JP4982865B2 - 皮膚組織改善材及びその利用 - Google Patents
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Description
なお、本国際出願は2005年6月29日に出願された日本国特許出願第2005−190374号に基づく優先権を主張しており、その出願の全内容は本明細書中に参照として組み入れられている。
本明細書において「皮膚組織」は、特に言及される場合を除いて広義に解釈されるべき用語であり、表皮、真皮及び皮下組織を包含する用語である。
また、本明細書において「口腔内組織」は、特に言及される場合を除いて広義に解釈されるべき用語であり、歯周組織(歯肉、歯根膜、歯槽骨及びセメント質を包含する。)及び頬粘膜を包含する用語である。
即ち、ここで開示される皮膚組織改善材(皮膚組織改善のための組成物)によると、その主構成要素たる口腔内組織由来線維芽細胞が高効率に種々の細胞増殖因子(VEGF、KGF等)を当該投与部位において継続的に産生(即ち患部に供給)する結果、従来の皮膚組織修復材と同様の皮膚組織(典型的には皮下組織)変形部位若しくは欠損部位における充填効果を奏することに加え、当該部位とその周辺皮膚組織の生理学的状態を改善することができる。
口腔内組織(好ましくは歯周組織或いは頬粘膜)由来の線維芽細胞は、インビトロ培養での増殖速度が比較的(例えば皮膚真皮細胞と比較して)高く、所望する量の口腔内組織由来線維芽細胞を短期間に効率よく生産することができる。このため、本態様の皮膚組織改善材によると、線維芽細胞生産に係るコストを低下させ得るとともに迅速に皮膚組織(患部)の修復処置及び改善処置を実行することができる。
従って本発明は他の側面として、歯肉線維芽細胞及び/又は歯根膜線維芽細胞を(好ましくは細胞懸濁液の形態で)患部に投与することを特徴とする、皮膚組織(患部)にVEGF及び/又はKGFを供給する方法を提供する。また、歯肉線維芽細胞及び/又は歯根膜線維芽細胞を生体外で培養することを特徴とする、VEGF及び/又はKGFの生産方法を提供する。
ここで開示される方法によると、調達した口腔内組織(好ましくは歯周組織)由来の線維芽細胞を培養(増殖)し、上述した効果を奏する皮膚組織改善材を効率よく製造することができる。
この方法は、典型的には、ここで開示される何れかの皮膚組織改善材(例えばヒト又は他の哺乳動物の口腔内組織(好ましくは歯周組織)由来の線維芽細胞を含む懸濁液)を用意すること、及び、該用意した皮膚組織改善材(例えば上記線維芽細胞懸濁液)を被験者の患部(皮膚組織、例えば皮下組織)に投与(細胞の移植)すること、を包含する。従って、本発明は、ヒト又は他の哺乳動物の口腔内組織由来の線維芽細胞を患部に投与(移植)することを特徴とする、皮膚組織改善のための当該線維芽細胞の利用方法を提供する。
ここで開示される何れかの方法によって、患部である皮膚組織の迅速な修復及び改善を実現することができる。
また、本明細書中で引用されている全ての文献の全ての内容は本明細書中に参照として組み入れられている。
なお、培養細胞を皮膚組織改善材の主体として使用する場合、実際に使用する段階の当該培養細胞が上記線維芽細胞由来のものであって且つ本発明の目的(即ち皮膚組織の修復と改善)を達成するために必要な細胞増殖因子(VEGF、KGF等)を産生する能力を有しておればよく、度重なる継代培養によって細胞の外見その他の性状が採取した初代の線維芽細胞と異なる場合であってもよい。本発明に係る「口腔内組織由来の線維芽細胞」には、そのような継代培養後の細胞を包含する。
また、本発明の実施にあたっては、使用する細胞を口腔内の粘膜下(例えば頬粘膜)から採取すればよいため、採取痕が外部から視認されないことが被験者(又は採取対象者)にとっての一つの利点である。
このように免疫原性物質を実質的に除去した細胞懸濁液(即ち、培養細胞及び適当な無血清培地、緩衝液その他適当な溶媒を主成分とする組成物)は、好適な皮膚組織改善材であり得る。
