CN111265723A - 一种3d打印的皮肤及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种3D打印的皮肤及其制备方法，所述的皮肤自上而下由人造表皮层、脱细胞真皮支架和人造真皮层组成，其特征在于，所述的皮肤是由聚氨基酸水凝胶和透明质酸水凝胶经过双组分3D打印制备得到的。与现有技术相比，本发明具有如下优势：(1)该皮肤采用双组分材料复合打印成型，成型速度快，采用的螺旋状外接喷头，进一步的缩减了打印成型的时间，打印过程中不易塌陷且形状保持性好。(2)采用扫描确定的合适的形状大小和孔隙结构，且加入了脱细胞真皮支架，有利于细胞的长入和伤口的愈合，并提供了一定程度的机械支撑。

Description

一种3D打印的皮肤及其制备方法

技术领域

本发明涉及组织工程中的3D生物打印领域，具体涉及一种3D打印的皮肤及其制备方法。

背景技术

皮肤是人体最大的器官，是覆盖于体表的重要组织，是人体与外界环境接触的屏障，不仅承担着保护身体、排汗、感知等功能，而且维持着机体内环境的稳定。对于一些轻微的皮肤损伤，皮肤能够自我愈合恢复；但当皮肤遭受大面积严重的损伤(如烧伤)，如果仅是皮肤浅层受损，正常健康的人在伤口经过处理后，新皮肤会再生；但对于一些患有疾病的患者，如糖尿病，通过人体自我恢复显然不太现实，这时患者的受损皮肤就需要进行皮肤移植，过去通常采用自体或异体皮肤进行移植，前者将身体上其他部位上的皮肤移植到伤口处，这样会造成新的皮肤伤口，所以并不适合大面积创伤的皮肤移植；后者采用他人的皮肤进行移植，也存在着一些问题，首先异体皮肤存量不足，其次用别人的皮肤来移植患者的受损皮肤，将会引发道德上的思考，所以皮肤修复面临着皮源不足的巨大困难，这时组织工程人造皮肤为治疗皮肤损伤提供一种新思路。

传统的组织工程技术，对受损皮肤的修复主要是在预先设计好的生物支架材料上附着培养扩增后后的细胞，构成“细胞+支架”复合体，接着植入受损皮肤，随着细胞在伤口处的生长繁殖，支架材料逐渐降解，最后受损皮肤渐渐修复。虽然这种方法可以构建皮肤最简单结构，但是其组织结构、生物学表现与正常生理状态下皮肤相比存在较大的差距，无论数量还是质量都还不能完全满足临床修复的实际需要。目前来讲，传统组织工程所面临的一大难题是如何在三维尺度上精确控制不同种类细胞及细胞外基质的分布，并形成与人皮肤相似的多层次结构。

近年来，随着3D打印技术的出现，为组织工程技术的发展提供了一个新的思路，将3D打印技术与组织工程技术结合的3D生物打印技术逐渐被科研工作者们广泛运用。这项技术可以利用精确的3D打印平台，根据实际需求制造出合适的三维支架，并且能够同时在时间和空间上准确沉积不同种类的细胞，最终生成细胞生长、分化所需的多层次3D微环境结构。目前有很多科研工作者利用3D生物打印技术制造组织工程皮肤，但普遍存在以下问题：(1)固化成型方式或是利用材料温敏特性使之逐层固化，其缺陷是成型时间太长，可能会造成支架结构的塌陷，影响成型支架的性能；或是将光敏剂复合到材料中，打印的同时使用紫外光对挤出的材料进行照射，虽然其成型速度得到提升，但可能含有有毒成分的光敏剂和长时间的紫外光照射都会使材料中的细胞产生损伤；(2)大部分组织工程皮肤都是按照特定的参数生产出来的，可能会造成形状、大小以及孔隙结构等特征的偏差；(3)双组分材料的混合可能不够充分，导致混合后材料的部分区域因为缺乏有效的接触，不能快速的发生交联固化，导致支架发生倾斜塌陷，影响支架的成型形状。

