JPWO2008081818A1 - 皮膚組織改善材およびその製造方法 - Google Patents

皮膚組織改善材およびその製造方法 Download PDF

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Abstract

本発明によって提供される皮膚組織改善材は、ヒト又は他の哺乳動物の歯槽粘膜由来の細胞又は組織片を培養して得られた培養物を主成分として構成される。典型的には、上記培養物に含まれる細胞の５０％以上が線維芽細胞であり、増殖速度が速く、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）及び／又は角化細胞増殖因子（ＫＧＦ）の産生能に優れる。

Description

本発明は、口腔内の特定部位由来の細胞の利用に関し、詳しくは当該細胞を主体とする皮膚組織改善材（皮膚組織改善用組成物）とその製法に関する。また、本発明は口腔内組織由来の細胞を用いた皮膚組織の改善方法に関する。
本国際出願は２００６年１２月２８日に出願された日本国特許出願第２００６−３５４２５９号に基づく優先権を主張しており、その出願の全内容は本明細書中に参照として組み入れられている。
傷病等による皮膚組織の異常や欠損或いは先天的若しくは後天的（加齢性）な皺、陥没等の変形を修復するために、皮膚組織修復材として種々の生体材料が使用されている。
例えば、特許文献１には、患者自身の皮膚組織より単離した真皮線維芽細胞を体外で培養後、その培養物を皮膚組織（患部）に注入する方法が記載されている。また、非特許文献１にはＣ末端及びＮ末端ペプチド部分を除去して抗原性を低下させたウシコラーゲン（アテロコラーゲン）を患部に注入する方法が記載されている。また、非特許文献２にはヒアルロン酸ゲルを患部に注入する方法が記載されている。また、非特許文献３には歯髄線維芽細胞又は歯肉線維芽細胞をポリグリコール酸から成る基材に吸着させて成る移植用構築物が記載されている。
国際公開第ＷＯ９７／０４７２０号 デラストロ(DeLustroF)ら、Ｊ Ｂｉｏｍｅｄ Ｍａｔｅｒ Ｒｅｓ．、１９８６年、第２０巻（１）、ｐ．１０９〜１２０ デュランチ(DurantiF)ら、Ｄｅｒｍａｔｏｌ Ｓｕｒｇ．、１９９８年、第２４巻（１２）、ｐ．１３１７〜１３２５ ブールマ(Buurma B)ら、Ｅｕｒ Ｊ ＯｒａｌＳｃｉ．、１９９９年、第１０７巻、ｐ．２８２〜２８９
しかしながら、上記各論文（非特許文献１〜３）に記載されるような生化学的材料（非生体組織）は、生体内において加水分解され易く、早期に投与部位から消滅するために効果が持続しないという欠点がある。また、この種の材料を使用する場合、免疫学的影響を完全に排除することは困難である。
他方、上記国際公開公報（特許文献１）に記載されるような患者自身の真皮線維芽細胞を体外で培養後に患部（皮下組織）に注入する方法では、免疫学的影響は生じないものの患部に注入された培養細胞は修復すべき皮膚組織（患部）において充填物として機能するにすぎず、患部とその周辺領域の皮膚組織の生理学的状態（皮膚組織の物理的状態及び／又は栄養状態）を積極的に改善するのに十分な機能を有するものではない。
そこで、本発明は、従来の皮膚組織修復材（即ち患部充填材）とは異なる内容の生体適合材料を創出するものであり、その目的は、異常や欠損の生じた皮膚組織（患部）の修復（充填）とともに当該患部及びその周辺の皮膚組織の生理学的状態をより健全なものに改善し得る機能を備えた皮膚組織改善用材料（即ち生きた細胞を含む皮膚組織改善材）を提供することである。また、本発明の他の一つの目的は、そのような皮膚組織改善材を好適に製造し得る方法を提供することである。また、本発明の他の一つの目的は、そのような皮膚組織改善材を利用し即ち患部（皮膚組織）に適用して、当該患部の生理学的状態を改善する方法を提供することである。
本発明によって提供される皮膚組織改善材（即ち皮膚組織改善のための組成物）は、ヒト又は他の哺乳動物の歯槽粘膜由来の細胞又は組織片を培養して得られた培養物（培養細胞を含む。以下同じ。）を主成分とすることを特徴とする。典型的には、本発明によって提供される皮膚組織改善材は、該培養物と薬学的に許容され得る媒質とを含む。
本明細書において「皮膚組織」は、特に言及される場合を除いて広義に解釈されるべき用語であり、表皮、真皮及び皮下組織を包含する用語である。
