲル化剤を上記ゲル化剤に変更した以外は、実施例1の方法でコラーゲンビトリゲルの調製を試みた。しかし、コラーゲンがゲル化しなかったためにコラーゲンゲルを得られず、コラーゲンビトリゲルを得られなかった。
塩化ナトリウム3.21g、塩化カリウム0.10g、塩化カルシウム0.10g、リン酸二水素ナトリウム一水和物0.07g、炭酸水素ナトリウム0.21gを採り、滅菌水500mLに溶解し、これをゲル化剤とした。
ゲル化剤を上記ゲル化剤に変更した以外は、実施例1の方法でコラーゲンビトリゲルの調製を試みた。しかし、コラーゲンがゲル化しなかったためにコラーゲンゲルを得られず、コラーゲンビトリゲルを得られなかった。
塩化ナトリウム3.21g、塩化カリウム0.10g、塩化カルシウム0.10g、リン酸二水素ナトリウム一水和物0.07g、炭酸ナトリウム2.12gを採り、滅菌水500mLに溶解し、これをゲル化剤とした。
ゲル化剤を上記ゲル化剤に変更した以外は、実施例1の方法でコラーゲンビトリゲルの調製を試みた。しかし、コラーゲンがゲル化しなかったためにコラーゲンゲルを得られず、コラーゲンビトリゲルを得られなかった。
実施例1〜31及び比較例1〜10のコラーゲンゾルに含まれる無機化合物の濃度とそのイオン強度及びpH、実施例1〜3、実施例8、実施例10、実施例12、実施例18、実施例23〜25、実施例27、実施例29〜31及び比較例1の精製コラーゲンビトリゲル(水和体)の膜強度測定を下記方法により行った。この結果を表1〜表7に示す。
pHは、実施例1〜29及び比較例1〜10の、ゲル化前のコラーゲンゾルについて測定した。pH測定は、各コラーゲンゾル0.5mLをpHメーター((株)堀場製作所#LAQUAtwin AS−712)の測定電極皿に入れ、そのpHを測定することで行った。
コラーゲンゾルに含まれる化合物(コラーゲンを除く)のイオン種A、B、C...それぞれのモル濃度(mol/L)をmA、mB、mC...、それぞれの電荷数をZA、ZB、ZC...とするとき、そのコラーゲンゾルのイオン強度Iは下式で定義される。
実施例1〜3、実施例8、実施例10、実施例12、実施例18、実施例23〜25、実施例27、実施例29〜31及び比較例1の精製コラーゲンビトリゲル(水和体)の膜強度を測定した。精製コラーゲンビトリゲル(水和体)の膜強度は以下の方法により測定した。すなわち、直径34.8mmの精製コラーゲンビトリゲル(乾燥体)を8mlのD‐PBS(−)に浸漬して1時間再水和した。水和により得られた精製コラーゲンビトリゲル(水和体)を中央に直径5mmの穴の開いた直径50mmのアクリル板2枚で挟み固定した。この直径5mmの穴から覗く固定された膜に対して、直径1.0mmのステンレス製針を垂直に、3.0mm/minの速度で突き刺し、針が精製コラーゲンビトリゲル(水和体)を貫通するまでの最大応力(N)を小型卓上試験機((株)島津製作所#EZ‐SX、ロードセル最大荷重5N)を用いて測定した。精製コラーゲンビトリゲル(水和体)1つにつき3ヵ所について測定を行い、その平均値を最大応力(N)とした。この操作を3つの精製コラーゲンビトリゲル(水和体)に対して行い、3つの最大応力の平均値を膜強度(N)とした。
Claims (26)
- コラーゲンを、無機炭酸塩類と、無機塩化物および無機リン酸塩よりなる群から選ばれる化合物とを含有するゲル化剤でゲル化し、次いで得られたコラーゲンゲルをガラス化し、更にこれを水和処理に付すことを特徴とするコラーゲンビトリゲルの製造方法。
- 前記コラーゲンがブタ皮膚由来アテロコラーゲンである、請求項1に記載のコラーゲンビトリゲルの製造方法。