发明内容

发明目的：本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种3D打印的皮肤。

本发明还要解决的技术问题是提供上述皮肤的制备方法。

为了解决上述技术问题，本发明公开了一种3D打印的皮肤，自上而下由人造表皮层、羊脱细胞真皮支架和人造真皮层组成，其中，所述的皮肤是通过聚氨基酸水凝胶和透明质酸制备得到的。

其中，所述的脱细胞真皮支架，其是将异种皮的毛发和细胞脱去，保留其纤维成分和组织得到的薄膜，以其为支架构建组织工程皮肤，其保留的基底膜结构有利于表皮分化和基膜形成，疏松的胶原结构有利于血管的长入。

其中，所述的纤维成分和组织为脱去毛发、皮下组织、表皮和细胞的剩余部分。

其中，所述的脱细胞真皮支架优选羊脱细胞真皮支架。

上述羊脱细胞真皮支架的制备方法为：选用健康成年白羊的羊皮，将羊皮除去皮下组织和毛发成分，保留表皮与真皮部分，再浸没于1mmol/L的氯化钠水溶液中，37℃恒温振荡24h脱去表皮以脱去表皮，37℃恒温振荡24h脱去表皮；再加入到25mL质量分数为0.1％乙基苯基聚乙二醇(NP-40)，常温下摇床持续震摇24h，脱去残余的细胞及碎片，以PBS缓冲液反复冲洗干净；浸没于25mL的质量分数为0.25％胰蛋白酶消化液中20min，用PBS缓冲液反复冲洗干净，即得羊脱细胞真皮基质支架。其中，胰蛋白酶消化液的酶活为1U/mL，U/mL：在上述反应条件下，每毫升胰蛋白酶消化液所具有的酶活力；酶活力：1分钟内转化1微摩尔底物所需的酶量为一个活力单位，即1U＝1μmol/min。

其中，所述的表皮层，其由角质形成细胞作为种子细胞与水凝胶载体复合后，通过双组分3D打印工艺打印在所述脱细胞真皮支架的上表面侧，角质形成细胞在培养基中分化形成的表皮层。

其中，所述的真皮层，其由皮肤成纤维细胞和血管内皮细胞作为种子细胞与带有细胞因子的水凝胶载体复合后，通过双组分3D打印工艺打印在所述脱细胞真皮支架的下表面侧，皮肤成纤维细胞和血管内皮细胞在培养基中分化形成的真皮层；其中，所述的细胞因子为促进血管生成、分化和促进神经生成、分化的相关因子，包括血管内皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、神经生长因子、转化生长因子β和肝细胞生长因子。

其中，所述的复合为种子细胞先与水凝胶前驱体混合，然后将两种或多种前驱体溶液混合进聚氨基酸水凝胶。

上述种子细胞的制备方法为：(a)角质形成细胞的制备：取自体皮片，将取下的自体皮片进行清洗消毒后切成碎块，浸入25mL 0.2％的中性蛋白酶(Dispace ii)消化酶水溶液中消化15min，取出皮片，浸入25mL乳酸钠林格氏液中，中和酶反应，于37℃，pH值6.7-7.2反应15-18min；取出反应后的皮片，将其浸没在质量分数为0.25％胰蛋白酶中，37℃消化30min，使其成为细胞悬液；将细胞悬液过滤，得到细胞液，离心去上清；将细胞接种到培养基中(0.25％胰蛋白酶和0.02％EDTA混合消化液25mL)，37℃、5％CO2培养6～10天，得到原代细胞；取原代细胞加入ROCK抑制剂(保持IC50时为10μmol/L)，经传代培养(培养基为0.25％胰蛋白酶、1640培养基(含10％小牛血清)，培养条件为37℃、5％CO2培养1～2周后得到表皮干细胞，再经分化培养(培养基为KSFM与DMEM培养基混合液，培养条件为37℃、5％CO2培养10-15天，得到角质形成细胞；(b)皮肤成纤维细胞的制备：取原代细胞经传代培养后得到真皮干细胞，再经分化培养，得到皮肤成纤维细胞；(c)血管内皮细胞取自于异体的脐带血管内皮。其中，Dispace ii消化酶的酶活性为1.8U/mL；酶活定义为U/mL：在上述反应条件下，每毫升Dispace ii消化酶所具有的酶活力；酶活力：1分钟内转化1微摩尔底物所需的酶量为一个活力单位，即1U＝1μmol/min。