本明細書において「歯槽粘膜」は、口腔内の特定の部分を指す用語であって歯科学或いは口腔外科学の分野でその意味が普通に把握される用語である。下顎の小臼歯２及び頬周辺の組織を表す図１の（Ａ）及び（Ｂ）によく示されているように、歯槽粘膜１０は、歯肉歯槽粘膜境８から、頬粘膜９や図示しない口腔底に移行する可動性部分の組織であり、歯槽骨に裏打ちされている。また、歯槽粘膜１０から図示しない唇までの間が口腔前庭である。歯槽粘膜１０では歯肉にみられる角化層を欠いている。なお、図中の符号３は歯肉溝であり、４は辺縁歯肉（遊離歯肉）であり、６は付着歯肉（非可動性歯肉）である。これら部位と歯槽粘膜１０とは口腔内において明確に区別され得る。なお、図１の（Ａ）及び（Ｂ）に示される領域に限られず例えば門歯周辺にも同様に歯槽粘膜が存在することは勿論である。
本発明者らは、皮膚組織の改善（修復を包含する。）のための用途に、当該皮膚組織（患部）とは異なる部位である口腔内の歯槽粘膜から採取した細胞（典型的には多数の細胞から成る塊、即ち細胞塊）又は組織片を培養し、その培養物である培養細胞の懸濁液を患部（皮膚組織）に投与したところ、当該皮膚組織においての充填効果のみならず、当該投与部位とその周辺部位の生理学的状態を著しく改善（例えば表皮における細胞分裂の促進やそのことに基づく肌の色つや、はり、きめ等の物理的状態の改善及び／又は皮膚の栄養状態の改善）し得ることを見出し、本発明を完成するに至った。
即ち、ここで開示される皮膚組織改善材では、その主成分たる歯槽粘膜由来の培養物（主として培養細胞）中に皮膚組織改善に関して高い効果を奏し得る細胞種（典型的には歯槽粘膜由来線維芽細胞）が高い割合で含まれ或いは高率に増殖し得る。従って、ここで開示される皮膚組織改善材によると、種々の細胞増殖因子（ＶＥＧＦ、ＫＧＦ等）を患部において継続的に産生（即ち患部に供給）する結果、従来の皮膚組織修復材と同様の皮膚組織（典型的には皮下組織）変形部位若しくは欠損部位における充填効果を奏することに加え、当該部位とその周辺皮膚組織の生理学的状態を改善することができる。
ここで開示される皮膚組織改善材の好ましい一態様は、培養物に含まれる細胞の５０％以上が線維芽細胞であることを特徴とする。歯槽粘膜由来の線維芽細胞は、特に細胞増殖因子群（ＶＥＧＦ、ＫＧＦ等）の産生が活発であり、良好なコラーゲン（例えばI型コラーゲン、III型コラーゲン）産生能を有する。このことにより、皮膚組織修復（充填）効果に加えて高い皮膚組織改善効果を得ることができる。従って、高率に歯槽粘膜由来線維芽細胞を含むことにより、皮膚組織改善効果をより一層高めることができる。
さらに、歯槽粘膜由来線維芽細胞は、他の部位（例えば皮膚の真皮部分）より得られた線維芽細胞と比較して抗加齢に関与していると考えられる抗酸化酵素関連遺伝子（例えばsuperoxide dismutase 2(SOD2)、superoxide dismutase 3(SOD3)、superoxide dismutase 1(SOD1)）の発現効率が高いことが網羅的遺伝子発現解析の結果、明らかとなった。従って、歯槽粘膜由来線維芽細胞を高濃度に含む皮膚組織改善材を患部に適用することにより、当該患部とその周辺皮膚組織に抗加齢効果をもたらすことができる。
また、ここで開示される皮膚組織改善材の好ましい他の一態様は、前記歯槽粘膜由来の細胞又は組織片を生体外で培養して得られた培養細胞を含む懸濁液の形態に調製された皮膚組織改善材である。増殖因子を高濃度に含む細胞懸濁液の投与（患部への注入）により、皮膚組織の迅速な改善を図ることができる。
例えば、該懸濁液の上清中のタンパク質１ｍｇあたりの血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）含有量が少なくとも３０ｐｇである懸濁液により実質的に構成される皮膚組織改善材が特に好ましく、及び／又は、該懸濁液の上清中のタンパク質１ｍｇあたりの角化細胞増殖因子（ＫＧＦ）含有量が少なくとも０．５ｎｇである懸濁液により実質的に構成される皮膚組織改善材が特に好ましい。これら増殖因子を高濃度に含む細胞懸濁液の投与（患部への注入）により、さらに好ましくは上記のとおり抗酸化酵素を高率に産生し得る歯槽粘膜由来線維芽細胞を高濃度に含む細胞懸濁液の投与（患部への注入）により、皮膚組織の迅速な改善を図ることができる。
従って本発明は他の側面として、歯槽粘膜由来の線維芽細胞を（好ましくは細胞懸濁液の形態で）患部に投与することを特徴とする、皮膚組織（患部）にＶＥＧＦ及び／又はＫＧＦを供給する方法を提供する。或いは、歯槽粘膜由来の線維芽細胞を（好ましくは細胞懸濁液の形態で）患部に投与することを特徴とする、皮膚組織（患部）に抗酸化酵素（上記ＳＯＤ群、等）を供給する方法を提供する。さらにまた、歯槽粘膜由来の細胞（典型的には線維芽細胞）を生体外で培養することを特徴とする、ＶＥＧＦ及び／又はＫＧＦの生産方法ならびに抗酸化酵素（上記ＳＯＤ群、等）の生産方法を提供する。
また、本発明は、ここで開示される皮膚組織改善材を製造する好適な方法を提供する。即ち、本発明の製造方法は、ヒト又は他の哺乳動物の歯槽粘膜由来の細胞（典型的には細胞塊）又は組織片を用意すること、該歯槽粘膜由来の細胞又は組織片を培養すること、および、該培養により得た培養物（主として培養細胞）を回収することを包含する。
