JP2007181511A

JP2007181511A - 移植のための細胞組成物

Info

Publication number: JP2007181511A
Application number: JP2006000075A
Authority: JP
Inventors: Minoru Ueda; 実上田
Original assignee: University of Tokyo NUC
Current assignee: University of Tokyo NUC
Priority date: 2006-01-04
Filing date: 2006-01-04
Publication date: 2007-07-19
Also published as: US20090068154A1; KR20080086534A; WO2007077824A1

Abstract

【課題】本発明は、頬脂肪体に由来する線維芽細胞を含む移植のための細胞組成物を提供する。
【解決手段】頬脂肪体に由来する線維芽細胞を含む、移植のための細胞組成物。
【選択図】なし

Description

本発明は、頬脂肪体に由来する脂肪線維芽細胞を含む移植のための細胞組成物に関する。

傷病等による皮膚組織の異常や欠損、又は先天的又は（加齢による）後天的な皺、陥没当の変形を修復するために、種々の生体材料が使用されている。

たとえば、生化学的材料としては、Ｃ末端及びＮ末端ペプチド部分を除去することによって抗原性を低下させたウシコラーゲン（アテロコラーゲン）（非特許文献１）、ヒアルロン酸ゲル（非特許文献２）を挙げることができる。

しかし、ウシコラーゲンやヒアルロン酸ゲルには、生体内において加水分解されやすく、早期に投与部位から消滅するために効果が持続しないという欠点がある。また、異種の材料を使用する場合には、免疫学的影響を完全に排除することが困難である。

また、移植のための細胞組成物としては、患者自身の皮膚組織から単離した皮膚に由来する線維芽細胞をインビトロで培養して得られた細胞組成物（特許文献１）が知られている。

さらに、最近、本発明者等により、ヒトの歯肉に由来する線維芽細胞をインビトロで培養して得られた移植のための細胞組成物も開発されている（特願２００５−１９０３７４）。

皮膚線維芽細胞は、充填物として機能するに過ぎず、患部とその周辺領域の皮膚組織の生理学的状態、すなわち、皮膚組織の物理的状態及び／又は栄養状態を積極的に改善するのに十分な機能を有していない。

また、皮膚に由来する線維芽細胞や歯肉に由来する線維芽細胞は、皮膚組織や歯肉組織の採取を必要とすることから、患者に苦痛を強いるものであり、侵襲性が十分に低いものではない。さらに、これらの細胞の増殖速度が遅いという欠点があった。

特表平１１−５１００６９号公報 DeLustro F, et al., J Biomed Mater Res., 1986, 20:109-20 Duranti F, et al. Dermatol Surg., 1998 24, 1317-25.

本発明は、頬脂肪体に由来する線維芽細胞を含む移植のための細胞組成物を提供することを目的とする。

本発明者は、鋭意研究の結果、頬脂肪体に由来する脂肪線維芽細胞が優れた増殖速度を有し、かつ、皮膚組織の物理的状態及び／又は栄養状態の積極的改善機能を有していることを見出し、本発明を完成させたものである。

したがって、本発明は、下記：
１．頬脂肪体に由来する線維芽細胞を含む、移植のための細胞組成物、
２．上記頬脂肪体がヒトに由来する、上記１に記載の移植のための細胞組成物、
３．上記頬脂肪体が自家性である、上記２に記載の移植のための細胞組成物、
４．皮膚組織を改善するための、上記１〜３に記載の移植のための細胞組成物。
５．下記工程：
（ａ）頬脂肪体から細胞を採取する工程、
（ｂ）採取された細胞をインビトロで培養する工程、
（ｃ）培養物から線維芽細胞を回収する工程
を含む、上記１〜４のいずれか１つに記載の移植のための細胞組成物を調製するための方法、
６．下記工程：
（ａ）対象に上記４に記載の移植のための細胞組成物を投与すること
を含む、皮膚組織を改善するための方法、
に関する。

本発明の移植のための細胞組成物は、組織の変形部位又は欠損部位を充填する効果及び当該部位とその周辺組織の生理学的状態を改善する効果を有する。

頬脂肪体は頬骨弓の下方のくぼみにある脂肪塊である。頬脂肪体は、主体部と４つの分枝(頬枝、翼突枝、翼突下顎枝、側頭枝)で構成されている。主体部を中心に頬枝は頬部の中で表層に、他の三つは深層にある。主体部は耳下腺管の上に位置し、咬筋前縁の上部に沿って延長している。

本発明の頬脂肪体は、哺乳動物、好ましくは、ヒトに由来する。また、免疫拒絶反応を回避するためには、上記頬脂肪体は、好ましくは、自家性である。

本発明で線維芽細胞とは、インビトロの培養で紡錘形を呈し、コラーゲン産生能を有する付着性細胞をいう。また、本発明の線維芽細胞は、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）及び角化細胞増殖因子（ＫＧＦ）のような種々の細胞増殖因子を産生する能力を有することが好ましい。