其中，所述的聚氨基酸水凝胶材料具备类似天然细胞外基质的某些特性，例如高润滑、高含水、良好的生物相容性、仿似细胞外基质(ECM)的3D微环境等多方面优良特性。与种子细胞复合后的聚氨基酸水凝胶材料能够为组织细胞的增殖、分化与生长提供营养支撑，且这种材料还可在人体皮肤上逐渐自行生物降解。

优选地，所述的聚氨基酸水凝胶是改性后的聚谷氨酸和聚赖氨酸复合的水凝胶。

其中，聚谷氨酸具有良好的水溶性，能很好的保持皮肤的湿度和弹性，其修饰基团与改性后的透明质酸发生反应后能迅速成型；所述的聚赖氨酸具有良好的杀菌能力和热稳定性，能有效抑制皮肤上细菌滋生；并且，当聚氨基酸水凝胶与透明质酸按照摩尔比为1：1复合时，其能够迅速固化成型，当摩尔比为1:1时，能够在数秒到数十秒固化成型。

其中，γ-PGA(聚谷氨酸)及ε-PL(聚赖氨酸)的大分子侧链上分别存在着大量的可电离-COOH和-NH2等官能团，不仅能被细胞表面的配体识别，有利于细胞的黏附，还能通过这些基团将蛋白质、多肽、氨基酸等具有生物活性的分子固定到材料表面，进一步提高材料的细胞亲和性。两种氨基酸的高分子侧链都能通过化学修饰从而具备修饰基团的部分化学性质，我们选择对聚谷氨酸进行化学修饰，而聚赖氨酸的加入是为了抑制皮肤细菌的滋生。

上述聚谷氨酸的改性方法为将聚谷氨酸溶于0.1mol/L，pH为4～6的2-(N-吗啡啉)乙磺酸缓冲液(MES缓冲液)，酸性条件下用1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺/N-羟基硫代琥珀酰亚胺(EDC/NHS)对聚谷氨酸活化后，再加入己二酸二酰肼和半胱氨盐酸盐反应。

其中，聚谷氨酸的浓度为60～120g/L；聚谷氨酸、EDC和NHS的的摩尔比为1：0.05～0.2：0.05～0.2；所述的活化为在pH4～6，37℃下活化1～2h；所述的己二酸二酰肼和半胱氨盐酸盐的摩尔比为1：0.6～0.8；己二酸二酰肼和半胱氨盐酸盐的总量与聚谷氨酸的质量比为1：2.4～3；所述的反应为在30～40℃，无氧条件下反应18～30h(优选24h)。

上述透明质酸的改性方法为将透明质酸溶于去离子水，加热后再加入甲基丙烯酸缩水甘油酯反应，然后降至室温，加入高碘酸钠进行氧化改性。

其中，所述的透明质酸的浓度为120～200g/L，透明质酸与甲基丙烯酸缩水甘油酯的摩尔比为1：0.6～0.8，加热的温度为50～70℃，所述的反应为50～70℃反应6～10h；高碘酸钠的浓度为0.0015mol/L；所述的氧化改性为在黑暗条件下25～30℃反应4～6h。

改性后的聚氨基酸水凝胶与透明质酸水凝胶复合后能够迅速固化，所采用的双组分材料交联固化的成型方式，既缩减了成型时间，又不会使细胞产生损伤。

上述的聚氨基酸水凝胶的制备方法为包括如下步骤：

(a)改性后的聚谷氨酸MES缓冲液即为第一缓冲液；将聚赖氨酸溶于MES缓冲液，得到第二缓冲液；将第二缓冲液滴加至第一缓冲液中，加入结合酶，采用酶溶液作为溶剂，反应；