好ましくは、培養物（培養細胞）は適当な液体媒質中に懸濁される。また、好ましくは、皮膚組織改善材を適用する被験者（患者）に対して免疫原となり得る物質が含まれないように前記培養細胞を含む懸濁液を調製する。また、好ましくは、培養のために用意される上記歯槽粘膜由来の細胞又は組織片は、適用対象たる被験者（患者）自身或いはその者と血縁関係にある者から採取される。
ここで開示される方法によると、調達した口腔内の歯槽粘膜由来の細胞又は組織片を培養することによって目的に適う細胞（典型的には線維芽細胞）を増殖させ、上述した効果を奏する皮膚組織改善材を効率よく製造することができる。
ここで開示される皮膚組織改善材製造方法の好ましい一態様では、培養物に含まれる細胞の５０％以上が線維芽細胞であることを特徴とする培養物を回収する。このような培養物を回収することにより、高率に歯槽粘膜由来線維芽細胞を含む好適な皮膚組織改善材を提供することができる。また、歯槽粘膜由来の線維芽細胞は、生体外培養（インビトロ培養）での増殖速度が比較的（例えば皮膚真皮細胞と比較して）高く、所望する量の線維芽細胞を短期間に効率よく生産することができる。このため、迅速に皮膚組織（患部）の修復処置及び改善処置を行うことができる。
また、ここで開示される皮膚組織改善材製造方法の好ましい一態様は、歯槽粘膜由来の細胞又は組織片を所定の培養容器（例えば細胞培養用ディッシュ、フラスコ類）に配置して培養を開始し、コンフルエント（confluent：典型的には増殖した細胞で培養容器内の生育可能壁面が埋め尽くされた状態）に達した後さらに少なくとも２日間（好ましくは少なくとも４日間）の培養を継続した後に培養物（主として培養細胞）を回収する。
このようにコンフルエント状態に達した後も長期培養を行うことによって、上記のような増殖因子を高濃度に含む好ましい性状の皮膚組織改善材（例えば細胞懸濁液の状態の改善材）を提供することができる。
また、他の側面からみた好ましい一態様は、上記培養物に含まれる細胞全体の血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）の少なくともｍＲＮＡレベルでの発現量が、上記培養を開始した直後の該発現量の少なくとも２倍を越えるまで培養を継続した後に培養物（主として培養細胞）を回収する。或いはまた、上記培養物に含まれる細胞全体の角化細胞増殖因子（ＫＧＦ）の少なくともｍＲＮＡレベルでの発現量が、上記培養を開始した直後の該発現量の少なくとも２倍を越えるまで培養を継続した後に培養物（主として培養細胞）を回収する。
このようにｍＲＮＡレベルでの発現量を指標にして長期培養を行うこと（典型的にはコンフルエント状態に達した後も２日以上の長期培養を行うこと）によって、これら増殖因子を高濃度に含む好ましい性状の皮膚組織改善材（例えば細胞懸濁液の状態の改善材）を提供することができる。
また、本発明は、他の側面として、ここで開示される皮膚組織改善材を患部に注入して当該患部の皮膚組織を修復（又は改善）する方法を提供する。
この方法は、典型的には、ここで開示される何れかの皮膚組織改善材（例えばヒト又は他の哺乳動物の歯槽粘膜由来の線維芽細胞を含む培養物の細胞）を用意すること、及び、該用意した皮膚組織改善材（或いは上記培養細胞）を被験者の患部（皮膚組織、例えば皮下組織）に投与（移植）すること、を包含する。
好ましくは、予め被験者から採取した歯槽粘膜由来の細胞又は組織片を生体外において培養し、得られた培養物（典型的には培養細胞と薬学的に許容され得る媒質（溶媒）を含む細胞懸濁液）を当該被験者の患部（皮膚組織、例えば皮下組織）に投与（注入）する。ここで開示される何れかの方法によって、患部である皮膚組織の迅速な修復及び改善（例えば抗加齢）を実現することができる。
図１は、口腔内における歯槽粘膜の存在部位を模式的に示す図であり、（Ａ）は断面図、（Ｂ）は正面図である。 図２は、一試験例に係る培養開始後７日目の歯槽粘膜由来の培養物（培養細胞及び組織切片）の状態を示す顕微鏡写真である。 図３は、一試験例に係る培養開始後７日目の口蓋由来の培養物（培養細胞及び組織切片）の状態を示す顕微鏡写真である。 図４は、一試験例に係る培養開始後７日目の付着歯肉由来の培養物（培養細胞及び組織切片）の状態を示す顕微鏡写真である。 図５は、一試験例に係る培養開始後７日目の頬粘膜由来の培養物（培養細胞及び組織切片）の状態を示す顕微鏡写真である。 図６は、一試験例に係る各培養物中の線維芽細胞占有率（％）と角化細胞占有率（％）を示すグラフである。 図７は、一試験例に係る各培養物中の線維芽細胞占有率（％）と角化細胞占有率（％）を示すグラフである。 図８は、一試験例に係る各培養物中の細胞数を示すグラフである。 図９は、一試験例に係る各培養物中の血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）の発現量の相対値をｍＲＮＡレベルでの発現量を指標として示すグラフである。 図１０は、一試験例に係る各培養物中の角化細胞増殖因子（ＫＧＦ）の発現量の相対値をｍＲＮＡレベルでの発現量を指標として示すグラフである。