- コラーゲンとゲル化剤の混合物の25℃におけるpHが、6.2〜9.8である、請求項1または2記載のコラーゲンビトリゲルの製造方法。
- コラーゲンとゲル化剤の混合物中に含まれる化合物のイオン強度が、0.07〜0.22である、請求項1ないし3のいずれかの項記載のコラーゲンビトリゲルの製造方法。
- 前記無機炭酸塩類が無機炭酸塩または無機炭酸水素塩である請求項1ないし4のいずれかの項記載のコラーゲンビトリゲルの製造方法。
- 前記無機炭酸塩が、炭酸ナトリウムまたは炭酸カリウムである、請求項5記載のコラーゲンビトリゲルの製造方法。
- 前記無機炭酸水素塩が、炭酸水素ナトリウムまたは炭酸水素カリウムである、請求項5または6記載のコラーゲンビトリゲルの製造方法。
- 前記無機塩化物が、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化マグネシウムおよび塩化カルシウムよりなる群から選ばれる1種以上である、請求項1ないし7のいずれかの項記載のコラーゲンビトリゲルの製造方法。
- 前記無機リン酸塩が、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素二カリウム、リン酸二水素ナトリウム、リン酸二水素カリウムおよびリン酸二水素カルシウムよりなる群から選ばれる1種以上である、請求項1ないし8のいずれかの項に記載のコラーゲンビトリゲル製造方法。
- 前記ゲル化剤が、培地成分および有機緩衝剤成分由来の有機成分を含まないものである請求項1ないし9のいずれかの項記載のコラーゲンビトリゲル製造方法。
- 請求項1ないし10のいずれかの項記載の製造方法で調製したコラーゲンビトリゲルを、脱塩、平衡化することを特徴とする精製コラーゲンビトリゲル水和体の製造方法。
- 請求項11の製造方法で調製した精製コラーゲンビトリゲル水和体を、更に乾燥して再ガラス化することを特徴とする精製コラーゲンビトリゲル乾燥体の製造方法。
- 請求項12の製造方法で調製した精製コラーゲンビトリゲル乾燥体を、更に再水和することを特徴とする精製コラーゲンビトリゲル水和体の製造方法。
- 請求項1ないし10のいずれかの項記載の方法により得られるコラーゲンビトリゲル。
- 少なくとも請求項14記載のコラーゲンビトリゲルを含む生体移植材料。
- 使用前に細胞を担持しないものである、請求項15に記載の生体移植材料。
- 少なくとも請求項14記載のコラーゲンビトリゲルを含む医療用人工皮膚。
- 請求項第11項または請求項第13項のいずれかの項記載の方法により得られる精製コラーゲンビトリゲル水和体。
- 少なくとも請求項18記載の精製コラーゲンビトリゲル水和物を含む生体移植材料。
- 使用前に細胞を担持しないものである、請求項19に記載の生体移植材料。
- 少なくとも請求項18記載の精製コラーゲンビトリゲル水和物を含む医療用人工皮膚。
- 請求項第12項記載の方法により得られる精製コラーゲンビトリゲル乾燥体。
- 少なくとも請求項22記載の精製コラーゲンビトリゲル乾燥体を含む生体移植材料。
- 使用前に細胞を担持しないものである、請求項23に記載の生体移植材料。
- 少なくとも請求項22記載の精製コラーゲンビトリゲル乾燥体を含む医療用人工皮膚。
- コラーゲンを、無機炭酸塩類と、無機塩化物および無機リン酸塩からなる群より選ばれる化合物とを含有するゲル化剤でゲル化し、次いで得られたコラーゲンゲルをガラス化することにより得られるコラーゲンゲル乾燥体。
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