(b)向步骤(a)得到的反应体系中加入EDC/NHS，冰浴反应后再室温反应，即得。

步骤(a)中，聚赖氨酸的浓度为24～60g/L；聚谷氨酸的浓度为60～120g/L；MES缓冲液的浓度为0.1mol/L，PH为4～6，所述的滴加为5～10mL/min；第一缓冲液和第二缓冲液的体积比为1:1；所述的结合酶为辣根过氧化物酶；酶活为200U/mL；U/mL：在上述反应条件下，每毫升辣根过氧化物酶所具有的酶活力；酶活力：1分钟内转化1微摩尔底物所需的酶量为一个活力单位，即1U＝1μmol/min。

步骤(a)中，结合酶的添加量为0.4mmol/L；所述的反应为室温反应10s～5min。

步骤(b)中，EDC/NHS的添加量均为0.15～0.2mol/L；冰浴反应的时间为20～40min(优选30min)；室温反应的时间为1～3h(优选2h)。

由于前后都加了EDC/NHS，但反应条件不同，聚谷氨酸、聚赖氨酸、EDC和NHS的最终的摩尔比为1：0.4～0.5：0.6～0.8：0.6～0.8。

上述3D打印的皮肤的制备方法，包括如下步骤：

(1)通过扫描与三维建模得到三维皮肤模型；

(2)制备墨水：将角质形成细胞与聚氨基酸水凝胶复合，得到第一墨水；将皮肤成纤维细胞、血管内皮细胞、细胞因子与聚氨基酸水凝胶复合，得到第二墨水；

(3)3D生物打印：利用带有双组分胶筒的3D打印机进行打印；

(4)培养，即得。

步骤(1)中，通过3D扫描仪对皮肤受损的创面进行扫描，得到皮肤受损的三维结构；使用三维数字化软件，如solidworks将得到的三维结构转化为三维建模，得到与皮肤受损部位相适用的三维皮肤模型。

步骤(3)中，所述的打印为包括如下步骤：(i)将第二墨水装入双组分胶筒的第一胶筒中，将透明质酸装入双组分胶筒的第二胶筒中，连接计算机，通过调试确定挤压参数后，利用计算机将三维皮肤模型中真皮层三维模型转换成生物3D打印机能够识别的STL格式图形文件，利用切片软件控制生物3D打印机在成型平台打印人造真皮层；(ii)将羊脱细胞真皮支架覆盖在人造真皮层上；(iii)取下第一胶筒和第二胶筒，将第一墨水装入双组分胶筒的第一胶筒中，将透明质酸装入双组分胶筒的第二胶筒，重复步骤(i)，在羊脱细胞真皮支架上打印人造表皮层。

步骤(i)中和步骤(iii)中，控制第一胶筒和第二胶筒中聚氨基酸水凝胶与透明质酸的摩尔比为1:1，体积比也为1:1，这样既能保证反应的充分，又可以使两种材料同步挤出；控制第一胶筒和第二胶筒的出料速率，使聚氨基酸水凝胶与透明质酸的摩尔比为1:1，当聚氨基酸水凝胶与透明质酸按照摩尔比为1：1复合时，其能够迅速固化成型。

步骤(4)中，所述的培养为将步骤(3)打印好的组织工程皮肤转移到培养基(添加10％体积分数胎牛血清的KSFM培养基)中，37℃恒温培养，培养基每隔一天更换一次；使种子细胞在支架上完全分化成长，进一步的促进血管以及毛囊、汗腺、皮脂腺等皮肤附属器的生成，待皮肤组织初步长成，即得。

皮肤的具体形状、大小以及合适的孔隙率可根据人体皮肤受损创面经扫描后的皮肤影像进行3D建模确定；且合适的多孔结构、形状大小以及羊脱细胞真皮支架都有利于细胞的的长入、营养物质与代谢物质的交换以及受损皮肤的愈合。