以下、本発明の好適な実施形態を説明する。なお、本明細書において特に言及している事項（例えば、皮膚組織改善材の内容）以外の事柄であって本発明の実施に必要な事柄（例えば細胞培養・精製方法、細胞を含む生物学的薬剤組成物の調製に関するような一般的事項）は、医学、薬学、生化学、有機化学、タンパク質工学、分子生物学、獣医学、衛生学等の分野における従来技術に基づく当業者の設計事項として把握され得る。本発明は、本明細書に開示されている内容と当該分野における技術常識とに基づいて実施することができる。
また、本明細書中で引用されている全ての文献の全ての内容は本明細書中に参照として組み入れられている。
ここで開示される皮膚組織改善材は、ヒトその他の哺乳動物のための皮膚組織改善材（医薬組成物）であり得、ヒトその他の哺乳動物の歯槽粘膜由来の細胞（典型的には歯槽粘膜由来線維芽細胞）を主体として構成される皮膚組織改善材である。
歯槽粘膜由来の培養物（主として培養細胞）であって本発明の目的に適う種々の細胞増殖因子及び／又は抗加齢に関与していると考えられる物質（典型的には抗酸化酵素）を産生し得るものであれば、特に培養物中に存在する細胞の種類や細胞密度を限定するものではないが線維芽細胞の比率が高いものが上記の理由により好ましい。例えば、培養物に含まれる全細胞のうち５０％以上が線維芽細胞であるものが好ましく、７０％以上が線維芽細胞であるものが特に好ましい。歯槽粘膜由来線維芽細胞は生体外（インビトロ）での培養における増殖速度が速く、種々の細胞増殖因子（典型的にはＶＥＧＦ或いはＫＧＦ）を高効率に産生する能力を有する。
通常、免疫学上の問題から、投与対象（被験者）と同種の哺乳類から採取した歯槽粘膜（典型的には細胞塊又は組織片の状態で採取される。）からの培養物（培養細胞）を成分とすることが好ましく、予め投与対象（患者）から採取した歯槽粘膜からの培養物（自己培養細胞）を用いることが特に好ましい。
なお、細胞培養物（培養細胞）を皮膚組織改善材の主体として使用する場合、実際に使用する段階の当該培養細胞が度重なる継代培養によって細胞の外見その他の性状が歯槽粘膜から採取した初代細胞と異なる場合であってもよい。本発明に係る「歯槽粘膜由来の細胞」には、そのような継代培養後の細胞を包含する。
歯槽粘膜の細胞又は組織片の採取方法は、従来のこの種の細胞や組織片の採取方法と同様でよく、特別な処理を必要としない。例えば、種々のバイオプシー（生研）と同様の手法により歯槽粘膜の一部を採取することができる。例えば、パンチバイオプシーやニードルバイオプシーにより、目的とする歯槽粘膜の細胞（細胞塊）や組織片を得ることができる。なお、本発明の実施にあたっては使用する細胞を口腔内の歯槽粘膜から採取すればよいため、採取痕が外部から視認されないことが被験者（又は採取対象者）にとっての一つの利点である。
採取した細胞（細胞塊）又は組織片は、従来この種の細胞の培養法と同様の方法で培養・増殖させ、細胞系（継代培養系：セルライン）を確立することができる。例えば、培地としては、適当な血清材料、抗生物質等を添加した一般的なα−ＭＥＭ培地、イーグル培地、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ培地）等を好適に使用することができる。培養細胞は、適当な培養容器中、３７℃程度（好ましくはＣＯ２インキュベーター内）でコンフルエント状態になるまで培養し、好ましくは更に数日間（典型的には少なくとも２日、好ましくは少なくとも４日、例えば４〜１２日程度、特に好ましくは少なくとも８日、例えば８〜１２日）培養を継続する。このようなコンフルエント到達後の長期継続培養により、細胞増殖因子（典型的にはＶＥＧＦ或いはＫＧＦ）を高効率に産生可能な状態の培養物（培養細胞）を調製することができる。
また、培養は必要に応じて継代を繰り返すことができる。継代数に特に制限はないが、典型的には１０以下（例えば３〜６）である。
上述のようなコンフルエント到達後の好適な培養継続期間は、好ましくはＶＥＧＦ及び／又はＫＧＦの発現量を指標として決定することができる。例えば、培養物（培養細胞）中のｍＲＮＡ発現量を調べることによって、当該培養物を構成する培養細胞（典型的には線維芽細胞）のＶＥＧＦ及び／又はＫＧＦ（或いは他の増殖因子又は成長因子）の発現量を調べ、適当な培養継続期間を決定することができる。或いは、ＳＯＤ群（例えばＳＯＤ１、ＳＯＤ２、ＳＯＤ３）のような抗酸化酵素関連遺伝子の発現量を調べ、適当な培養継続期間を決定することができる。