本発明の線維芽細胞は、好ましくは、Ｉ型コラーゲンを産生することができる。また、上記線維芽細胞の血管内皮増殖因子の産生能力は、２４時間処理で４０〜６０ｐｇ／ｍｌであり、４８時間処理で５５〜７５ｐｇ／ｍｌであり、７２時間処理で７５〜８０ｐｇ／ｍｌであり、また、角化細胞増殖因子の産生能力は、２４時間処理で１．３〜１．８ｎｇ／ｍｌであり、４８時間処理で１．８〜２．４ｎｇ／ｍｌであり、７２時間処理で２．５〜３．０ｎｇ／ｍｌである。

本発明の線維芽細胞は、コラーゲン産生能及び細胞増殖因子産生能を有する限り、初代培養細胞及び株化細胞を含むことができる。また、これらの特性を共通にする限り、形態等の他の特性は相違することができる。

本発明の線維芽細胞は、従来公知の任意の方法、たとえば穿刺によって採取することができる。

採取した細胞は、従来公知の任意の方法によって培養することができる。また、場合により、細胞系を樹立することもできる。

培養液は、線維芽細胞の培養に用いられる従来公知の培養液、たとえば、α−ＭＥＭ培地、イーグル培地、ダルベッコ改変イーグル培地等を用いることができる。培養液には、適当な血清、抗生物質等を適宜添加することができる。

採取された細胞は、適当な培養液中で、コンフルエントになるまで培養（３７℃、５％ＣＯ_２）することができる。必要に応じて、培養細胞を継代することができる。上記特性が失われない限り、継代数は制限されないが、好ましくは、１０代以下、より好ましくは、３〜６代である。

培養容器は、線維芽細胞の培養に用いられる任意の容器を用いることができる。培養容器は、たとえば、培養フラスコ、培養ディッシュ、マルチプレートである。

細胞数が所望量に達した後、培養容器から線維芽細胞を回収する。細胞の回収方法は、従来の線維芽細胞の回収方法を用いることができ、本発明の実施に当たり、特別の操作や処理を必要としない。たとえば、培養容器の内壁面に付着した細胞は、トリプシンのような適当な酵素で処理し、培養容器の内壁面から剥離し、培養液中に遊離させ、培養液とともに回収することができる。

回収した細胞を適当な無血清培地中で１２時間以上、好ましくは、２４時間以上培養し、培養液中に含まれる血清成分等の免疫原性物質を実質的に除去することができる。また、培養した細胞は、従来公知の方法によって凍結保存することができる。

上記の免疫原性物質を実質的に含まない細胞懸濁液は、本発明の移植のための細胞組成物として用いることができる。この移植のための細胞組成物は、培養細胞、無血清培地を含むことができる。

本発明の移植のための細胞組成物は、さらに、（１）抗生物質、（２）ビタミンやブドウ糖のような栄養成分、（３）酵素、（４）補酵素、（５）防腐剤、（６）ＫＧＦやＶＥＧＦ等の増殖因子を含むサイトカイン、（７）抗炎症剤等の薬剤及び／又は（８）色素を加えることができる。

また、本発明は、下記工程：
（ａ）頬脂肪体から細胞を採取する工程、
（ｂ）採取された細胞をインビトロで培養する工程、
（ｃ）培養物から線維芽細胞を回収する工程
を含む、本発明の移植のための細胞組成物を調製するための方法にも関する。

調製された移植のための細胞組成物を、従来の細胞組成物（特許文献１及び非特許文献１）と同様な方法によって、患部に投与することができる。たとえば、細胞懸濁液を注射器を用いて皮下組織に注入することができる。また、細胞組成物は、細胞懸濁液の形態ではなく、線維芽細胞からなる集塊物の形態、たとえば、線維芽細胞とマトリクスの複合体であることもできる。マトリックスとしては、種々の好適な生体適合性材料、たとえば、多糖類、タンパク質、高分子有機材料、無機材料等を用いることができる。上記マトリックスは、好ましくは、ヒト由来の、より好ましくは、自家性の血液又は血漿であり、血漿は、好ましくは、多血小板血漿（platelet-rich plasma: ＰＲＰ）である。