权利要求1所述皮肤的3D打印机也在本发明的保护范围之内。

其中，所述的打印机设有双组分胶筒，所述胶筒外接螺旋状的喷头外接喷头喷嘴的孔径为1mm，打印时可根据实际需求进一步外接其他孔径的喷头，其螺旋状的混合管内芯增加了喷头的有效长度，并且使双组分材料混合的更加均匀充分，双组分材料在混合管中提前混合，进一步缩短了成型时间。

其中，所述的3D打印机的推动方式包括螺杆推动和气压推动，所述的挤出方式包括1:1Y型混合挤出和同轴挤出。

有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下优势：

(1)该皮肤采用双组分材料复合打印成型，成型速度快，采用的螺旋状外接喷头，进一步的缩减了打印成型的时间，打印过程中不易塌陷且形状保持性好。

(2)该皮肤采用的材料不含有机溶剂和光敏成分，安全无毒，不会对细胞产生损伤；采用的材料具有良好的生物相容性和抗菌性，为细胞提供营养支撑的同时还可抑制细菌的滋生并在人体皮肤上自行降解。

(3)该皮肤采用扫描确定的合适的形状大小和孔隙结构，且加入了脱细胞真皮支架，有利于细胞的长入和伤口的愈合，并提供了一定程度的机械支撑。

(4)本发明的成型工艺较为成熟且所需设备简单，所采用的双组分材料也较容易获得，仅对两种材料进行化学修饰便可使双组分材料具备交联固化的特性，综合的打印成本较低。

附图说明

图1为双组分生物3D打印机设备结构示意图。

图2为螺杆推动所采用微型注射泵结构示意图。

图3为气压推动所采用气动AB胶枪示意图。

图4为AB胶筒外观示意图。

图5为同轴胶筒外观示意图。

图6为螺旋状外接喷头结构示意图。

图7为AB胶筒挤出系统示意图。

图8为培养长成的细胞结构示意图。

具体实施方式

根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，对于本领域的技术人员而言，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当作为对本发明的限制，一切以权利要求书为准。

实施例1：采用孔径为0.46mm的外接喷头打印皮肤

(1)3D扫描与皮肤建模

使用3D扫描仪对人体皮肤受损创面(2cm*2cm*6mm)进行扫描，得到皮肤受损部位的三维结构，再通过计算机辅助设计软件solidworks完成受损部位的三维分层建模，得到与皮肤受损部位相适用的3D皮肤模型。

(2)材料的配备

1)聚氨基酸水凝胶的制备

i.对聚谷氨酸的高分子侧链进行修饰改性，将4gγ-聚谷氨酸(0.031mol)溶解于50ml0.1mol/L的MES缓冲液(PH＝5)，搅拌至形成澄清溶液后，加入0.96g EDC(0.005mol)和0.58g NHS(0.005mol)在37℃下对聚谷氨酸进行活化80分钟后，加入1g己二酸二酰肼和0.5g半胱氨盐酸盐(两者的摩尔比为1：0.77)，在37℃下反应24小时，反应在无氧条件下进行。反应得到的改性后的聚谷氨酸MES缓冲液即为第一缓冲液。

ii.将1.78gε-聚赖氨酸(0.014mol)溶解于50ml 0.1mol/L的MES缓冲液(PH＝5)，搅拌至形成澄清溶液得到第二缓冲液；将第二缓冲液以8mL/min的滴加速率滴至第一缓冲液中，加入0.04mmol的辣根过氧化物酶，酶活为200U/mL，搅拌混合均匀，室温反应2min。

iii.将EDC/NHS交联剂(各0.017mol)加入到步骤(2)得到的反应体系中，冰浴反应搅拌30min，再室温反应搅拌2h形成聚谷氨酸/聚赖氨酸复合水凝胶。

聚谷氨酸、聚赖氨酸、EDC和NHS的最终的摩尔比为1：0.45：0.71：0.71。

2)透明质酸水凝胶的制备

对透明质酸进行修饰改性：将18.15g透明质酸(0.045mol)溶于100mL去离子水，水浴高温下(60℃)加入0.03mol甲基丙烯酸缩水甘油酯，反应8小时，然后降至室温，加入0.15mmol高碘酸钠进行氧化改性，所述的氧化改性为在黑暗条件下25℃反应5h。反应后得到的就是改性后的透明质酸水凝胶。

