CN110241073B - 快速分离提取表皮干细胞的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种快速分离提取表皮干细胞的方法，包括如下步骤：(1)用TrypLE Select消化液消化皮片；(2)分离表皮和真皮，刮取和收集表皮基底细胞；(3)纯化、离心去上清后加培养基重悬表皮基底细胞；(4)将表皮基底细胞接种到用纤连蛋白包被的细胞培养容器中培养；(5)洗去未贴壁细胞，贴壁细胞即为表皮干细胞。本发明提供的快速分离提取表皮干细胞的方法简单易行，对细胞损伤小，可在短时间内分离和提取得到表皮干细胞，可达到快速分离提取的效果，获得的表皮干细胞不仅纯度高、数量多，而且活性强，1cm²皮片可获取细胞数约1.5×10⁵个，活性达到85％以上。

Description

快速分离提取表皮干细胞的方法

技术领域

本发明属于生物医学技术领域，具体涉及一种分离提取表皮干细胞的方法。

背景技术

创面是机体由于内在或外在的因素导致皮肤完整性丧失所形成的，其修复一直以来是临床中的急需解决的问题。临床上按时间可将创面划分为急性创面及慢性创面。急性创面包括烧伤、创伤等重大疾病或者瘢痕、皮肤色素性疾病、良恶性肿瘤等手术切除后形成的皮肤缺损，慢性创面包括外伤性溃疡、糖尿病性溃疡、血管性溃疡、压力性溃疡、放射性溃疡、肿瘤性溃疡、瘢痕性溃疡等等形成的皮肤缺损。

大面积烧伤患者往往存在皮源短缺的问题，暴露的创面又往往成为创面感染迁延不愈，甚至发展为脓毒血症，危及生命，更为重要的是治愈后也往往形成瘢痕增生，皮革样皮肤，由于瘢痕的形成而没有汗腺、没有毛囊、没有皮脂腺，所以这种患者伤好之后，痛不欲生，因为这类患者到夏天不能排汗，生活质量受到严重影响。慢性创面的发病率呈逐年上升趋势，其病程长，难愈合，植皮成活率低，植皮后皮肤功能丧失，生活质量下降，社会负担沉重。有文献报道，全世界约有1％的人遭受到难愈性创面的困扰，5％左右的医疗费用被用于创面修复。每年在美国有6万至8万人因为急性皮肤损伤而入院治疗，每个患者需花费36000至117000美元。在美国每年的烧伤患者高达150万人，其中75000人属于严重烧伤，由于治疗不及时或感染等原因导致的死亡人数在5000～12000之间。在中国，每年因为烧伤、机械损伤或慢性皮肤溃疡而需要医治的者高达更高达320万人。据美国创面愈合协会资料显示，超过60％的慢性创面经半年的治疗后仍无法完全愈合，每年的医疗费极高。欧洲每年投入慢性创面治疗的费用则占卫生健康财政支出的2％，同时，创面修复后因瘢痕增生而修复的医疗费用也高达120亿美元，而且，这些费用每年仍在增加。

手术修复是目前治疗创面的主要方法，但是，无论是传统的皮片移植、皮瓣移植、邮票皮移植、微粒皮移植、网状皮移植、复合皮移植等，还是新兴的组织工程皮肤，目前都未能有效的解决创面修复的难题。尤其是重大疾病烧伤患者康复后往往瘢痕增生，汗腺缺失，皮肤失去原有的功能，生活质量低下；慢性创面则迁延不愈，轻者极大消耗医疗资源，重者并发感染、脓毒血症等严重危害生命。

现有研究表明在创面上喷洒表皮细胞悬液(主要含有表皮细胞、成纤维细胞、黑色素细胞等)能提高创面愈合率，改善远期皮肤愈合质量，甚至能修复部分皮肤附属器官，如汗腺等。但目前获取细胞悬液的方法主要为胰蛋白酶消化法，方法耗时较长，且受消化条件(如酶的种类、浓度、反应温度、反应时间等)、皮片厚度等因素的影响，制备得到的细胞悬液中细胞活性不高，不能满足临床上立即进行细胞悬液移植的需要，故目前临床上用于移植的细胞悬液中的细胞都是分离后的细胞经过培养后获得的细胞，由此不仅延长了患者的住院时间，对于大面积创面患者还容易诱发全身性感染，同时，该方法还需要较高的实验条件，耗时耗力，在基层医院难以推广应用，同时患者还得经受两次手术的痛苦(取皮一次，细胞悬液移植一次)。

