CN111849871A - 一种获取表皮细胞悬液的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种获取表皮细胞悬液的方法，本发明通过糜蛋白酶消化液制备表皮细胞悬液，制备得到的表皮细胞悬液中含有的表皮细胞数量多，且活性强；因此，在进行创面修复手术的过程中，通过本发明中所述方法获取的表皮细胞悬液能满足用于创面治疗的移植要求。
Description
技术领域
本发明属于生物医学技术领域，具体涉及一种获取表皮细胞悬液的方法。
背景技术
创面是机体由于内在或外在的因素导致皮肤完整性丧失所形成的，其修复一直以来是临床中的急需解决的问题。
现有研究表明在创面上喷洒表皮细胞悬液(主要含有表皮细胞、成纤维细胞、黑色素细胞、表皮干细胞等)能提高创面愈合率，改善远期皮肤愈合质量，甚至能修复部分皮肤附属器官，如汗腺等。但目前获取细胞悬液的方法主要为胰蛋白酶消化法，但是胰蛋白酶对皮片的消化分离能力不高，采用此法获得的细胞悬液中的表皮细胞数量低，活性不高。
发明内容
为解决上述问题，本发明提出了一种获取表皮细胞悬液的方法。
为实现上述目的，本发明采用下述技术方案。
一种获取表皮细胞悬液的方法，包括如下步骤：
(1)采用糜蛋白酶消化液消化皮片；
(2)对完成消化的皮片进行搔刮，将表皮细胞和基底层细胞从真皮上刮取下来；
(3)对刮取下来的表皮细胞进行稀释；
(4)对稀释后的表皮细胞进行过滤，即获得表皮细胞悬液。
与现有技术相比，本发明中所述一种获取表皮细胞悬液的方法的有益效果为：本发明通过糜蛋白酶消化液制备表皮细胞悬液，制备得到的表皮细胞悬液中含有的表皮细胞数量多，且活性强；因此，在进行创面修复手术的过程中，通过本发明中所述方法获取的表皮细胞悬液能满足用于创面治疗的移植要求。
糜蛋白酶是从牛胰腺或猪胰腺中分离提纯得到的一种蛋白酶，是一种蛋白水解酶，有分解肽键的作用；目前，糜蛋白酶主要用于创伤或手术后伤口愈合、抗炎及放置局部水肿、积血、扭伤血肿、乳房手术后浮肿、中耳炎、鼻炎等；并且糜蛋白酶可使粘稠的痰液稀化，便于咳出，对脓性和非脓性痰液均有效。在研究表皮细胞悬液的过程中，本发明的发明人意外发现，将传统所用的胰蛋白酶消化液替换为糜蛋白消化液，其获取的表皮细胞悬液中的表皮细胞的数量更多，且活性更好；并且糜蛋白酶的毒性小于胰蛋白酶，其不良反应也比胰蛋白酶小，且无潜在的安全风险，安全可靠。
进一步地，所述步骤(1)中所用糜蛋白酶消化液是糜蛋白酶冻干粉与生理盐水配制而成。
进一步地，4000单位的糜蛋白冻干粉对应加入1.5～2.5ml的生理盐水。
进一步地，所述步骤(1)中，所述糜蛋白酶消化液消化皮片的消化时间为10～30min，消化时间过短，则皮片不能充分消化，从而导致皮片上的表皮层与真皮层难以分离，进而导致下一步中对皮片的搔刮处理难以进行；糜蛋白酶消化液对于皮片的消化效果，并不是消化时间越长就越好，其消化时长到底一定限度后，其对皮片的消化效果就不会再增大，并且皮片在糜蛋白酶消化液中浸泡时间过久，还会影响后续获得的表皮细胞的活性，因此，本发明中将消化皮片的消化时间设定为10～30min，这样就能在缩短效果时间的同时保证了对于皮片的消化效果。
进一步地，所述步骤(1)中，所述糜蛋白酶消化液消化皮片在温度为36.0～37.5℃下进行的；糜蛋白酶是一种蛋白酶，而酶只有在最适温度范围内，其活性最强，随着温度的降低，活性也下降，到一定范围内酶的催化效率为零，但是此时酶的活性受到抑制；温度恢复到适时，酶的活性逐步增加直至最大；高于最适温度时，随着温度的上升，酶的活性迅速下降，到一定限度时会因为高温其空间结构发生改变而失活；变性失活的酶，即使再恢复到最适温度，酶的活性也不能恢复；而糜蛋白酶是从牛或猪的器官上提取的，猪和牛的正常体温为38～39.5℃，并且需要用糜蛋白酶来消化皮片，并要保证皮片上表皮细胞的活性，因此将糜蛋白酶的工作温度设定为36.0～37.5℃，可以保证糜蛋白酶的消化速度，也能保证皮片上表皮细胞的活性。
进一步地，所述步骤(3)中采用林格式液对刮取下来的表皮细胞进行稀释。
进一步地，所述林格式液的用量为10～20ml。
进一步地，所述步骤(4)中，采用孔径为100μm的滤网稀释后的表皮细胞进行过滤；这样可以对表皮细胞进行富集以进一步提高细胞悬液中表皮细胞的浓度。
具体实施方式
以下是对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。
对厚度为0.2mm，大小为1cm2的皮片进行获取表皮细胞悬液的操作，其具体操作为：
(1)采用糜蛋白酶消化液消化皮片，其中需要将糜蛋白酶消化液预热到37℃，然后再将皮片放入所述糜蛋白酶消化液中，并且在温度需要一直保持在37℃，皮片需要在所述糜蛋白酶消化液中消化15min；
其中，所述糜蛋白酶对皮片的消化时间过短，则皮片不能充分消化，从而导致皮片上的表皮层与真皮层难以分离，进而导致下一步中对皮片的搔刮处理难以进行；糜蛋白酶消化液对于皮片的消化效果，并不是消化时间越长就越好，其消化时长到底一定限度后，其对皮片的消化效果就不会再增大，并且皮片在糜蛋白酶消化液中浸泡时间过久，还会影响后续获得的表皮细胞的活性，因此，本实施例中根据皮片的大小将消化皮片的消化时间设定为15min，这样就能在缩短效果时间的同时保证了对于皮片的消化效果。