本発明の移植のための細胞組成物は、好ましくは、皮膚組織の改善のために対象に投与することができる。対象は、哺乳動物、好ましくは、ヒトである。また、対象は、好ましくは、細胞組成物の供給源と同一対象である。本発明の皮膚組織の改善には、皮下組織のような皮膚組織の変形部位又は欠損部位の充填、及び当該部位とその周辺皮膚組織の生理的状態の改善が含まれる。本発明の移植のための細胞組成物によって改善することができる欠損には、たとえば、しわ、妊娠線、陥没瘢痕、非外傷性の皮膚の陥没、尋常性座瘡が含まれる。

本発明の移植のための細胞組成物の投与量、投与回数及び投与間隔は、症状に応じて変動することができる。医師等の施用者は、症状に応じ適宜これの値を設定することができる。

細胞組成物中の細胞の量は、剤形、有効成分の投与量などにより異なるが、例えば約１×１０^５〜約１×１０^８、好ましくは約１×１０^６〜約１×１０^８、より好ましくは約１×１０^７〜約１×１０^８である。

以下に実施例を示して、本発明をより詳細に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。

（１）細胞培養（初代培養・継代培養）
名古屋大学病院・口腔外科において、成人患者ヒト頬部脂肪体から脂肪組織を採取した（事前に名古屋大学医学部倫理委員会により承認され、患者の同意を得ている）。頬部脂肪体の採取には、注射針（１８Ｇ、テルモ社製）を用い、採取した組織のサイズは、直径約２ｍｍ、長さ約１ｃｍであった。腹部脂肪細胞の採取方法も同様であった。皮膚真皮細胞は、メスにて３ｍｍ片を切除、採取した。

得られた脂肪組織をコラゲナーゼ（和光純薬、５ｍｇ／ｍｌ、各組織２ｍｍ^３に対して２ｍｌ）で処理（３７℃、２時間）し、新鮮な培地で洗浄してコラゲナーゼを除去した。処理された脂肪組織（２ｍｍ片）を、６ウェルマルチプレート（直径３．５ｃｍ）の底面に置き、２５℃で１０〜２０分間放置した。

１ウェル当たり３〜５ｍｌの培地（ＤＭＥＭ：Dullbecco Modified Eagle's Medium、１０％血清、１％抗生物質）を加え、３７℃、５％ＣＯ_２の条件下で細胞を培養した。細胞は、接着した組織の外辺から周囲にゆっくり広がって増殖した。

組織片の周囲の細胞の増殖を確認後、培地を捨て、トリプシン（０．０５％、５分）で処理し、細胞を培養ディッシュから剥がし、培地に懸濁させた。

得られた細胞懸濁液を新鮮な培地を加えた培養ディッシュに分注し、さらに培養を続けた。できるだけ多くの細胞を回収するために、全ての細胞について培養を続けた。細胞が増殖してコンフルエントになった場合には、この操作を反復した。

細胞数測定（増殖曲線の測定）
精細胞数に応じて培地上清の傾向強度が増加する蛍光試薬（Cell Titer Blue: Invitrogen １ｍｌに対して５００μｌ）を培地に添加し、３７℃、５％ＣＯ_２の条件下で１時間培養した。培養上清を少量採取し、蛍光強度を測定し、検量線から生細胞数を決定した。生細胞数を経時的に測定し、増殖曲線を求めた。
また、独立して、細胞をトリプシン処理によって剥がし、細胞計数分析装置（セルカウンターＣＡＳＹ（登録商標）、東京インスツルメンツ）を用いて細胞数及び生存率を測定した。

得られた結果を図１に示す。図１から明らかなように、頬部脂肪体由来線維芽細胞は皮膚真皮由来線維芽細胞の３倍の増殖速度をもつ。

頬部脂肪体線維芽細胞によるＶＥＧＦ及びＫＧＦの産生
１０％のウシ胎児血清（Invitorogen）及び１％の抗生物質−抗真菌剤（Invitorogen; NO.15240-062）を含むＤＭＥＭ培地２ｍｌを添加した６ウェルプレートの各ウェルに、頬部脂肪体線維芽細胞を播種し、３７℃、５％ＣＯ_２の条件下で１時間培養した。細胞がコンフルエントになった状態で培地を除去し、ＰＢＳで２回洗浄し、無血清ＤＭＥＭを加え、さらに培養した。そして、２４、４８及び７２時間後に、培養液１ｍｌを採取し、新鮮なＤＭＥＭ１ｍｌをウェルに加えた。採取した培養液を４℃、１０，０００ｒｐｍで５分間遠心し、上清を採取した。採取した上清は、必要に応じ、−７０℃で保存した。

採取した培地中のＶＥＧＦ及びＫＧＦの量を市販のキットを用いてＥＬＩＳＡ法によって測定した（ｎ＝３）。ＶＥＧＦの定量には、「Immunoassay kit VEGF」（Biosource社）を使用した。また、ＫＧＦの定量には、「Quantikine（登録商標）Human KGF Immunoassay kit」（R&Dsystem社）を使用した。