本申请发明人在既往的临床研究中发现，相比于移植表皮细胞，移植表皮基底细胞(Epidermal Basal Cells，EBCs，主要包含角质形成细胞、表皮干细胞、成纤维细胞和黑色素细胞等)能更有效促进慢性创面愈合，而其中发挥主要作用的是表皮干细胞(Epidermal Stem Cells,ESCs)。目前体外获取表皮干细胞的方法主要是流式细胞仪分选法及IV型胶原吸附法。研究表明，相比流式细胞仪分选法，IV型胶原吸附法具有吸附速度快，细胞纯度高等优点；而Jones P H等发表的论文“Separation of human epidermalstem cells from transit amplifying cells on the basis of differences inintegrin function and Selection”公开，相比于层粘连蛋白和纤连蛋白，IV型胶原更有利于提高表皮干细胞贴壁效率以及提高表皮干细胞的克隆形成能力。但IV型胶原目前仅用于实验研究，而无上市产品，用于分离和提取需用于治疗创面的表皮干细胞，存在潜在的安全风险；且通过IV型胶原吸附法分离和提取表皮干细胞，一般需要过夜包被培养瓶，不但耗时长，而且分离和提取过程中需要反复消化，对细胞损伤大，获得的细胞不适合立即用于创面治疗。

发明内容

本发明的目的在于提供一种快速分离提取表皮干细胞的方法，以解决上述技术问题中的至少一个。

根据本发明的一个方面，提供了一种快速分离提取表皮干细胞的方法，包括如下步骤：

(1)用TrypLE Select消化液消化皮片；

(2)终止消化，分离表皮和真皮，然后从表皮基底层刮取表皮基底细胞，收集细胞后用乳酸林格氏液或PBS溶液稀释，得表皮基底细胞悬液；

(3)对表皮基底细胞悬液进行纯化，然后离心，去上清后加培养基重悬表皮基底细胞；

(4)将重悬后的表皮基底细胞接种到用纤连蛋白包被的细胞培养容器中培养10～20min；

(5)洗去未贴壁的细胞，贴壁细胞即为表皮干细胞。

本发明提供的快速分离提取表皮干细胞的方法简单易行，对细胞损伤小，可在短时间内分离和提取得到表皮干细胞，达到快速分离的目的，获得的表皮干细胞不仅纯度高、数量多，而且活性强，1cm²皮片可获取细胞数约1.5×10⁵个，活性达到85％以上。

本发明提供的快速分离提取表皮干细胞的方法适用于利用人的皮片或者鼠、兔、犬、猫等实验动物的皮片快速分离提取得到纯度高、活性强的表皮干细胞。临床上在进行创面修复手术的过程中，可以通过本发明提供的快速分离提取表皮干细胞的方法快速获取人自体表皮干细胞用于创面治疗，缩短患者的住院时间，避免患者经受二次手术的痛苦。