3)种子细胞的提取和培养

种子细胞取自自体皮片，将取下的自体皮片进行清洗消毒后切成碎块，置于消化酶水溶液中消化15分钟左右，取出放入乳酸钠林格氏液中和酶反应，接着将其浸没在0.25％胰蛋白酶中，37℃消化30min，使其成为细胞悬液。过滤得到细胞液，离心聚集细胞，再将细胞接种到培养皿，得到原代细胞，原代培养后取一部分原代细胞加入ROCK抑制剂经过传代培养后得到所需的表皮干细胞，再经过分化培养得到所需角质形成细胞；取一部分原代细胞，经过传代培养后得到所需真皮干细胞，再经过分化培养得到皮肤成纤维细胞。血管内皮细胞取自于异体的脐带血管内皮。

4)羊脱细胞真皮基质支架的制备

选用健康成年白羊羊皮，除去皮下组织和毛发成分，保留表皮与真皮部分，浸入氯化钠溶液中，37℃恒温振荡24h脱去表皮，以PBS缓冲液反复冲洗干净。

再加入到0.1％乙基苯基聚乙二醇(NP-40)中，常温下摇床持续震摇24h，脱去残余的细胞及碎片，以PBS缓冲液反复冲洗干净。再浸入0.25％胰蛋白酶消化液中20min，用PBS缓冲液反复冲洗干净，得到羊脱细胞真皮基质支架。

5)墨水制备

将制备的角质形成细胞与聚氨基酸水凝胶复合；将皮肤成纤维细胞、血管内皮细胞、血管内皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、神经生长因子等促进血管、神经的生成、分化的细胞因子与聚氨基酸水凝胶复合。

其中，所述的复合为种子细胞先与水凝胶前驱体(即制备上述聚氨基酸水凝胶时冰浴反应30min后的反应体系，此时反应体系呈溶液态)混合，然后将两种或多种前驱体溶液混合进聚氨基酸水凝胶。

(3)3D生物打印

将复合了皮肤成纤维细胞和血管内皮细胞的聚氨基酸水凝胶(第二墨水)装入双组分胶筒的第一胶筒，将透明质酸装入双组分胶筒的第二胶筒，控制墨水和透明质酸体积比和摩尔比相同，连接计算机，通过调试确定挤压参数后，利用计算机将三维皮肤模型中真皮层三维模型转换成生物3D打印机能够识别的STL格式图形文件，利用切片软件控制生物3D打印机在成型平台打印真皮层，真皮层打印六层的高度，每层厚度和喷头孔径相同；接着将羊脱细胞真皮支架覆盖在真皮层上；取下用过的胶筒，将复合了角质形成细胞的聚氨基酸水凝胶(第一墨水)装入双组分胶筒的一个胶筒，将透明质酸装入双组分胶筒的第二个胶筒，控制墨水和透明质酸体积比和摩尔比相同，重复上述步骤，表皮层打印四层的高度，每层厚度和喷头孔径相同；将表皮层覆盖在羊脱细胞真皮基质支架上。

(3)10min后，组织工程皮肤打印好，然后将其转移到培养基中，在恒温箱气液界面进行培养，保持温度在37℃，培养基每隔一天更换一次。待皮肤组织初步长成，再将其移植到皮肤受损部位进行皮肤修复。

如图1、图2和图4所示，本实施例步骤(3)中，采用螺杆推动和1:1Y型混合挤出的方式打印皮肤，其中，11为生物3D打印机的XYZ轴运动模块，12为微型注射泵的固定位置，13为气动AB胶枪的固定位置；21为步进电机，22为固定螺孔，23为挤出胶筒；41为AB胶筒，42为AB胶筒喷嘴槽口，用于固定外接喷头。