結果を図２に示す。いずれの図についても、左から順に、頬部脂肪体細胞、腹部脂肪細胞、皮膚真皮細胞に由来する線維芽細胞を表す。図２から明らかなように、頬部脂肪体由来線維芽細胞は、他の線維芽細胞に比べて優れた成長因子生産能を有する。頬部脂肪体由来線維芽細胞のＶＥＧＦ産生量は、無血清ＤＭＥＭ培地中での２４時間培養後で、上清タンパク質１ｍｇ当たり５０ｐｇ以上であった。また、培養４８時間後では、上清タンパク質１ｍｇ当たり約６５ｐｇ以上、そして、培養７２時間後では、約８５ｐｇ以上が産生されることが確認された。

頬部脂肪体線維芽細胞のＫＧＦ産生量は、無血清ＤＭＥＭ培地中で２４時間培養後では、上清タンパク質１ｍｇ当たり１．５ｎｇ以上であった。また、培養４８時間後では、上清タンパク質１ｍｇ当たり約２ｎｇ以上、そして、培養７２時間後では、約２．５ｎｇ以上が産生されることが確認された。

頬脂肪体に由来する線維芽細胞を含む移植のための細胞組成物の投与。
上記実施例１と同様の条件で培養した頬部脂肪体由来線維芽細胞をトリプシンで処理して培養フラスコから回収した。回収した細胞数及び生存率を細胞計数分析装置（セルカウンターＣＡＳＹ（登録商標）、東京インスツルメンツ）を用いて測定した。そして、約２×１０^７個の細胞を市販の蛍光染色キット（PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Mini Kit、Sigma-Aldrich社）を用いて染色した。

蛍光染色された細胞を、ＰＢＳを用いて懸濁し、細胞密度を約１×１０^７細胞／ｍｌに調整し、この細胞懸濁液をヌードマウス背部の真皮内に注入した。注入から２月後、注入部組織を採取し、固定液として４％パラホルムアルデヒド液（Sigma-Aldrich社）を使用して組織を固定した。次いで、「Tissue-Tek O.C.T. Compound、Sakura Finetechnioal社」に包埋し、約６μｍの切片を作製した。

そして、この切片と抗ヒトコラーゲンタイプＩモノクローナル抗体（Chemicon社）を使用し、ＥＬＩＳＡ法によって免疫染色を行った。その後、市販の免疫組織染色用封入剤「Vectashield（登録商標）Mounting Medium for Fluorescence with DAPI、Vector Laboratories社」を用いて標本を作製し、顕微鏡写真を撮影した。その結果、移植された頬部脂肪体由来線維芽細胞が、移植から２月経過後も移植時と同様に真皮内に留まっていること（すなわち、生存していること）が確認された。また、移植した頬部脂肪体由来線維芽細胞の細胞質及びその周囲にヒトタイプＩコラーゲンが存在することが認められた。このことは、頬部脂肪体由来線維芽細胞が移植後もヒトタイプＩコラーゲンを産生していることを裏付けるものである。
同部位の病理組織についてヘマトキシリン・エオジン染色を施し、膠原線維の再生状態を観察したところ、細胞注入部位を中心に活発な結合組織の新生をみとめた。炎症所見を示す細胞浸潤は見られず、既存の真皮成分と連続していた。これに対して、コントロールおこなわれたコラーゲン注入群（５％アテロコラーゲン、高研社製、商品名セルゲン）ではコラーゲンが異物化し、活発な炎症性細胞浸潤がみられた。このことは自家細胞移植の安全性と有効性を示すものである。

本発明の移植のための細胞組成物は、皮膚組織の修復及び生理学的状態の改善を行うことができる。このため、形成外科、美容外科を含む皮膚外科的治療に利用することができる。

皮膚真皮及び頬部脂肪体由来線維芽細胞の増殖速度の比較である。皮膚真皮及び脂肪由来の線維芽細胞の成長因子生産能の比較である。

Claims

頬脂肪体に由来する線維芽細胞を含む、移植のための細胞組成物。
上記頬脂肪体がヒトに由来する、請求項１に記載の移植のための細胞組成物。
上記頬脂肪体が自家性である、請求項２に記載の移植のための細胞組成物。
皮膚組織を改善するための、請求項１〜３に記載の移植のための細胞組成物。
下記工程：
（ａ）頬脂肪体から細胞を採取する工程、
（ｂ）採取された細胞をインビトロで培養する工程、
（ｃ）培養物から線維芽細胞を回収する工程
を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の移植のための細胞組成物を調製するための方法。
下記工程：
（ａ）対象に請求項４に記載の移植のための細胞組成物を投与すること
を含む、皮膚組織を改善するための方法。