纤连蛋白(fibronectin，FN)是一种广泛存在于血液、体液及各种组织中的高分子糖蛋白，分子质量为450ku，由两个分子质量为220ku的亚基通过链间二硫键连接而成。在研究过程中，本发明发明人意外发现，在进行创面修复时，在清创后的新鲜肉芽创面上，先喷洒纤连蛋白，再喷涂EBCs细胞悬液，纤连蛋白可以快速有效吸附EBCs悬液中的ESCs，使细胞能有效粘附在创面上，防止细胞流失。在上述研究成果的启发以及进一步考虑到与IV型胶原相比，纤连蛋白为上市产品，已证实无药物残留、DNA残留、过敏等风险和副作用，用于分离和提取用于治疗创面的表皮干细胞，无潜在的安全风险，更加安全可靠，本发明发明人尝试在分离提取表皮干细胞时，选择使用纤连蛋白来吸附表皮干细胞，通过反复试验，意外发现，对使用TrypLE Select消化液消化皮片后获得的EBCs细胞悬液中的ESCs进行分离提取时，使用纤连蛋白，尤其在其浓度为20μg/ml或以上时，使用纤连蛋白包被的细胞培养容器吸附ESCs，与使用100μg/ml IV型胶原包被的细胞培养容器吸附ESCs相比，两者对ESCs的吸附效率相当，且吸附得到的ESCs的纯度以及克隆形成能力相当；此外，相比于IV型胶原，使用纤连蛋白来吸附表皮干细胞，可以显著促进表皮干细胞的增殖能力和迁移能力。

在一些实施方式中，步骤(4)中，用纤连蛋白包被细胞培养容器的方法可以包括：用浓度为5～40μg/ml的纤连蛋白在37℃条件下包被细胞培养容器25～40min。在纤连蛋白浓度5～20μg/ml范围内，表皮干细胞的贴壁效率、增殖能力、克隆形成能力等随纤连蛋白浓度的增加呈剂量依赖性增长，当浓度大于20μg/ml时，纤连蛋白浓度继续增长，表皮干细胞的贴壁效率、增殖能力、克隆形成能力变化不明显。

在一些实施方式中，纤连蛋白的浓度可以为20μg/ml，包被时间为30min。经20μg/ml纤连蛋白包被的培养容器吸附后的表皮干细胞的增殖能力和迁移能力显著增强。

在一些实施方式中，步骤(1)中，TrypLE Select消化液的工作浓度可以为1×TrypLE Select消化液浓度的5～15倍，消化时间为10～20min。通过TrypLE Select消化液消化皮片时，要保证TrypLE Select消化液的工作浓度和TrypLE Select消化液对皮片的消化的时间，才能达到操作时间短，表皮和真皮易于分离，获取的细胞数量多，活性比例高的目的，即快速获得表皮基底细胞悬液的目的。

在一些实施方式中，步骤(1)中，将皮片用10×TrypLE Select消化液消化15min。由此，可以在缩短操作时间的同时提高细胞的活性比例。

在一些实施方式中，步骤(2)中，可以加入乳酸林格氏液或PBS溶液终止消化。乳酸林格氏液或PBS溶液的加入量可以是与消化液等体积或多于消化液的体积。

在一些实施方式中，步骤(3)中，对表皮基底细胞悬液进行纯化的步骤包括：将表皮基底细胞悬液用100μm细胞滤网过滤。由此，可以对表皮干细胞进行富集以进一步提高表皮干细胞的纯度。

在一些实施方式中，培养基可以为K-SFM培养基。优选地，K-SFM培养基中添加有表皮生长因子(EGF)和双抗(青链霉素)；由此，不仅有利于保持表皮干细胞的活性，还有利于促进表皮细胞贴壁，提高吸附效率。在其他实施方式中，培养基也可以选择其他可以用于培养干细胞的培养基，如DMEM培养基、FAD培养基等。

在一些实施方式中，步骤(4)中，表皮基底细胞的接种密度可以为0.8×10⁵～1.2×10⁵/cm²。由此，有利于提高纤连蛋白对表皮干细胞的吸附效率。

在一些实施方式中，步骤(5)中，可以用培养基或PBS溶液洗去未贴壁的细胞。

在一些实施方式中，步骤(1)中，皮片可以为刃厚皮。刃厚皮真皮含带少，且容易切取，供皮区不受限制，愈合迅速。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

(1)本发明提供的分离提取表皮干细胞的方法简单易行，对细胞损伤小，分离和提取得到表皮干细胞纯度高、数量多、活性强，1cm²皮片可获取细胞数约1.5×10⁵个，活性达到85％以上；