なお、皮膚組織改善材には、主成分たる線維芽細胞、薬学的に許容され得る媒質(典型的には無血清培地等の培地或いは緩衝液等の溶媒)の他に、種々の副成分を含み得る。例えば、(1).抗生物質、(2).各種ビタミン、アミノ酸、ブドウ糖その他の栄養成分、(3).酵素類、(4).補酵素類、(5).防腐剤、(6).KGF、VEGF等の増殖因子その他サイトカイン類、(7).各種の薬剤(例えば抗炎症剤)、(8).色素、等が好適な副成分として挙げられる。
典型的には、細胞懸濁液の形態の皮膚組織改善材を適当な注射器等を用いて皮下組織に注入することができる。また、懸濁液の形態に限られず、例えば目的の線維芽細胞から成る細胞集塊物を皮膚組織改善材として使用してもよい。この場合、典型的には、線維芽細胞とマトリクスとの複合体として投与され得る。マトリクスとしては、種々の好適な生体適合性材料(多糖類、タンパク質その他の高分子有機材料、無機材料等)を利用することができる。ヒト由来(好ましくは被験者自身)の血液、又は種々の内容の血漿材料、例えば多血小板血漿(platelet-rich plasma:PRP)は、好適なマトリクスの一典型例である。
投与量及び投与回数(及び投与の間隔)は、症状に応じて異なり得るため特に制限はなく、一般には医師その他の施用者の決定事項であるため本発明を制限する事項ではない。
また、ここで開示される皮膚組織改善材は、歯肉組織の改善にも適用できる。即ち、本発明は、他の側面として、ヒト又は他の哺乳動物の口腔内組織由来の線維芽細胞(典型的にはヒト又は他の哺乳動物の口腔内組織由来の線維芽細胞を生体外で増殖させて得た培養細胞)を主体として構成される歯肉組織改善材を提供する。
ヒト歯肉組織から線維芽細胞を採取した。即ち、名古屋大学病院・口腔外科において成人患者から抜歯した歯より歯肉組織を採取した(事前に名古屋大学医学部倫理委員会により承認され、患者の同意を得ている。)。得られた歯肉組織に37℃、2時間のコラゲナーゼ処理(和光純薬(株)製品:濃度5mg/mL)を施した。かかる処理後の歯肉組織を直径3.5cmのDMEM培地を含む培養用ディッシュに移植し、37℃、5%CO2条件下で培養し、当該ディッシュに付着した線維芽細胞(実施例)を得た。
また、対象細胞(比較例)として、正常ヒト成人皮膚線維芽細胞(米国Cascade
Biologics,inc.製品)を入手した。
表1に示す値から明らかなように、対象の皮膚線維芽細胞の比較して本実施例に係る歯肉線維芽細胞の増殖率は高く、皮膚線維芽細胞の2倍弱であることが確認された。
10%のウシ胎児血清(Invitrogen社製品;No.10099-141)及び1%の抗生物質−抗真菌剤(Invitrogen社製品;No.15240-062)を含むDMEM培地を添加した6ウェルプレートの各ウェルに上記歯肉線維芽細胞又は皮膚線維芽細胞を播種し、37℃、5%CO2条件下で培養した。培養を開始した後、100%コンフルエントとなった状態で培養液を吸引し、PBSで2回洗浄後、血清を添加しないDMEM培地を加えてさらに培養を継続した。そして、24時間、48時間、72時間経過後にそれぞれ1mLずつ培養液を採取し、ウェルには新鮮なDMEM培地を1mL添加した。各時間で採取した培養液は4℃、10000rpmで5分間遠心沈降させ、その上清を採取した。採取した上清は、必要に応じて−70℃にて保存した。
而して、全サンプルを採取後、市販のキットを用いてELISA法に基づいて培養液中のVEGF及びKGFの定量を行った(試験数n=3)。なお、VEGFの定量にはBiosource社製の「Immunoassay kit VEGF」を使用した。また、KGFの定量にはR&Dsystem社製の「Quantikine(登録商標) Human KGF Immunoassay kit」を使用した。
これらグラフから明らかなように、歯肉線維芽細胞のほうがVEGF及びKGFの何れについても産生(分泌)能が有意に高かった。歯肉線維芽細胞のVEGF産生量は無血清DMEM培地で培養24時間後で上清タンパク質1mg当たり30pg以上であった。また、培養48時間後及び72時間後では、それぞれ、上清タンパク質1mg当たり約45pg及び約60pg又はそれ以上のVEGFが産生(分泌)されることが確認された。