本实施例将22固定在12上，选择41作为挤出胶筒安装在23的位置。3D生物打印机的XYZ轴运动模块11控制微型注射泵按特定轨迹运行，微型注射泵上的步进电机控制螺杆推进胶筒中的活塞进而稳定均匀的挤出材料。

其中，出胶筒的喷嘴草设有外接喷头，图6为螺旋状外接喷头结构示意图，其长度为53mm，出胶口径为1mm。其中61为卡座，611为卡座进料口的截面图，612为卡口，使用时将卡口套在AB胶筒喷嘴槽口42上；62a为A组分进料口，62b为B组分进料口；63为混合管内芯，AB组分材料在内芯中充分混合；64为出料口。

图7为AB胶筒喷嘴处挤出系统示意图。其中71为聚氨基酸水凝胶，72为种子细胞，73为透明质酸，74为聚氨基酸和透明质酸交联后的化合物，能够迅速成型。

图8为培养长成的细胞结构示意图。其中81为表皮细胞层，82为羊脱细胞真皮支架，83为真皮细胞层。

对比例1：本实施例采用孔径为1mm的普通外接喷头，重复实施例1，调整好合适的挤出速度和喷头移动速度后，其最终成型时间为15分钟。

与对比例1中的普通外接喷头相比，实施例1中采用外接螺旋喷头，其成型时间能够有效缩短。

对比例2：本实施例采用普通的单组分胶筒，采用双喷头协调的方式，其中第一个喷头采用螺杆挤出的方式，第二个喷头采用气动挤出的方式，外接孔径为1mm的普通外接喷头，打印步骤为：(1)先使用第一喷头打印一层第二墨水，再使用第二喷头打印一层透明质酸，往复三次，打印真皮层。(2)将羊脱细胞真皮支架覆盖在真皮层上。(3)将第一喷头的胶筒取下，换成装入第一墨水的胶筒，然后使用第一喷头打印一层第一墨水，再使用第二喷头打印一层透明质酸，往复两次，打印表皮层。其最终成型时间约为30分钟。

实施例2：本实施例采用螺杆推动和同轴挤出的方式打印皮肤，如图5所示，51为同轴胶筒，52为同轴胶筒喷嘴；选择51作为挤出胶筒，其余与实施例1相同，最终成型时间为18min。其中，由于同轴胶筒并未设计相应的外接螺旋喷头，并且同轴挤出的方式下两种材料的接触也不如双组分胶筒来的充分。因此，实施例2的时间比对比例1微长些。

实施例3：本实施例采用气压推动和1:1Y型混合挤出的方式打印皮肤，如图3所示，31为气动胶枪的推杆，32为胶筒的固定位置；将气动胶枪固定在3D生物打印机的13上，选择41作为挤出胶筒。3D生物打印机的XYZ轴运动模块11控制气动胶枪按特定轨迹运行，气动胶枪的底部接上气管，气压推动气动胶枪的推杆31，推杆推进胶筒中的活塞进而稳定均匀的挤出材料，采用螺旋状外接喷最终成型时间为12min。

实施例4：本实施例采用气压推动和同轴挤出的方式打印皮肤，如图5所示，选择51作为挤出胶筒，其余与实施例3相同，采用普通外接喷头20分钟。

通过以上实施例可知，所采用的双组分材料混合成型方式大大减少了打印时间，所采用的外接螺旋状喷头进一步的缩减了成型时间。优选的，实施例1的成型时间最短。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，但不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种3D打印的皮肤，自上而下由人造表皮层、脱细胞真皮支架和人造真皮层组成，其特征在于，所述的皮肤是由聚氨基酸水凝胶和透明质酸水凝胶经过双组分3D打印制备得到的。

2.根据权利要求1所述的3D打印的皮肤，其特征在于，所述的聚氨基酸水凝胶是改性后的聚谷氨酸和聚赖氨酸复合的水凝胶；所述的聚氨基酸水凝胶与改性后的透明质酸水凝胶复合后能够固化成型。