(2)利用本发明提供的分离提取表皮干细胞的方法，可以在进行创面修复手术的过程中，通过皮片短时间内快速分离和提取得到满足临床进行细胞悬液移植要求的表皮干细胞用于创面治疗，避免患者经受二次手术的痛苦；

(3)免疫荧光鉴定试验和细胞克隆形成试验的试验结果表明，用20μg/ml FN包被的培养皿吸附ESCs与用100μg/ml IV型胶原包被的培养皿吸附ESCs，两者对ESCs的吸附效率相当，吸附得到的ESCs的纯度和克隆形成能力相当，无显著差异；

(4)划痕试验以及通过CCK-8法对细胞的增殖能力进行检测的试验的试验结果表明，与被100μg/ml IV型胶原包被的培养板吸附的ESCs相比，被20μg/ml FN包被的培养板吸附的ESCs的增殖能力和迁移能力显著增强。

附图说明

图1为显微镜下不同浓度FN包被的培养皿中的ESCs的吸附情况；

图2为不同浓度FN包被的培养皿对ESCs的吸附效率，图中，^*表示与对照组相比，^*P<0.05；

图3为CCK-8法检测不同浓度FN包被的96孔板中的ESCs在不同时间点下的OD₄₅₀值，图中，^*表示与对照组相比，^*P<0.05；由上至下的曲线依次代表FN浓度为40μg/ml、20μg/ml、10μg/ml、5μg/ml和对照组ESCs在不同时间点下的OD₄₅₀值；

图4为显微镜下20μg/ml FN包被的96孔板和100μg/ml IV型胶原包被的96孔板中的ESCs在第0d、第3d、第9d的增殖情况；

图5为CCK-8法检测20μg/ml FN包被的96孔板和100μg/ml IV型胶原包被的96孔板中的ESCs在不同时间点下的OD₄₅₀值，图中，^*表示与100μg/ml IV型胶原包被的96孔板中的ESCs在对应时间点下的OD₄₅₀值相比，^*P<0.05；

图6为不同浓度FN包被的培养皿中的ESCs的克隆情况；

图7为不同浓度FN包被的培养皿中的ESCs的克隆形成率，图中，^*表示与对照组相比，^*P<0.05；

图8为20μg/ml FN包被的培养皿和100μg/ml IV型胶原包被的培养皿中的ESCs的克隆情况；

图9为20μg/ml FN包被的培养皿和100μg/ml IV型胶原包被的培养皿中的ESCs的克隆形成率，图中，^*表示与100μg/ml IV型胶原包被的培养皿中的ESCs的克隆形成率相比，^*P<0.05；

图10为20μg/ml FN包被的培养皿和100μg/ml IV型胶原包被的培养皿中的ESCs的迁移情况；

图11为20μg/ml FN包被的培养皿和100μg/ml IV型胶原包被的培养皿中的ESCs的迁移率，图中，^*表示与100μg/ml IV型胶原包被的培养皿中的ESCs的迁移率相比，^*P<0.05；

图12为20μg/ml FN包被的培养皿和100μg/ml IV型胶原包被的培养皿中的ESCs的免疫组化染色情况；

图13为20μg/ml FN包被的培养皿和100μg/ml IV型胶原包被的培养皿中的ESCs的纯度情况，图中，^*表示与100μg/ml IV型胶原包被的培养皿中的ESCs的纯度相比，^*P<0.05。

具体实施方式

下面结合具体实施例和附图对本发明作进一步详细的说明。

实施例1、人表皮干细胞的快速分离提取

(1)消化：在左足背瘢痕挛缩患者的右大腿供皮区取厚度约为0.2mm的刃厚皮片1cm×1cm，立即加入TrypLE Select(10×)消化液于37℃条件下消化15min；其中，TrypLESelect(10×)消化液购于Thermo Fisher Scientific公司(货号：A1217701)，使用前预热至37℃；

(2)分离：加入乳酸林格氏液终止消化，用镊子分离表皮和真皮，并用无菌手术刀从表皮基底层轻轻刮取EBCs，用1ml注射器及圆头针头吸取EBCs，收集EBCs，然后用乳酸林格氏液对EBCs进行稀释，得到EBCs细胞悬液；