なお、ｍＲＮＡ発現量の測定法は、従来公知の種々の方法（例えば既知のＲＴ−ＰＣＲ分析（所謂リアルタイムＰＣＲ法、等）やノーザンブロット分析、或いはまた）を利用すればよく、本発明を特徴付けるものでもないため詳細な説明は省略する。
そして、上記のような培養によって所望量の培養細胞が生産された後、培養容器から目的の細胞を含む培養物を回収する。回収方法は、従来の細胞培養と同様でよく、本発明の実施にあたって特別な操作・処理を必要としない。例えば、培養容器（典型的にはディッシュ又はフラスコ）の内壁面に付着した細胞は、適当な酵素（例えばトリプシン）処理を施して遊離させ、培養液と共に回収する。そして、好ましくは、回収した細胞を適当な無血清培地中で１２時間以上、好ましくは２４時間以上培養する。これにより、培地中に含まれる免疫原性物質（典型的には血清成分）を実質的に除去することができる。また、培養した細胞は従来公知の方法で凍結保存することができる。
このように免疫原性物質を実質的に除去した細胞懸濁液（即ち、培養細胞及び適当な無血清培地、緩衝液その他適当な溶媒を主成分とする組成物）は、本発明に係る皮膚組織改善材であり得る。
なお、皮膚組織改善材には、主成分たる細胞培養物、薬学的に許容され得る媒質（典型的には無血清培地等の培地或いは緩衝液等の溶媒）の他に、種々の副成分を含み得る。例えば、(1).抗生物質、(2).各種ビタミン、ブドウ糖その他の栄養成分、(3).酵素類、(4).補酵素類、(5).防腐剤、(6).ＫＧＦ、ＶＥＧＦ等の増殖因子その他サイトカイン類、(7).各種の薬剤（例えば抗炎症剤）、(8).色素、等が好適な副成分として挙げられる。
調製された皮膚組織改善材は、従来の皮膚組織修復材（例えば上記特許文献（国際公開第ＷＯ９７／０４７２０号）又はジャーナル（DeLustro Fらの文献、Duranti Fらの文献）参照）と同様に患部に投与することができる。これら引用文献の全ての内容は本明細書中に参照として組み入れられている。
典型的には、細胞懸濁液の形態の皮膚組織改善材を適当な注射器等を用いて皮下組織に注入することができる。また、懸濁液の形態に限られず、例えば培養細胞から成る集塊物（例えばシート状に細胞が集合して成る集塊物）を皮膚組織改善材として使用してもよい。また、この場合、典型的には細胞培養物とマトリクスとの複合体として投与され得る。マトリクスとしては、種々の好適な生体適合性材料（多糖類、タンパク質その他の高分子有機材料、無機材料等）を利用することができる。ヒト由来（好ましくは被験者自身）の血液、又は種々の内容の血漿材料、例えば多血小板血漿（platelet-rich plasma:ＰＲＰ）は、好適なマトリクスの一典型例である。また、アルギン酸、コラーゲン等から構成される人工マトリクスを採用してもよい。
調製された皮膚組織改善材の投与量及び投与回数（及び投与の間隔）は、症状に応じて異なり得るため特に制限はなく、一般には医師その他の施用者の決定事項であるため本発明を制限する事項ではない。
また、ここで開示される皮膚組織改善材は、口腔内組織、特に歯肉組織の改善にも適用できる。即ち、本発明は、他の側面として、ヒト又は他の哺乳動物の歯槽粘膜由来の細胞又は組織片を培養して得た培養物を主成分とする口腔内組織改善材、特に歯肉組織改善材を提供する。
以下、本発明に関するいくつかの実施例を説明するが、本発明をかかる実施例に示すものに限定することを意図したものではない。
＜試験例１＞
名古屋大学病院・口腔外科において二人の成人被験者（以下、被験者Ａ及び被験者Ｂという。）から歯槽粘膜を採取した。具体的には、直径３ｍｍパンチバイオプシーを用いて歯槽粘膜の一部（組織切片）を任意の２箇所から採取した。組織切片の直径は約３ｍｍ、厚さは約２ｍｍであった。また、比較対象として、同被験者の口蓋部分、付着歯肉部分（図１参照）及び頬粘膜部分からも同様にパンチバイオプシーを用いて同形状の組織切片を採取した。
得られた組織切片を１２％イソジン（登録商標）液に１分間浸漬することにより、滅菌処理を行った。次いで、各組織切片をメスにて４等分し、コラゲナーゼ溶液（和光純薬(株)製品：コラゲナーゼ濃度１０ｍｇ／ｍＬ）に浸漬し、３７℃で１時間のコラゲナーゼ処理を行い、組織分離を図った。
上記処理によりずたずたに分離した組織を培養容器にて培養した（試験数ｎ＝４）。具体的には市販品である培養用６ウェルプレート（培養面積：約９．２ｃｍ２）の各ウェルにピペットを用いて上記コラゲナーゼ処理後の組織懸濁液を注入し、３ｍＬの１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ：Invitrogen社製品No.10099-141）含有ＤＭＥＭ培地（Sigma-Aldrich社製品No.D6429）を加えて３７℃、５％ＣＯ２条件で培養を開始した。