其中，本实施例中所用糜蛋白酶消化液是采用5支4000单位的糜蛋白酶冻干粉及10ml生理盐水配制而成。
(2)对完成消化的皮片进行搔刮，将表皮细胞和基底层细胞从真皮上刮取下来：皮片经过消化处理后，其白色真皮层已经完全暴露，此时，用血管钳或手术镊固定完成消化后的皮片，然后用手术刀对其进行轻轻搔刮，将表皮细胞和基底层细胞从真皮上完全刮取下来；
(3)对刮取下来的表皮细胞进行稀释：用5ml注射器配置平嘴针头，吸取林格式液稀释刮取下的表皮细胞，其中，所用林格式液的用量为10ml；
(4)对稀释后的表皮细胞进行过滤，即获得表皮细胞悬液；
其中，采用孔径为100μm的滤网稀释后的表皮细胞进行过滤；这样可以对表皮细胞进行富集以进一步提高细胞悬液中表皮细胞的浓度。
需要注意的是，上述所述步骤均需要在无菌环境下进行操作。
对通过上述制备步骤制备的表皮细胞悬液进行检测，测得制得的表皮细胞悬液中的表皮细胞数量为1.5×105个，且表皮细胞活性达93％。
因此，本实施例通过糜蛋白酶消化液制备的表皮细胞悬液中含有的表皮细胞数量多，且活性强；在进行创面修复手术的过程中，通过本发明中所述方法获取的表皮细胞悬液能满足用于创面治疗的移植要求。
糜蛋白酶是从牛胰腺或猪胰腺中分离提纯得到的一种蛋白酶，是一种蛋白水解酶，有分解肽键的作用；目前，糜蛋白酶主要用于创伤或手术后伤口愈合、抗炎及放置局部水肿、积血、扭伤血肿、乳房手术后浮肿、中耳炎、鼻炎等；并且糜蛋白酶可使粘稠的痰液稀化，便于咳出，对脓性和非脓性痰液均有效。在研究表皮细胞悬液的过程中，本发明的发明人意外发现，将传统所用的胰蛋白酶消化液替换为糜蛋白消化液，其获取的表皮细胞悬液中的表皮细胞的数量更多，且活性更好；并且糜蛋白酶的毒性小于胰蛋白酶，其不良反应也比胰蛋白酶小，且无潜在的安全风险，安全可靠。
在本实施例中，所述步骤(1)中，所述糜蛋白酶消化液消化皮片在温度为37℃下进行的，其主要原因为：糜蛋白酶是一种蛋白酶，而酶只有在最适温度范围内，其活性最强，随着温度的降低，活性也下降，到一定范围内酶的催化效率为零，但是此时酶的活性受到抑制；温度恢复到适时，酶的活性逐步增加直至最大；高于最适温度时，随着温度的上升，酶的活性迅速下降，到一定限度时会因为高温其空间结构发生改变而失活；变性失活的酶，即使再恢复到最适温度，酶的活性也不能恢复；而糜蛋白酶是从牛或猪的器官上提取的，猪和牛的正常体温为38～39.5℃，并且需要用糜蛋白酶来消化皮片，并要保证皮片上表皮细胞的活性，因此将糜蛋白酶的工作温度设定为36.0～37.5℃，可以保证糜蛋白酶的消化速度，也能保证皮片上表皮细胞的活性。
在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
如果本文中使用了“第一”、“第二”等词语来限定零部件的话，本领域技术人员应该知晓：“第一”、“第二”的使用仅仅是为了便于描述本发明和简化描述，如没有另外声明，上述词语并没有特殊的含义。
应当理解的是，以上仅为本发明的优选实施例，不能因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。
Claims (8)
1.一种获取表皮细胞悬液的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)采用糜蛋白酶消化液消化皮片；
(2)对完成消化的皮片进行搔刮，将表皮细胞和基底层细胞从真皮上刮取下来；
(3)对刮取下来的表皮细胞进行稀释；
(4)对稀释后的表皮细胞进行过滤，即获得表皮细胞悬液。
2.根据权利要求1所述的一种获取表皮细胞悬液的方法，其特征在于，所述步骤(1)中所用糜蛋白酶消化液是糜蛋白酶冻干粉与生理盐水配制而成。
3.根据权利要求2所述的一种获取表皮细胞悬液的方法，其特征在于，4000单位的糜蛋白冻干粉对应加入1.5～2.5ml的生理盐水。
4.根据权利要求1所述的一种获取表皮细胞悬液的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，所述糜蛋白酶消化液消化皮片的消化时间为10～30min。
5.根据权利要求1所述的一种获取表皮细胞悬液的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，所述糜蛋白酶消化液消化皮片在温度为36.0～37.5℃下进行的。
6.根据权利要求1所述的一种获取表皮细胞悬液的方法，其特征在于，所述步骤(3)中采用林格式液对刮取下来的表皮细胞进行稀释。
7.根据权利要求6所述的一种获取表皮细胞悬液的方法，其特征在于，所述林格式液的用量为10～20ml。
8.根据权利要求1所述的一种获取表皮细胞悬液的方法，其特征在于，所述步骤(4)中，采用孔径为100μm的滤网稀释后的表皮细胞进行过滤。
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