(3)提取和过滤：用100μm细胞滤网对EBCs细胞悬液过滤，得到纯化后的EBCs悬液；

(4)离心：转移EBCs悬液于15ml离心管中，1500r/min离心5min，弃上清，加K-SFM培养基重悬，并进行细胞计数；

(5)包被细胞培养容器：采用差速贴壁法从EBCs中分离提取ESCs，需提前用FN包被培养瓶或培养皿，用20μg/ml的FN在37℃条件下包被细胞培养皿30min；为节省时间，该操作可以先于或同时与上述步骤(1)～(4)进行；

(6)种板：将分离得到EBCs以10⁵/cm²种板，在37℃条件下静置培养10～20min；

(7)用K-SFM培养基洗去未贴壁的细胞，贴壁细胞即为ESCs。

人表皮干细胞除了可以通过自体皮片进行分离提取外，还可以通过人工皮片(理想的人工皮片包含表皮和真皮两层结构并且两者之间连接紧密，其具有柔韧性和一定的机械强度，移植到创面后很快即与创面良好贴附，具有安全、不携带病毒的优点，表皮与真皮成分能尽快完成自身增殖、分化和功能成熟，形成更接近于生理的永久性的皮肤替代物等)进行分离提取。

试验例1、不同浓度FN包被的培养皿对ESCs的吸附效率

(1)分别用5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、40μg/ml的FN均匀包被35mm培养皿，37℃下包被30min；然后按10⁵/cm²接种EBCs，在37℃条件下静置培养10～20min。其中，EBCs的分离提取方法同实施例1。

(2)吸附效率检测和分析：静置培养10～20min后弃去培养液并用PBS洗去未贴壁的细胞，显微镜下观察细胞贴壁情况并拍照。用Tryple Select(1x)消化液消化贴壁细胞后计数，比较各组细胞的贴壁效率。

(3)试验结果：如图1～图2所示。由图1和图2的结果可知，FN对ESCs的吸附效率随着用于包被培养皿的FN浓度的增加呈剂量依赖性增长，直至FN浓度达到20μg/ml，此时FN浓度继续增长，FN对ESCs的吸附效率增长不明显，由此可知，20μg/ml为FN包被培养皿的最佳浓度。

试验例2、CCK-8法检测不同吸附条件下ESCs的增殖能力

本试验中所用的ESCs为常规传代培养的人的第一代ESCs。

(1)原理：CCK-8测定是基于活细胞中的脱氢酶活性的检测，其主要成分WST-8被活细胞中的脱氢酶还原产生具有高度水溶性的黄色甲瓒产物，且生成的甲臜产物的数量与活细胞的数量成正比。

(2)制作标准曲线：先用细胞计数板计数ESCs悬液中的细胞数量，依次用培养基等比稀释成5个细胞浓度梯度，每组6个复孔。细胞贴壁后加CCK-8试剂作用2h后测定光密度(OD)值，制作出一条以细胞数量为横坐标(X轴)，OD值为纵坐标(Y轴)的标准曲线。

(3)包被：以不同浓度(5，10，20，40μg/ml)的FN或100μg/ml的IV型胶原(Col IV)均匀包被6个相同的96孔板，分别用于检测6个不同的时间点每组ESCs的OD值，每组在每个板上做6个复孔；