次いで、培養開始から２日、４日、７日、９日、１１日、１４日、１６日及び１８日経過時点で培養上清を適量（約１ｍＬ）採取し、市販の可溶性コラーゲン測定キット「Sircol Collagen Assay Kit」（フナコシ（株）製品）により可溶性コラーゲンの濃度を測定した。なお、培養上清を採取した際には当該採取量に対応する新鮮な上記ＤＭＥＭ培地をウェルに逐次補充した。
また、培養開始から４日、７日及び１６日経過時点で倒立顕微鏡（倍率：１００倍）を用いて各プレート底面における細胞増殖の状態を観察した。
また、培養開始から１４日経過時点で、プレート底面の全培養面積に対して培養細胞が占めている面積割合（全細胞占有率：％）を求めると共に、更に詳細に該プレート底面に分布する培養細胞を外形から判断して線維芽細胞(fibroblast)と角化細胞(keratinocyte)とに区分した。そして、プレート底面の全培養面積を１００％として線維芽細胞占有率（％）と角化細胞占有率（％）とを求めた。
上記培養開始から１６日経過時点で、既にコンフルエントに達していることが確認されたが更に同条件で培養を継続した。そして培養開始から２２日後、組織片がまだ張り付いた状態のウェルの培地（上清）を捨て、ＰＢＳで洗浄後、０．０５％トリプシン−ＥＤＴＡ溶液を加えてウェル底面に張り付いた培養物を当該溶液に浸漬した。そして、３７℃で１０分間静置した。かかるトリプシン処理により培養物（培養細胞）をウェルの壁面から遊離させ、回収した。その後、回収した細胞数を市販の細胞計数分析装置（Scharfe system社製品；ＣＡＳＹ（登録商標））を用いてカウントした。以下、上記各試験の結果を示す。
上記可溶性コラーゲン測定キットにより４種の組織片（歯槽粘膜、口蓋、付着歯肉、頬粘膜）由来の培養細胞それぞれのコラーゲン産生量を調べたところ、採取組織片間でコラーゲン産生量に差は認められなかった。培養開始後２日〜１４日迄の試験サンプルは何れもほぼ１３０〜１５０μｇ／ｍＬの可溶性コラーゲン濃度であり、培養開始後１６日〜１８日迄（即ちコンフルエント到達後）の試験サンプルではほぼ１６０〜１８０μｇ／ｍＬの可溶性コラーゲン濃度であった。
培養開始から４日、７日及び１６日経過時点で倒立顕微鏡（倍率：１００倍）を用いて各プレート底面における細胞増殖の状態を観察したところ、３種の組織片（口蓋、付着歯肉、頬粘膜）由来の培養物と比較して歯槽粘膜由来の培養物では特に線維芽細胞の存在割合が高く、増殖速度も速いことが認められた。図２〜図５は被験者Ａから採取した各組織片の培養７日目の培養物の状態を示す顕微鏡写真（図中のスケールバーは２００μｍ）である。これら顕微鏡写真から明らかなように、図２に示す歯槽粘膜由来の培養物では、組織切片の周囲に線維芽細胞が放射状に増殖している状態が認められた。他方、図３に示す口蓋由来の培養物及び図４に示す付着歯肉由来の培養物では、組織切片の周囲に線維芽細胞が認められるもののその割合は比較的低いことが認められた。また、図５に示す頬粘膜由来の培養物では、組織切片の周囲に表皮細胞（角化細胞）が集合しており、線維芽細胞の存在割合は極めて低いことが認められた。
また、培養開始から１４日経過時点で上記のように求めた線維芽細胞占有率（％）と角化細胞占有率（％）を表すグラフを、被験者Ａから採取したサンプル（組織片）については図６及び被験者Ｂから採取したサンプル（組織片）については図７に示す。これらグラフに示す結果から明らかなように、歯槽粘膜由来の培養物では、細胞の増殖もよく且つ殆どの細胞が線維芽細胞であった。他方、口蓋由来の培養物及び付着歯肉由来の培養物では、線維芽細胞の割合が低く、角化細胞（表皮細胞）の割合も高いことが認められた。また、頬粘膜由来の培養物では、線維芽細胞の存在は極めて低く、増殖した細胞の殆どが角化細胞（表皮細胞）であった。
また、培養開始から２２日後（コンフルエント到達後さらに約６日間培養したもの）に上記トリプシン処理して回収し、上記細胞計数分析装置を用いてカウントした細胞数を図８に示す。このグラフに示す結果から明らかなように、被験者Ａ及びＢの何れから採取した場合でも歯槽粘膜由来の培養物が最も細胞数が多かった。即ち増殖性が良好であった。
以上の結果から明らかなように、口腔内の多様な組織のうち特に歯槽粘膜から採取した細胞塊又は組織片を培養することにより、線維芽細胞の存在割合が高く且つ増殖効率の高い培養物（培養細胞）、換言すれば皮膚組織改善材を得ることができる。
＜試験例２＞