3.根据权利要求2所述的3D打印的皮肤，其特征在于，聚谷氨酸的改性方法为将聚谷氨酸溶于缓冲液，酸性条件下用1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺/N-羟基硫代琥珀酰亚胺对聚谷氨酸活化后，再加入己二酸二酰肼和半胱氨盐酸盐反应。

4.根据权利要求3所述的3D打印的皮肤，其特征在于，聚谷氨酸的浓度为60～120g/L，缓冲液为0.1mol/L，pH为4～6的2-(N-吗啡啉)乙磺酸缓冲液；聚谷氨酸、1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和N-羟基硫代琥珀酰亚胺对聚谷氨酸的摩尔比为1：0.05～0.2：0.05～0.2；所述的活化为在pH4～6，37℃下活化1～2h；所述的己二酸二酰肼和半胱氨盐酸盐的摩尔比为1：0.6～0.8；己二酸二酰肼和半胱氨盐酸盐的总量与聚谷氨酸的质量比为1：2.4～3；所述的反应为在30～40℃，无氧条件下反应18～30h。

5.根据权利要求2所述的3D打印的皮肤，其特征在于，透明质酸的改性方法为将透明质酸溶于去离子水，加热后再加入甲基丙烯酸缩水甘油酯反应，然后降至室温，加入高碘酸钠进行氧化改性。

6.根据权利要求5所述的3D打印的皮肤，其特征在于，所述的透明质酸的浓度为120～200g/L，透明质酸与甲基丙烯酸缩水甘油酯的摩尔比为1：0.6～0.8，加热的温度为50～70℃，所述的反应为50～70℃反应6～10h；高碘酸钠的浓度为0.0015mol/L；所述的氧化改性为在黑暗条件下25～30℃反应4～6h。

7.根据权利要求2所述的3D打印的皮肤，其特征在于，所述的聚氨基酸水凝胶的制备方法为包括如下步骤：

(a)改性后的聚谷氨酸2-(N-吗啡啉)乙磺酸缓冲液即为第一缓冲液；将聚赖氨酸溶于2-(N-吗啡啉)乙磺酸缓冲液，得到第二缓冲液；将第二缓冲液滴加至第一缓冲液中，加入结合酶，反应；

(b)向步骤(a)得到的反应体系中加入1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺/N-羟基硫代琥珀酰亚胺，冰浴反应后再室温反应，即得。

8.根据权利要求7所述的3D打印的皮肤，其特征在于，步骤(a)中，聚赖氨酸的浓度为24～60g/L；聚谷氨酸的浓度为60～120g/L；2-(N-吗啡啉)乙磺酸缓冲液的浓度为0.1mol/L，pH为4～6，所述的滴加为5～10mL/min；第一缓冲液和第二缓冲液的体积比为1:1；所述的结合酶为辣根过氧化物酶；酶活为200U/mL；结合酶的添加量为0.4mmol/L；所述的反应为室温反应10s～5min。

步骤(b)中，1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和N-羟基硫代琥珀酰亚胺的添加量均为0.15～0.2mol/L；冰浴反应的时间为20～40min；室温反应的时间为1～3h。

9.权利要求1所述3D打印的皮肤的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)准备三维皮肤模型；

(2)制备墨水：将角质形成细胞与聚氨基酸水凝胶复合，得到第一墨水；将皮肤成纤维细胞、血管内皮细胞、细胞因子与聚氨基酸水凝胶复合，得到第二墨水；

(3)3D生物打印；

(4)培养，即得。

10.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，所述的3D生物打印包括如下步骤：

(i)将第二墨水装入双组分胶筒的第一胶筒中，将透明质酸装入双组分胶筒的第二胶筒中，打印人造真皮层；

(ii)将羊脱细胞真皮支架覆盖在人造真皮层上；

(iii)将第一墨水装入双组分胶筒的第一胶筒中，将透明质酸装入双组分胶筒的第二胶筒，在羊脱细胞真皮支架上打印人造表皮层；

步骤(i)中和步骤(iii)中，控制第一胶筒和第二胶筒的出料速率，使聚氨基酸水凝胶与透明质酸的摩尔比为1:1。

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