(4)种板：将ESCs以10³个细胞/孔接种到平板中；

(5)CCK-8：分别于第0，1，2，3，4，5d将10μl CCK-8溶液加入培养基中，并在37℃，5％CO₂中温育2h；

(6)检测OD₄₅₀值：通过微孔板分光光度计在450nm下测量OD值，根据标准曲线换算相应的活细胞数目。

(7)试验结果：如图3～图5所示。由图3的结果可知，ESCs的增殖能力随着用于包被96孔板的FN浓度的增加呈剂量依赖性增长，直至FN浓度达到20μg/ml，此时FN浓度继续增长，ESCs的增殖能力增长不明显，由此可知，20μg/ml为FN包被培养皿的最佳浓度。由图4和图5的结果可知，与被100μg/ml IV型胶原包被的96孔板吸附的ESCs相比，被20μg/mlFN包被的96孔板吸附的ESCs的增殖能力显著增强，在相同时间点下(第0d除外)，20μg/ml FN包被的96孔板中的ESCs细胞数量(见图4)和活细胞数(见图5)显著多于100μg/ml IV型胶原包被的96孔板中的ESCs。此外，由图4中第0d的结果可知，20μg/ml FN包被的培养皿对ESCs的吸附效率与100μg/ml IV型胶原包被的培养皿对ESCs的吸附效率相当。

试验例3、不同吸附条件下ESCs的克隆形成能力

本试验中所用的ESCs为常规传代培养的人的第一代ESCs。

(1)包被：以不同浓度(5，10，20，40μg/ml)的FN或100μg/ml的IV型胶原均匀包被20个相同的35mm细胞培养皿，每组设3个复孔；

(2)消化：取对数生长期的ESCs，用0.25％胰蛋白酶消化并吹打成单个细胞，把细胞悬浮在K-SFM培养液中备用；

(3)种板：将10³个ESC接种到预先包被有FN(5，10，20或40μg/ml)和IV型胶原(100μg/ml)的35mm细胞培养皿中，并在K-SFM培养液种培养10d；

(4)固定和染色：在第10d去除培养基，将细胞在PBS中洗涤，在4％多聚甲醛中固定20min；用0.5％结晶紫染色20min，流水缓慢吸取染色液，室温干燥并拍照；

(5)分析：通过数码相机获得图像，显微镜下计数大于50个细胞的克隆数，根据以下公式计算克隆形成率(CFE)：(克隆数/接种细胞数)×100％。

(6)试验结果：如图6～图9所示。由图6和图7的结果可知，ESCs的克隆形成能力随着用于包被培养皿的FN浓度的增加呈剂量依赖性增长，直至FN浓度达到20μg/ml，此时FN浓度继续增长，ESCs的克隆形成能力增长不明显，由此可知，20μg/ml为FN包被培养皿的最佳浓度。由图8和图9的结果可知，被20μg/ml FN包被的培养皿吸附的ESCs的克隆形成能力与被100μg/ml IV型胶原包被的培养皿吸附的ESCs的克隆形成能力相对，两者无显著差异。

试验例4、划痕实验检测不同吸附条件下的ESCs的迁移能力

本试验中所用的ESCs为常规传代培养的人的第一代ESCs。

(1)画线：先用marker笔在6孔板背后均匀划横线，大约每隔1cm一道，横穿过孔。每孔至少穿过3条线(方便拍照定位同一视野)；

(2)包被和种板：将3×10⁵个快速分离提取得到的ESCs接种到2个分别预先包被有20μg/ml FN和100μg/ml胶原IV的6孔板中，每组6个复孔，在K-SFM培养基中生长至80-90％；

(3)抑制增殖：在划痕前6h将10μg/ml丝裂霉素C加入培养基中以抑制细胞增殖；

(4)划痕：使用1ml无菌移液管尖端在细胞单层上制备均匀的线性划痕；用K-SFM轻轻洗涤细胞碎片，并使用配备有数字彩色照相机的倒置显微镜立即捕获图像；

(5)拍照和分析：在37℃，5％CO₂培养箱中培养24h后再次对相同部位拍照，并通过Image Pro Plus 6.0软件测量ESCs的迁移距离，并计算迁移率。

(6)试验结果：如图10～图11所示。由图10和图11的结果可知，与被100μg/ml IV型胶原包被的6孔板吸附的ESCs相比，被20μg/ml FN包被的6孔板吸附的ESCs的迁移能力显著增强。

试验例5、免疫荧光鉴定ESCs纯度

(1)细胞爬片：将10⁴个快速分离提取得到的EBCs接种至20μg/ml FN和100μg/mlIV胶原包被的4室免疫荧光载玻片上，吸附ESCs后换液，在37℃，5％CO₂培养箱中孵育过夜；其中，EBCs的分离提取方法同实施例1；