名古屋大学病院・口腔外科において複数の成人被験者（計４名）から歯槽粘膜（計２名）及び耳の後ろの真皮の一部（計２名）を採取した。具体的には、直径３ｍｍパンチバイオプシーを用いて歯槽粘膜の一部（組織切片）又は耳たぶの真皮の一部を任意の２箇所から採取した。得られた組織切片を１２％イソジン（登録商標）液に１分間浸漬することにより、滅菌処理を行った。次いで、各組織切片をメスにて４等分し、コラゲナーゼ溶液（和光純薬(株)製品：コラゲナーゼ濃度１０ｍｇ／ｍＬ）に浸漬し、３７℃で１時間のコラゲナーゼ処理を行い、組織分離を図った。
上記処理によりずたずたに分離した組織を培養容器にて培養した。具体的には、それぞれのサンプルについて市販品である培養用６ウェルプレート（培養面積：約９．２ｃｍ２）の複数ウェルにピペットを用いて上記コラゲナーゼ処理後の組織懸濁液を分注し、３ｍＬのＤＭＥＭ培地（１０％ＦＢＳを含む。）を加えて３７℃、５％ＣＯ２条件で培養を開始した。なお、培養開始から１６日経過時点でほぼコンフルエントに達したが更に同条件で培養を継続した。
培養開始から４日目、８日目、１２日目、１６日目、２０日目及び２４日目に、幾つかのウェルの培養物（培養細胞）を上記トリプシン処理することによって回収した。次に得られた培養物から常法に基づいて全ＲＮＡを抽出した。
このようにして、上記培養期間のそれぞれについて歯槽粘膜由来の培養細胞からのトータルＲＮＡサンプル（以下「歯槽粘膜由来ＲＮＡサンプル」と略称する。）並びに耳たぶ真皮組織由来の培養細胞からのトータルＲＮＡサンプル（以下「真皮組織由来ＲＮＡサンプル」と略称する。）を得た。
次いで、得られたＲＮＡサンプルを材料に、一般的なリアルタイムＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）法を採用し、ｍＲＮＡ発現量を指標にしてＶＥＧＦ及びＫＧＦの発現量を相対定量法により調べた。具体的には各ＲＮＡサンプルから逆転写酵素を用いてｃＤＮＡを作製し、該ｃＤＮＡ試料を鋳型としてリアルタイムＰＣＲ法をメーカー（タカラバイオ株式会社）提供のガイドブックに準拠して実行した。この際、リファレンス遺伝子（ハウスキーピング遺伝子）としてＧＡＰＤＨ（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase）を採用した。なお、ＶＥＧＦ用プライマー及びＫＧＦ用プライマーは、Affymetrix社GeneChip（登録商標）専用のリアルタイムＰＣＲプライマーセット（商品）をタカラバイオ(株)から購入した。製品情報は以下の通りである。
（１）ＶＥＧＦ：GenBank Acc：NM 001025366、Gene ID：HA074937、
Description：Homo sapiens vascular endothelial growth factor(VEGF)、
transcript variant 1, mRNA
（２）ＫＧＦ：GenBank Acc：NM 002009、Gene ID：HA035992、
Description：Homo sapiens fibroblast growth factor 7、
(keratinocyte growth factor)(KGF7), mRNA
而して、上記リアルタイムＰＣＲ法によって得られた結果を図９（ＶＥＧＦ）及び図１０（ＫＧＦ）に示す。これらグラフでは、ＶＥＧＦ及びＫＧＦのいずれも、一人の被験者の培養開始４日目の培養物から得た真皮組織由来ＲＮＡサンプルから求めたＶＥＧＦｍＲＮＡ発現レベルまたはＫＧＦｍＲＮＡ発現レベルを基準値（１）とし、発現レベルの相対値（単位なし）として示している。
これらグラフから明らかなように、真皮組織由来ＲＮＡサンプルよりも歯槽粘膜由来ＲＮＡサンプルのほうが全体的にＶＥＧＦ発現量及びＫＧＦ発現量が高いことが認められた。特にコンフルエントに到達した後の継続培養によって、歯槽粘膜由来培養物ではＶＥＧＦ発現量及びＫＧＦ発現量が飛躍的に上昇することが確認され、培養開始直後（例えば培養開始４日目まで）の該発現量の２倍以上、良好なものでは４倍以上の発現（ｍＲＮＡレベル）が培養開始２０日目以降のものに認められた。従って、本試験例からは、コンフルエントに達した後もさらに培養を継続した後（好ましくは少なくとも４日間の継続後）に培養物を回収することが皮膚組織改善材の製造に好適であることが確認された。
＜試験例３＞
上記被験者Ａから歯槽粘膜を試験例１と同様にして採取した。得られた組織片に３７℃、１時間のコラゲナーゼ処理（和光純薬(株)製品：濃度１０ｍｇ／ｍＬ）を施した。かかる処理後の組織片を直径３．５ｃｍのＤＭＥＭ培地を含む培養用ディッシュに移植し、３７℃、５％ＣＯ２条件下で培養した。次いで、１０％のＦＢＳ及び１％の抗生物質−抗真菌剤（Invitrogen社製品No.15240-062）を含むＤＭＥＭ培地を含むＴ７５フラスコを用意し、該フラスコ中に上記歯槽粘膜組織片由来培養物を入れ、３７℃、５％ＣＯ２条件下で７日間培養した。その後、市販の細胞解離剤（Invitrogen社製品；TrypLE Select（商品名））で処理して培養フラスコに付着した培養細胞（主として線維芽細胞）を遊離・回収した。回収した細胞数は、上記細胞計数分析装置を用いて計測した。