他方、歯肉線維芽細胞のKGF産生量は無血清DMEM培地で培養24時間後で上清タンパク質1mg当たり0.5ng以上(より詳細には0.8ng以上)であった。また、培養48時間後及び72時間後では、それぞれ、上清タンパク質1mg当たり約1.5ng及び約2ng又はそれ以上のKGFが産生(分泌)されることが確認された。
上記試験例1と同様の条件で培養した歯肉線維芽細胞を上記細胞解離剤で処理して培養フラスコから回収した。回収した細胞数は、上記細胞計数分析装置を用いて計測した。
そして、約2×107個の同細胞を市販の蛍光染色キット(Sigma-Aldrich
社製品;PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Mini Kit)を用いて染色(蛍光ラベル)した。
而して、当該蛍光ラベルされた細胞をPBSを用いて懸濁し、細胞濃度を約1×107細胞/mLに調整後、ヌードマウス背部の真皮内に注入した。
2ヶ月後、注入部組織を採取し、固定液として4%パラホルムアルデヒド液(Sigma-Aldrich
社製品)を使用して組織を固定した。次いで、「Tissue-Tek O.C.T. Compound
(Sakura Finetechnical社製品)」に包埋し、約6μmの切片を作製した。
Fluorescence with DAPI(Vector Laboratories社製品)」を用いて標本を作製し、顕微鏡(オリンパス(株)製品;BX51)及び顕微鏡デジタルカメラ(オリンパス(株)製品;DP70)を用いて撮影した。その写真を図3及び図4に示す。
図3(拡大率40倍)及び図4(拡大率400倍)に示す写真の青い蛍光部位は蛍光色素「DAPI」で染色された核であり、赤い蛍光部位は蛍光色素「PKH26」で染色された移植細胞(歯肉線維芽細胞)である。また、緑の蛍光部位は、蛍光ラベルされた抗ヒトコラーゲンタイプIモノクローナル抗体である。
これら写真から明らかなように、ヌードマウスに移植した本実施例に係る歯肉線維芽細胞(皮膚組織改善材)は、2ヶ月経過後も移植時と同様に真皮内に留まっていること(即ち生存していること)が確認された(図3)。また、移植した歯肉線維芽細胞の細胞質及びその周囲にヒトタイプIコラーゲンが存在することが認められる。このことは、歯肉線維芽細胞が移植後もタイプIコラーゲンを産生していることを裏付けるものである。
Claims (4)
- ヒト又は他の哺乳動物の口腔内組織由来の線維芽細胞と、薬学的に許容され得る媒質とを含む、皮膚組織改善材であって、
前記線維芽細胞を生体外で増殖させて得た培養細胞を含む懸濁液の形態に調製されるとともに、該懸濁液の上清中のタンパク質1mgあたりの血管内皮細胞増殖因子(VEGF)含有量が少なくとも30pgであり、且つ、該懸濁液の上清中のタンパク質1mgあたりの角化細胞増殖因子(KGF)含有量が少なくとも0.5ngである懸濁液により実質的に構成される、皮膚組織改善材。 - 前記線維芽細胞がヒトの歯肉線維芽細胞及び/又は歯根膜線維芽細胞である、請求項1に記載の皮膚組織改善材。
- 皮膚組織改善材を製造する方法であって:
ヒト又は他の哺乳動物の口腔内組織由来の線維芽細胞を用意すること;
前記線維芽細胞を生体外において培養すること;および
前記線維芽細胞を生体外で増殖させて得た培養細胞を含む懸濁液であって、該懸濁液の上清中のタンパク質1mgあたりの血管内皮細胞増殖因子(VEGF)含有量が少なくとも30pgであり、且つ、該懸濁液の上清中のタンパク質1mgあたりの角化細胞増殖因子(KGF)含有量が少なくとも0.5ngである懸濁液を調製すること;
を包含する、方法。 - 前記用意した線維芽細胞がヒトの歯肉線維芽細胞及び/又は歯根膜線維芽細胞である、請求項3に記載の方法。
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