(2)用预温的PBS漂洗3次；

(3)固定：4％冷的多聚甲醛固定20min，PBS洗三遍；

(4)透化：0.2％Triton X-100透化10min，PBS洗三遍；

(5)封闭：室温下，加入透化封闭缓冲液(1％BSA+0.1％TritonX-100)，孵育30min；

(6)一抗孵育：加入稀释好的一抗，置入湿盒4℃孵育过夜，PBST漂洗3次；

*本部分所使用的一抗为：大鼠抗人多抗Integrin-α6，兔抗人单抗CD71；

(7)二抗孵育：避光，加入相应一抗来源的按比例稀释(l：500)的荧光素标记的二抗，室温孵育1h，PBST漂洗3次，每次5min；

*本部分所使用的二抗为：Alexa Fluor 594(ab150160)标记的山羊抗大鼠IgG；Alex Fluor 488(ab150081)标记的山羊抗兔IgG；

(8)染核及封片：用0.2％DAPI孵育10min,防荧光猝灭剂封片，并于激光共聚焦显微镜下观察并拍照；

(9)染色后分析：采用ImageJ软件对荧光结果进行分析：计数染色阳性的细胞及分析荧光强度。Integrin-α6阳性信号为红色，主要由ESCs表达，CD71阳性信号为绿色；DAPI所染蓝色点状物为细胞核。

(10)试验结果：如图12～图13所示。图12中，Integrin-α6和CD71用于鉴定ESCs；DAPI示4,6二脒基-2-苯基吲哚；Merge为前三张融合图，Integrin-α6^bri CD71^dim(即Integrin-α6高表达CD71低表达)提示ESCs纯度高。由图12和图13的结果可知，用20μg/mlFN包被的培养皿吸附ESCs与用100μg/ml IV型胶原包被的培养皿吸附ESCs，两者吸附得到的ESCs的纯度相当，无显著差异。

以上所述的仅是本发明的一些实施方式。对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。

Claims (8)

1.快速分离提取表皮干细胞的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)用TrypLE Select消化液消化皮片；其中，所述TrypLE Select消化液的工作浓度为1×TrypLE Select消化液浓度的5～15倍，消化时间为10～20min；

(2)终止消化，分离表皮和真皮，然后从表皮基底层刮取表皮基底细胞，收集细胞后用乳酸林格氏液或PBS溶液稀释，得表皮基底细胞悬液；

(3)对表皮基底细胞悬液进行纯化，然后离心，去上清后加培养基重悬表皮基底细胞；

(4)将重悬后的表皮基底细胞接种到用纤连蛋白包被的细胞培养容器中培养10～20min；其中，用纤连蛋白包被细胞培养容器的方法包括：用浓度为20～40μg/ml的纤连蛋白在37℃条件下包被细胞培养容器25～40min；

(5)洗去未贴壁的细胞，贴壁细胞即为表皮干细胞。

2.根据权利要求1所述的快速分离提取表皮干细胞的方法，其特征在于，所述纤连蛋白的浓度为20μg/ml，包被时间为30min。

3.根据权利要求1或2所述的快速分离提取表皮干细胞的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，将皮片用10×TrypLE Select消化液消化15min。

4.根据权利要求3所述的快速分离提取表皮干细胞的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，加入乳酸林格氏液或PBS溶液终止消化。

5.根据权利要求4所述的快速分离提取表皮干细胞的方法，其特征在于，所述步骤(3)中，对表皮基底细胞悬液进行纯化的步骤包括：将表皮基底细胞悬液用100μm细胞滤网过滤。

6.根据权利要求1所述的快速分离提取表皮干细胞的方法，其特征在于，所述培养基为K-SFM培养基。

7.根据权利要求1所述的快速分离提取表皮干细胞的方法，其特征在于，所述步骤(4)中，表皮基底细胞的接种密度为0.8×10⁵～1.2×10⁵/cm²。

8.根据权利要求1所述的快速分离提取表皮干细胞的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，所述皮片为刃厚皮。

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