そして、約２×１０７個の同細胞を市販の蛍光染色キット（Sigma-Aldrich 社製品；PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Mini Kit）を用いて染色（蛍光ラベル）した。而して、当該蛍光ラベルされた細胞をＰＢＳを用いて懸濁し、本試験例に係る細胞懸濁液（即ち皮膚組織改善材）を得た。さらに細胞濃度を約１×１０７細胞／ｍＬに調整後、ヌードマウス背部の真皮内に注入した。
２ヵ月後、注入部組織を採取し、固定液として４％パラホルムアルデヒド液（Sigma-Aldrich 社製品）を使用して組織を固定した。次いで、「Tissue-Tek O.C.T. Compound (Sakura Finetechnical社製品）」に包埋し、約６μｍの切片を作製した。
そして、この切片と抗ヒトコラーゲンタイプＩモノクローナル抗体(Chemicon社製品）を使用し、免疫蛍光抗体法によって免疫染色を行った。その後、市販の免疫組織染色用封入剤「Vectashield（登録商標）Mounting Medium for Fluorescence with DAPI(Vector Laboratories社製品)」を用いて標本を作製し、顕微鏡にて観察した。
その結果、ヌードマウスに移植した細胞（皮膚組織改善材）は、２ヵ月経過後も移植時と同様に真皮内に留まっていること（即ち生存していること）が確認された。また、移植した細胞質及びその周囲にヒトタイプＩコラーゲンが存在していた。このことは、歯槽粘膜由来の細胞（主として線維芽細胞）が移植後もタイプＩコラーゲンを産生していることを裏付けるものである。
＜試験例４＞
試験例３と同様に歯槽粘膜を採取し、消毒後、細切、表皮の剥離を経て試験例３と同様に細胞培養を開始した。その後、培養を約１ヵ月間継続して行った。そして、目的の細胞数以上に達したものを上記トリプシン処理を行って回収した。次いで生理食塩水により２度洗浄後、新しい生理食塩水に懸濁することによって本試験例に係る細胞懸濁液（皮膚組織改善材）を調製した。
そして、１ｍＬシリンジと３０Ｇニードルを用いてこの培養細胞懸濁液（皮膚組織改善材）約６００〜２０００μＬを、被験者の患部（前額部の皺部分、下瞼下部の皺部分）の皮下に注入した。その後の経過観察により、患部（注入部位）表面の皮膚において時間の経過とともに皺の改善（例えば筋状凹みの縮小、つやの向上）が進んでいることが認められた。
ここで開示される皮膚組織改善材は、皮膚組織の修復及び生理学的状態の改善を行うことができる。このため、皮膚外科（形成外科、美容外科を含む）的治療に利用する材料として有用である。

Claims (8)

  1. ヒト又は他の哺乳動物の歯槽粘膜由来の細胞又は組織片を培養して得られた培養物を主成分とする、皮膚組織改善材。
  2. 前記培養物に含まれる細胞の５０％以上が線維芽細胞である、請求項１に記載の皮膚組織改善材。
  3. 前記歯槽粘膜由来の細胞又は組織片を生体外で培養して得られた培養細胞を含む懸濁液の形態に調製された、請求項２に記載の皮膚組織改善材。
  4. 皮膚組織改善材を製造する方法であって：
    ヒト又は他の哺乳動物の歯槽粘膜由来の細胞又は組織片を用意すること；
    前記歯槽粘膜由来の細胞又は組織片を培養すること；および
    前記培養により得た培養物を回収すること；
    を包含する、方法。
  5. 前記培養物に含まれる細胞の５０％以上が線維芽細胞であることを特徴とする培養物を回収する、請求項４に記載の方法。
  6. 前記歯槽粘膜由来の細胞又は組織片を所定の培養容器に配置して培養を開始し、コンフルエントに達した後さらに少なくとも２日間の培養を継続した後に培養物を回収することを特徴とする、請求項５に記載の方法。
  7. 前記細胞培養物に含まれる細胞全体の血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）の少なくともｍＲＮＡレベルでの発現量が、前記培養を開始した直後の該発現量の少なくとも２倍を越えるまで培養を継続した後に培養物を回収することを特徴とする、請求項６に記載の方法。
  8. 前記細胞培養物に含まれる細胞全体の角化細胞増殖因子（ＫＧＦ）の少なくともｍＲＮＡレベルでの発現量が、前記培養を開始した直後の該発現量の少なくとも２倍を越えるまで培養を継続した後に培養物を回収することを特徴とする、請求項６又は７に記載の方法。
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